토양에서 분리한 호알카리성 Bacillus sp. YC-335가 생산하는 CGTase를 ethanol 침전법, DEAE-Toyopearl column chromatography, Sephadex G-100 column chromatography 방법 등에 의해 대량 정제 하였다. 이때 수율은 17.8 이었고 52.9배의 정제도를 가진 효소단백질을 얻을 수 있었다. 정제효소는 SDS-polyacrylamide gel 전지영동에 의해 분자량이 75,000 정도인 단일 peptide의 단백질임을 확인하였고 효소의 최적활성 pH는 6.0 있었으며 pH 안정성은 pH 6-10까지 안정하였다. 최적활성온도는 5$0^{\circ}C$이었으며 열안정성은 5$0^{\circ}C$까지 안정하였고 이는 15mM CaCl$_2$에 의해 열안정성이 보호되었다.
퇴비화 촉진 미생물인 Bacillus subtilis LYH201균주가 분비하는 섬유소 분해효소를 분자생물학적으로 연구한 결과는 다음과 같다. 섬유소를 분해하는 유전자는 유전자은행에 의해 구한 약 5,000개의 clone 중 CMC 배지 상에서 활성을 가지는 clone을 선발하여 bglC(pLYH7-39)로 명명하였다. 섬유소를 분해하는 bglC 유전자는 Pvu II, EcoRI, SspI의 제한효소 site를 가지고 있었으며, BglC는 Clostridium acetobutylicum GUN_CLOAB(P15704)와 57%의 identity와 71%의 homology를 나타내어 상동성이 가장 높았으며, CMC-SDS-PAGE 분석으로 56 kDa의 분자량을 나타냈고, 온도는 $50^{\circ}C$, pH는 7에서 활성이 가장 높았다.
Seok-Yong Kim;Seok-Jong Suh;Seon-Hwa Ha;Seon-Kap Hwang;Joo-Hyun Nam;Dong-Sun Lee;Soon-Duck Hong;Jong-Guk Kim
생명과학회지
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제8권5호
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pp.614-621
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1998
열안정성 inulinase를 분비하는 Penicillium sp.를 돼지 감자 서식지의 토양으로부터 분리하여 이 균주의 inulinase를 50%-80% 염석, DEAE-Sephacel column chromatography, Toyopearl HW 65 F column chromatography에 의해 정제하여 inulinase 활성을 가진 단일 band를 얻었다. 이 band의 단백질을 polya-cryamide gel electrophoresis 후 추출하여 inulinase 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이 단백질의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 약 77,000 dalton으로 추정되었고, 최종 정제도는 53.3배이었다. 정제된 효소의 효소학적 성질을 조사한 결과, 최적온도는 약 6$0^{\circ}C$이었고, 열 안정성은 30-5$0^{\circ}C$에서 비교적 안정하였다. pH 4에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH 4-5에서는 비교적 안정했고 염기성에서는 아주 낮은 활성을 나타내었다. 금속이온과 다른 화학물질의 영향을 조사한 결과 1mM의 $MnCl_2$와 $CaCl_2$에 의해 활성이 증가했으며 특히, $MnCl_2$는 1.7배까지 활성을 증가시켰다. 그러나, 1mM의 $CuCl_2$,$HgCl_2$와 1mM EDTA 시에는 활성이 저해되었다. TLC분석결과 모든 산물이 monosaccharide였으므로 이 효소는 exo-acting inu-linase로 추정되었고, inulin에 대한 이 효소의 $K_M$치는 $2.2\times10^{-3}$이었다. 이 효소의 결정된 N-terminal 아미노산 배열은 $NH_2$-X-Glu-Tyr-Thr-Glu-Lys/Leu-Tyr-Arg-Pro이다.
폐단백질을 활용하는 방도의 하나로 폐단백질 자원으로 부터 불용성 단백질의 분리 효율성을 높이고 기능성을 개선하기 위하여 protease를 생산하는 Aspergillus sp. MS-18 균주를 토양으로 부터 분리하고 이 균주가 생산하는 효소를 정제하여 특성을 살펴보았다. 효소 생산을 위한 최적 배양조건은 3% arabinose, 0.5% polypepton, 0.1% ammonium sulfate, 0.1% magnesium chloride 첨가로 3 일 배양이었다. 효소는 ion exchange chromatography, gel filtration 등으로 16.9 배 정제할 수 있었으며 비활성역가는 340.4 unit/mg이었다. 정제효소는 polyacryl amide gel 전기영동상 단일 밴드로 나타났으며, 분자량은 30,000 정도로 추정되었고 결정구조는 모서리가 둥그스럼한 막대 모양이었다. 정제 효소의 최적작용 pH와 온도는 9.0, $60^{\circ}C$였으며, pH 7.0-12.0까지 $50^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온중 $Na^+$, $Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$등에 의해 활성이 증대 되었으나, $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Pb^{2+}$에 의해 효소 활성이 저해되었고 저해제중 ethylenediaminetetra acetic acid와 phenyl methanesulfonyl fluoride에 의한 활성 저해가 관찰되어 금속 이온이 효소 활성에 관여하는 serine protease로 추정되었으며 정제효소의 Km, Vmax는 $29.33\;{\mu}mole/L$, $5.13\;{\mu}g/min$이었다.
알긴산분해효소(EC 4. 2. 2. 3)를 균체외로 생산하는 새로운 방선균을 전라남도 완도의 연안토양으로부터 분리하고 이 균주를 Streptomyces sp. MET 0515라 명명하였다. 이 균주가 생산하는 균체외 알긴산분해효소를 아세톤 침전, 음이온 교환 크로마토그래피(Q-Sepharose and DEAE-Sepharose), 젤 크로마토그래피(Sephacryl S-200 HR gel filtration chromatography)를 이용하여 정제하였다. 이 효소의 최적 활성 온도과 pH는 각각 $70^{\circ}C$와 pH 7.5이고, 온도 안정성은 $0-50^{\circ}C$, pH 안정성은 pH 6.0-9.0였다. 이 효소는 $Mn^{2+}$ 이온 첨가시에는 활성이 증가하였으며 1mM $Fe^{3+}$, 1mM EDTA, 1mM $Zn^{2+}$ 이온 첨가시에는 활성이 억제되었다. 또한 이 효소는 poly-alpha 1,4-L-guluronate와 poly-beta 1,4-D-mannuronate두 종류의 기질에 대하여 활성을 나타냈다. 따라서 본 효소는 다른 미생물 기원의 효소와 비교해 볼 때 Streptomyces sp.가 생산하는 첫번째 효소로 인정되었다.
키토산으로부터 키토산 올리고당을 생산하기 위한 유용 효소원을 개발하기 위해서 토양에서 4종의 미생물을 분리하였으며, 가장 높은 활성의 chitosanase를 생산하는 Bacillus sp. HSB-21 균주를 선정하였다. 분리균주로부터 생산된 chitosanase는 endo-type의 효소로 분자량이 약 21,000이었다. 최적 pH와 온도는 각각 5.5, $50^{\circ}C$이었으며, pH $3{\sim}8$ 범위와 $40^{\circ}C$까지 비교적 안정한 효소로 나타났다. 본 효소는 키토산을 분해하여 단당을 형성하지 않았으며 주로 $2{\sim}8$당을 포함하는 키토산 올리고당을 만들었다. 그러므로 본 효소는 고중합도 키토산 올리고당의 생산을 위한 응용 가능성이 큰 것으로 판단된다.
경기도 일대의 가금류 공장부근 토양로부터 keratinolytic protease 생산성이 우수한 균주 KP-364를 선별하여 본 효소를 정제하고 일반적인 특성을 조사하였다. 본 효소는 ulkafiltration, ammonium sulfate fiactionation, DEAE-cellulose ion-exchange chromatography, Sephadex G-150 gel filtration 등을 통하여 정제되었으며 회수율은 25.2%이었다 SDS-PAGE와 gel filtration으로. 단일성과 분자량을 추정한 결과 전기영동 상에 단일 band를 나타내었으며 분자량은 약 36,000 dalton이였으며 1개의 subunit로_구성되어 있었다. 효소반응의 최적조건을 검토한 결과 최적 pH는 6.5, pH 3.0에서 10.0까지 90%이상의 활성을 나타냈으며 반응 최적 온도는 $37^{\circ}C$이였고 $60^{\circ}C$에서 1시간동안 80%이상의 활성을 유지하였다. 정제된 효소의 활성은$ FeSo_4$, KCI, $Li_2$$SO_4$를 첨가하였을 때 증가하였으며 $Ag_2$$SO_4$, $CuCl_2$, $HgCl_2$에 의해 저해되었다. 또한 EDTA, EGTA에 의해 저해되는 것으로 보아 metalloprotease의 일종이라고 판단되며 $Li^{ +}$를 cofactor로 함유하고 있는 것으로 조사되었다.
토양으로부터 강력한 CAH activity를 갖는 균주를 분리하여, 생화학적, 배양학적, 전자현미경 동정을 한 결과, Bacillus sphaericus로 확인되었으며, 이를 B. sphaericus 366M-9로 명명하였다. 또한 이 균으로부터 최초로 cephalosporin-C deacetylase(CAH)를 분리 정제하였다. 정제수율은 약 7.5% 였으며, B. sphaericus 366M-9에서 분리한 CAH-9의 최적활성 온도는 $50^{\circ}C$였으며, 효소안정 온도구간은 30~$50^{\circ}C$이다. 또한 최적 활성 pH는 7.0이었으며, 효소안정 pH구간은 pH 6.0~8.0으로 90% 이상의 잔존 활성도를 나타내었다. 효소반응속도에 미치는 기질의 영향에서는 $K_{m}$ 값은 0.87 mM 이며,$ V_{max}$는1.22 unit/ml이었다.다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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