황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하며 학명에서 뜻하는 바와 같이 목본 (Dendro), 전능약(Panax)이라는 의미가 있고 나무인삼이라 불리기도 하며 줄기에 상처를 내면 노란액이 나온다고 해서 황칠나무(D. morbifera)라는 이름이 붙여졌다. 두릅나무과는 우리나라에서 최고의 약재들로 손꼽히는 인삼(Panax ginseng), 가시오갈피(Eleutherococcus senticosus) 등의 약용식물을 포함하고 있어서 황칠나무는 황칠수지액 이외에 약용식물로서의 무한한 개발 가능성을 내포하고 있다. 따라서 본 실험은 황칠나무의 기내 부정근 유도 및 증식조건의 확립을 목적으로 수행되었다. 우선 황칠나무의 기내 발아체로부터 부위(잎, 줄기, 뿌리)를 달리하여 부정근을 유도한 결과, 잎은 줄기나 뿌리보다 양호한 부정근의 유도를 보였다. 또한 유도된 부정근을 이용하여 옥신의 종류에 따른 부정근 유도율을 조사한 결과 IBA와 NAA는 IAA와 2.4-D보다 높은 유도율을 보였다. IBA의 농도에 따른 유도율과 증식효율은 IBA가 1.0 mg/L 첨가되었을 때 가장 높은 유도 및 증식효율을 보였다. 최적의 액체배지조건을 확인하고자 sucrose의 농도와 염농도를 달리하여 실험한 결과 1/2MS 배지는 MS 배지보다 10%정도 높은 증식율을 보였다. 액체배양 된 황칠나무의 부정근을 각각 1/2MS 배지에 30 g/L sucrose, 3.0 mg/L IBA가 첨가된 5 L volume 생물반응기에 4주 간 배양한 대조구와 2주 후 IBA의 농도를 1.0으로 낮추어 배양한 실험구에서 2주후 IBA의 농도를 낮추어 배양한 실험구에서 대조구보다 약 2배 높은 부정근의 증식량을 보였다. 결국, 황칠나무의 종자발아체를 이용하여 부정근의 유도 및 증식조건에 필요한 기내배양조건을 확립하였고, 플라스크와 생물반응기 배양을 통해 효율적인 실험실 내 증식조건을 확립하였다. 본 실험결과는 향후 황칠나무 천연추출물을 활용한 향장품/식,의약품 소재의 대량확보 차원에서 중요한 가치를 내포하고 있다고 조심스럽게 사료된다.
본 연구에서는 효율적으로 팽나무버섯 액체종균을 생산할 때에 폭기(공기방울을 매우 작게하여) 배양의 효과에 대하여 액체 배지 내 이산화탄소 농도와 잔류 유리당 함량 변화로써 측정하였다. 이산화탄소 농도는 폭기 진행 중 배양용기의 배출구에서 측정하였다. 액체종균은 폭기 배양 3일째에 균사생장이 급격히 증가하였으며, 이산화탄소 농도($CO_2$)도 급증하였으나 폭기 5일째에는 정점을 나타낸 후 감소하였다. 액체배지 내 환원당은 배양 7일째까지 일정 속도로 감소되었고 이후에는 검출되지 않았고, 침전 균사체의 중량은 3일째 이후 비슷한 수준으로 유지되었다. 총질소(T-N)량은 폭기 11일째까지 일정한 수준으로 감소되었다. 유리당의 함량은 폭기 배양 7일째에 가장 낮았으므로 폭기 배양 6~7일째에 접종원으로 사용하는 것이 가장 효과적인 것으로 생각되었다. 그리고 액체종균의 배양 중에 배출구에서의 이산화탄소 농도 측정은 저비용으로 액체종균의 균사배양 정도를 추정하는 간이 지표로 이용할 수 있을 것으로 판단되었다.
본 연구에서는 객담 내 결핵균의 배양시험과 약제 감수성 시험 방법으로서 BacT/Alert 액체 배지, Ogawa 배지 및 $L\ddot{o}wenstein$-Jensen 배지 배양법을 비교하였다. 신속 액체배양시스템은 기존의 Egg-based media (Ogawa, $L\ddot{o}wenstein$-Jensen 배지)에 비해 높은 민감도와 빠른 배양으로 결핵환자의 초기 객담 검사와 약제 감수성 시험에 널리 사용되어 왔다. 객담은 N-Acetyl-L-cystine과 4% NaOH로 처리한 후 BacT/Alert 액체 배지 시스템과 Ogawa 배지에 접종하고 배양하여 비교하였다. 결핵환자 객담 검체 135개 중 도말검사결과 양성은 95개였고, Ogawa 배지 배양결과 양성으로 확인된 수는 89개(65.9%)였으며, BacT/Alert 액체 배지에서는 97개(71.9%)가 양성으로 확인되었다. 결핵균 배양 양성 검체의 평균배양일은 Ogawa 배지에서 22.4일, BacT/Alert 액체 배지는 11.3일로 단축되는 것을 확인하였다. 약제 감수성 시험에는 32개 결핵균주를 이용하였으며, isoniazid를 첨가한 BacT/Alert 액체 배지와 $L\ddot{o}wenstein$-Jensen 배지에서의 약제 감수성 시험 검사결과 일치률은 87.5%를 보였고, rifampicin에서의 일치률은 90.6%로 나타났다.
Lentinus edodes의 액체배양을 통하여 균사체 및 polysaccharide의 최적 생산조건을 조사하였다. 플라스크 배양을 통하여 검토된 균체량 및 polysaccharede 생성을 위한 최적 배지의 조성은 glucose 60 g/L, yeast extract 10 g/L, $KH_2PO_4$ 2.0 g/L, $MgSO_4{\cdot}7H_2O$ 1.0 g/L이었다. 최대 균체량은 배양 10일째 11.01 g/L이었으며 최대 polysaccharide 생성량은 배양 6일째 1.64 g/L를 나타내었다. 생물반응기를 이용한 회분배양에서 균사체와 polysaccharide 생산량을 증가시키기 위하여 통기량을 조절하였다. 그 결과 통기량이 증가할수록 균체량과 polysaccharide의 생성량이 증가하였다. 결과적으로 통기량을 1.5 vvm으로 하여 배양하였을 때 배양 8일째 55.9 g/L의 균체량과 배양 7일째 7.34 g/L의 polysaccharide로 최대생성량을 얻을 수 있었다.
본 연구에서는 효율적으로 표고 액체종균을 생산하기 위하여, 액체배지에 폭기방법으로 산소를 공급하고, 대두박을 첨가하여 표고균사체 생장량과 잔존 배양액의 유리당함량을 조사하였다. 그 결과 폭기방법은 균질화된 표고균사가 생장하면서 서로 뭉치지 않고 균질하게 증식하고, 대두박 첨가는 대수기 이후에도 지효성 질소영양원이 공급되도록 하는 효과가 있었다. 배양 중 침전 균사체의 중량은 13일째에 가장 많았으며, 배양용기의 배출구에서 이산화탄소 농도는 13일째에 가장 높았다. 상층 수용액에서 환원당은 폭기 12일째에 거의 소비되었다. 그리고 배양균사체에서 총질소(T-N)량은 폭기 배양 13일째에 최고 수준이며, 키틴함량과 5종의 유리당 중에서 수크로즈함량은 폭기 배양 18일째에 가장 높았으나, 에르고스테롤 함량은 폭기 배양 22일째에 가장 높았다. 이와 같은 결과를 종합적으로 판단할 경우 표고액체 종균으로서 사용 적기는 균사활력이 가장 왕성하고 균체량이 많은 배양 18일째로 판단되었다.
생물반응기를 이용한 대량 번식 방법 개발의 기반을 마련하고자 현삼 조직의 액체배양에서 직접 체세포배 발생에 미치는 치상조직과 식물 생장조절제의 상호영향을 조사하였다. 식물체의 부위에 따라 전혀 다른 양상을 보였는데, 잎, 줄기 및 엽병조직을 치상한후 체세포배 발생 정도를 살펴본 결과 줄기 절편을 배양하였을 때 체세포배 발생율이 가장 높았다. 또한 유식물체로 발달되기까지 약 3주의 기간이 소요되어 빠른 속도로 성장이 이루어진 반면, 뿌리의 형성은 이루어지지 않았다. 엽병을 접종 재료로 하여 3주간 배양하였을 때는 직접체 세포배를 통한 shoot는 형성은 되었으나 줄기 절편에 비해 체세포배 발생율은 낮았으며, 뿌리 발생도 이루어지지 못하였다. 잎조직을 액체 배지에 치상하였을 경우 체세포배 발생에 소요되는 기간이 줄기와 엽병에 비해 상대적으로 길었으며 , 배양 8주 후에는 완전한 식물체로 발달하였다. 액체배양에서 체세포배 형성에 영향하는 생장조절제로는 BA효과가 컸으혀, BA에 옥신류인 IAA와 NAA를 첨가함에 따라 탈분화가 진행되어 체세포배 발생을 감소시키는 경향을 보였다. 짧은 배양 시간 동안 많은 유식물체를 얻을 수 있는 최적의 조건은 BA 05 mg/ l 나 1.0 mg/ l 로 첨가시킨 NS 액체배지에 줄기 부위를 치상 조직으로 이 용하는 것이 가장 효과적 이었다.
액체배양 버들송이 균사체의 생육과 칼슘 흡수에 미치는 칼슘원의 영향을 조사하였다. 칼슘원의 종류에 따른 균사체의 건물량은 유의수준 5%에서 유의하지 않았으며, 칼슘원의 농도에 따른 균사체의 건물량은 농도가 500mg/L까지는 대체로 증가하는 경향이었으나 1,000mg/L 이상에서는 감소하는 경향을 보였다. 균사체의 칼슘 함량은 칼슘원의 종류와 농도에 따라 큰 차이를 보였으며, 칼슘원을 첨가하지 않고 배양한 대조구의 Ca 함량은 198.3 mg/kg이었는데 비해 칼슘을 첨가하고 배양한 경우 최소 273.7 mg/kg(1.4배)에서 최대 67,246.0 mg/kg(339.1배)까지 증가하였다. 칼슘원의 농도에 따른 균사체의 Ca 함량은 칼슘원의 농도가 증가함에 따라 균사체의 Ca 함량도 증가하였다. 배양일수에 따른 균사체의 생육은 배양 8-12일 사이 균사체의 생육속도가 가장 높았으며 16일차까지도 비교적 높은 증가율을 보였다. 배양일수에 따른 균사체의 Ca 함량은 배양기간이 짧은 어린 균사체의 경우 배양기간이 긴 성숙된 균사체에 비해 단위 건물량 당 Ca 함량이 높았다. pH에 따라서는 pH 7.0의 MCM 액체배지에서 생육이 가장 활발하였으며 Ca 함량도 가장 높았다. 결론적으로 칼슘 함량이 높은 버들송이 균사체를 생산하기 위해서 체내 흡수율이 좋고 최근 식품의 칼슘첨가제로 많이 이용되는 Ca-lactate 1,000 mg/L를 첨가한 MCM 액체배지에서 pH 조정없이 배양하여 12-16일차의 균사체를 이용하는 것이 가장 효율적이라고 판단된다.
표고의 생산성 향상을 위하여 대두박 0.3%와 설탕 및 포도당 함량을 달리한 7가지의 액체종균 배양액("A"~"G")을 제조하였다. 배양액의 pH는 배양 14일 동안 기간이 경과됨에 따라 점차 산성화되는 경향이었으며 당의 배합비에 따른 유의차가 있었으나 대차는 아니었다. 배양 최종일에서 설탕 함량이 가장 많았던 배양액("G")에서 유의적으로 높은 산성도를 보였다. 건조 균체량은 배양 기간이 경과됨에 따라 유의적으로 증가되었으며, 배양 14일 경과 후 설탕과 포도당의 배합비에 따른 유의차는 없었다. 톱밥 봉지배지에 액체종균을 접종하여 배양한 결과 접종량은 45 mL이상, 배양 기간은 15~18일 정도가 적절한 것으로 확인되었다. 톱밥 배지에서 고체 및 액체종균으로 생육된 표고의 생산성은 고체종균보다 액체종균에서 유의적으로 높았다. 액체종균에 의한 버섯은 씹힘성(chewiness)이 더 우수하였으며, 감칠맛을 내는 아미노산의 함량이 더 많았다.
발아를 위한 MS 액체배지에서 체세포배를 1주일간 배양하다가 고형배지로 옮겨 배양하면 92%가 발아하지만 액체배지 배양기간이 길어지면 발아율이 낮아져서 4주간 배양 후 고체 배지로 옮기면 26% 밖에 발아하지 않았다. 액체배지에서 발아처리된 체세포배는 배축과 유근의 생장은 충실하게 일어나데 일부에서는 배축에 2차배가 발생되거나 배축과 유근 기부에서 캘러스가 형성된 경우도 있었다. 주사전자현미경에 의한 관찰 결과 경정분열조직을 이루고 있는 세포는 엉성하게 배열되어 있고 제1엽원기가 발생된 경우 그 구조가 충실하지 못하여 생장이 중단되어 있으며 엽원기의 발생이 않된 경우도 있었다. 그러므로 액체배지에서 체세포배의 발아가 억제된 원인은 경정분열조직의 구조적 결함으로 경엽부 형성이 일어나지 못하기 때문으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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