우리 나라에서 발생하고 있는 급성 출혈성 질환인 신증후출혈열의 원인 바이러스는 Family Bunyaviridae의 Genus Hantavirus에 속하는 한탄과 서울바이러스에 의하여 발생되고 있다. 본 연구에서는 신증후출혈열로 의뢰된 환자에서 한탄바이러스에 대한 항체가를 간접면역형광항체법(indirect immunofluorescent antibody technique, IFAT), 면역효소측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (IgG, IgM), 고비중입자응집반응 (high density composite particle agglutination, HDPA) 및 플라크감소중화시험 (plaque reduction neutralization test, PRNT) 등으로 비교 측정하였고, 신증후출혈열 환자로 확진된 15명의 한탄바이러스 혈청형을 PRNT와 혈청형 특이 역전사 효소 중합효소연쇄반응(nested reverse transcriptase polymerase chain reaction, nested RT-PCR)으로 확인하였다. 신증후출혈열로 의뢰된 환자에서의 한탄바이러스에 대한 IFAT, ELISA (IgG, IgM), HDPA그리고 PRNT비교에서 형광항체, ELISA IgG,응집항체 및 중화항체는 8명 모두 높게 나타났으며, ELISA IgM은 5명에서는 현저히 높은 항체를 보유하고 있었다. 신증후출혈 열 환자 15명에서는 높은 형광항체와 중화항체 역가를 나타내었고, 15명 중 12명은 한탄바이러스, 2명은 서울바이러스에 대한 높은 중화항체를 갖고 있었으며, 1명은 두 바이러스에 대하여 동일한 항체 역가를 나타내었으며, 혈청형 특이 primer를 사용한 nested RT-PCR에서는 15명 중 3명과 1명만이 한탄바이러스와 서울바이러스 primer에 대해 RNA가 검출되었다.
무더운 여름 뒤에 오는 쾌적한 가을철에는 전염성 질환이 줄어들고 건강 유지가 비교적 쉽다. 그러나 야외 나들이 기회가 많아져 뱀이나 벌, 해충에 물리는 일이 많고 마른풀이나 잡초를 통해 전염되는 신증후(유행성)출혈열, 쯔쯔가무시증, 렙토스피라증 같은 `급성 열성 풍토병`이 가을철에 드물지 않게 생긴다. 가을철에 주의해야 할 질환과 치료법을 알아본다.
한탄바이러스가 혈소판활성인자 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 간접적으로 혈소판활성인자 수용체의 발현과 분해효소의 활성을 측정하였다. 혈관내피세포에서 혈소판활성인자 수용체의 유전자를 역전사 중합효소연쇄반응으로, 단백질은 western blot으로 측정하였다. 또한 세포표면에 발현된 혈소판활성인자 수용체의 양은 FACS로 분석하였다. 한탄바이러스에 감염된 혈관내피세포에서 혈소판활성인자 수용체의 유전자, 단백질, 세포 표면의 발현 모두 바이러스에 감염되지 않은 대조 세포보다 감염 후 2, 3일째 증가 하였다. 혈액 내 혈소판활성인자 분해효소의 활성을 비교한 결과 신증후출혈열 환자에서 정상인에 비하여 2.5배 낮았다. 그리고 신증후출혈열 환자가 회복됨에 따라 혈소판활성인자의 활성이 다시 정상 수준으로 회복되는 것으로 나타났다. 따라서 한탄바이러스에 의해 증가된 혈소판활성인자 수용체의 발현이 혈소판활성인자와 혈관내피세포와 반응성을 증가시키고, 신증후출혈열 환자 혈액에서 감소된 혈소판활성인자 분해효소가 혈소판활성인자의 분해를 지연 시켜 작용시간을 증가 시킴으로써 과다한 혈소판활성인자의 생물학적 작용이 신증후출혈열의 병리현상을 초래할 것으로 사료된다.
한국 야산에서 포획한 275 수를 대상으로 형광항체법을 이용, Hantaan virus 에 대한 항체 보유 여부를 조사한 바 3.6% 가 양성으로 나타나 박쥐도 Hantaan virus 매개체란 사실이 세계최초로 확인되었고 박죄 종류별 항체 양성률을 보면 관박쥐(Rhinolophus ferrumeguinum) 가 4.3%, 안주애기박쥐 (Verperitilio superans) 가 10% 의 양성률을 모였으며 긴가락박쥐(Miniopterus schreibersii)와 큰수염박쥐 (Myotis mystatinus cilis)는 음성이었다. 또한 야생박쥐의 Rickettsia 종류별 향체보유율은 R. tsutsugamushi 가 3.3%, R. typhi 가 1.8%, R. sibirica 가 R. sibirica 가 3.3%였으며 Thai typhus-118 가 4.4% 로서 가장 높은 양성률을 보였다. 이상의 성적을 종합하여 보면 국내에 서식하는 박쥐는 신증후출혈열 및 리케치아의 보균 동물임이 최초로 밝혀져 보고한다.
Nucleocapsid protein (NP)which exists in the particle of hantavirus and surrounds the viral RNA genome is one of the major structural proteins and plays role of antigen to elicit the antibody detected predorminantly right after infection of the virus in the patients of hemorragic fever with renal syndrome (HFRS)or experimental animals. NP is important target antigen in serological diagnostic system of HFRS utilizing whole antigens from the native virus particle, such as IFA, ELISA and Western blotting. Therefore, the preparation of this protein in the level of higher quantity and purity is desirasble for developed dianosis of the disease. The purpose of this study is the cloning of NP gene which exists in the S genome segment of Maaji (MAA) virus and expression of the gene to obtain qualified, genetically engineered NP to be utilized as an immunodiagnostic antigen. First of all, for the purpose of amplifing the MAA-NP gene by PCR, the specific primers were built from the known nucleotide sequence of Hantaan viral NP gene. The viral cDNA of the NP gene was synthesized by using the primers and RNase $H^-$ AMV reverse transcriptase. Thereafter, using this cDNA as a template, the NP gene was amplified specifically by Taq DNA polymrerase. The pT7blue (R)T-overhang vector systems were used for cloning of the amplified NP gene. The expression system was consisted of BL21 (DE3)pLysS and pET16b as a host and a plasmid repectively. Into Ndel site of pET16b, NP gene was ligated with cohesive end for the expression. Insertion of NP gene in the plasmid was confirmed by PCR and mini prep methods. For expression, IPTG was used and the expressed protein was characterized by Western blotting. The MAA-NP was expressed as the form of inclusion body (insoluble fraction)and the protein purified by affinity and metal chealating columns reacted specifically with the sera from patients of HFRS as to be tested by ELISA and Western blotting.
한탄바이러스의 내피 단백질 (N)은 이 바이러스에 대한 중요한 항원으로 작용하지만 신증후출혈열 예방과 관련된 작용은 명확히 알려져 있지 않다. 본 연구는 이러한 내피 단백질이 한탄바이러스에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는가 하는 관점에서 수행되었다. 한탄바이러스의 내피 단백질을 대장균에서 용해된 형태로 발현하고 이를 단클론 항체를 이용한 면역친화 컬럼으로 분리 정제하였다. 정제된 내피 단백질을 기니픽에 면역하여 항혈청을 얻고 이것의 한탄바이러스에 대한 중화능력을 중화항체 플락 감소법 (plaque reduction neutralization test)을 이용하여 조사한 결과 최고 1:160의 중화능이 있음을 관찰하였다. 이는 한탄바이러스의 내피 단백질이 중화 항체를 유도할 수 있는 epitopes을 가지고 있음을 의리하며 이러한 생각은 본 연구에서 수행한 면역침강법과 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 면역친화법을 통한 한탄바이러스의 정제 실험 결과에서도 뒷받침되고 있다.
This study was performed on 302 cases of leptospirosis, tsutsugamushi disease and hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) which occurred in Chonnam(Do) in 1991 through 1993. The results were as follows : 1. 81.8% of the patients with Leptospirosis and 54.5% of the HFRS patients were men while 61.4% of the patients with tsutsugamushi disease were women. 2. Most patients lived in rural areas(Gun), their educational level was elementary School or lower and their occupations were either farmer or jobless. 3. Peak ages were 40s for leptospirosis(36.4%) and 50s for tsutsugamushi disease and HFRS(32.9% and 36.4% respectively). 4. The high incidence areas of tsutsugamushi disease were northern, eastern and a diagonal line, from northeast to southwest, of the Chonnam area, and these are consistent with a mountainous district. 5. In monthly distribution leptospirosis was higher in Sep. and Oct., and tsutsugamushi disease and HFRS were higher in Oct. and Nov. 6. The first case is occurring and the last case shows up later than in past years.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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