• Proceedings of the Korean Society of Embryo Transfer Conference
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• 1997.10a
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• pp.51-51
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• 1997

• Journal of Embryo Transfer
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• v.21 no.3
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• pp.191-198
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• 2006

The objectives of this study was to produce valuable offsprings of Hanwoo and Jeju black cattle using in vivo embryo production and embryo transfer techniques during 5 years ($2001{\sim}2005$) in Jeju. Two hundred and eighty six Hanwoo and sixty nine Jeju black cattles, at random stages of the estrous cycle, received a CIDR. Seven days later, the animals were superovulated with a total of 400 mg pFSH ($Folltropin^{(R)}-V$) administered twice daily in constant doses (each 50 mg) over 4 days. On the 6th administration of FSH, CIDR was withdrawn and 25 mg $PGF_{2{\alpha}}$ was administered. Cows were artificially inseminated thrice after estrous detection at 12 hr intervals. The cows received $250{\mu}g$ GnRH at the time of 2nd insemination. Embryos were recovered 7 or 8 days after the 1st insemination. Recipients were synchronized with donors by insertion of a CIDR for 7 days and administration of 25 mg $PGF_{2{\alpha}}$ at the time of CIDR removal. The collected embryos were transferred to 1,219 recipients by 6 transfer persons. The mean numbers of total ova and transferable embryos from Hanwoo and Jeju black cattle donors were 7.4 and 4.7, respectively The number of transferable embryos differed between Hanwoo (5.0) and Jeju black cattle (3.5, p<0.05), while that of total ova did not differ. Repeated superovulation treatments decreased (p<0.05) the ratio of numbers of the flushed animals vs. superovulated animals in Jeju black cattle, and the numbers of total ova and transferable embryos in Hanwoo. More transferable embryos were collected at summer (5.6) than winter (2.9, p<0.01). The mean pregnancy rate was 40%. The pregnancy.ate was affected by transfer year (2001<2004, p<0.05) and transfer person ($33.0{\sim}41.9%$, p<0.01), while not by donor (embryo) breed. These results showed that in vivo embryo preduction and embryo transfer techniques using CIDR for Hanwoo and Jeju black cattle donors as well as recipient, regardless of their estrous cycle, may enable a stable embryo production and recipient preparation.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.55-55
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• 2001

Erythropoietin(EPO)는 적혈구 세포 증식, 분화 및 생존에 있어서 가장 중요한 요인이다. 또한, 빈혈성저산소증에 있어서도 EPO가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 태아에서 EPO 생산부위는 간이라고 알려져 있으나, 임신 120-140일에 신장으로 이동하기 시작하여 출생 후 약 40일경 이후에는 완전히 신장에서만 분비한다 EPO단백질의 분비는 오전 8시에 가장 낮고 오후 8시에 가장 높은 2중 리듬의 형태로 발현되어진다. EPO는 27개의 leader sequence와 165개의 아미노산으로 총 193개의 아미노산으로부터 분비된다. EPO단백질의 분자량은 18 kDa이나, 약 40%의 당쇄가 첨가되어있는 당단백질으로서 분자량은 30 kDa이다 N-linked 당쇄 3개(Asn-24, 38 및 83)와 O-linked 당쇄 1개(Ser 126)의 첨가부위가 존재하며, 2개의 disulfide bridges(7-161번, 29-33번)를 형성하고 있다. 이러한 당쇄의 수식은 EPO의 대사에 있어서 매우 중요하다. EPO를 가축의 소변으로부터 생산하기 위하여 생쥐의 3.6 kb UII promoter 하류에 genome hEPO와 SV 40 poly A를 연결하여 형질전환용 발현 벡터를 구축하였으며, 과배란 유기로 채란되어진 돼지의 1-세포기 수정란의 웅성전핵에 유전자를 미세주입기로 주입 후 즉시 대리모에 이식하였다. 66두에 미세주입된 1572개의 수정란을 외과적 방법으로 이식, 평균 23개의 수정란을 이식하였다. 생산된 자돈 112두중 2두(3-5, 3-15번)에서 PCR양성반응(304, 567bp)을 나타내어, 2두의 돼지로부터 소변을 회수하였다. 회수된 소변을 이용 Elisa방법으로 EPO를 분석한 결과 3-5번 돼지에서만 분만 후 지속적으로 EPO농도가 증가되었다. EPO의 최고농도는 1.1 IU/$m\ell$였으며, 이러한 결과는 CHO 세포에서의 500-1000 IU/$m\ell$의 생산량보다도 약 500-1000배정도 낮은 수준이었다. 이상을 종합하여 보면, 1) 가축에서도 생리활성물질을 소변에서 생산할 수 있는 UII promoter의 활용가능성을 제시하였으며, 2) 현재로서는 EPO의 발현량이 너무 낮아, 사용된 생쥐의 promoter를 보완할 필요성이 있다고 사료된다. 그러나, UII promoter를 이용하여 생리활성 물질을 생산할 수 있는 형질전환 돼지 생산의 성공은, 앞으로 형질전환 가축을 이용하는 활용 면에서도 더욱 더 활발할 것으로 기대된다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2004.06a
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• pp.202-202
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• 2004

고양이 체세포 복제산자의 생산은 Shin등(2002, Nature 415: 859) 1마리의 "Cc"를 성공한 이래 재현 생산한 보도가 없다. 그리하여 본 실험에서는 체세포 복제산자 생산을 위한 기초 실험으로서 난자의 체외성숙, 체세포핵이식 수정란의 체외발달율을 검토하고자 수행하였다. 성성숙한 고양이에서 난소적출수술로 난소를 적출 한 후 4시간 내에 실험실로 운반하여 면도칼로 난소를 절재한 후 미성숙난자를 채취하여 TCM199 + 0.4% BSA + 1000 IU/ml bST에서 24시간 체외성숙하였다. 체외성숙한 난자는 난구세포를 제거 후 핵이식에 공시하였다. (중략)

• Journal of Embryo Transfer
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• v.12 no.1
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• pp.91-102
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• 1997

This study was carried out to enhance the efficiency of Korean Native cattle embryos and establish the techniques for producing the twin calves. Bisected embryos without zona pellucida which were divided by simple method not using holding pipette or whole two embryos were transferred to recipients.The pedigrees of monozygotic twin calves produced by transfer of bisected pair embryos were identified. The results obtained were as follows ; The average successful bisection rate was 89.16%. The embryos of blastocyst stage (91.66%) were bisected successfully at significantly (P<0.05) higher rate, compared with the morula stage embryos (86.66%). The average survival rate of bisected embryos following 24 hours culture was 59.02%. The survival rate of morula stage embryos (62.50%) was significantly (P<0.05) higher than that of blastocyst stage embryos (55.5%). For the production of monozygotic twin calves, ten pairs of flesh or frozen demi-em- lymphocytes antigen, the twin calves produced by transfer of bisected pair embryos of Korean Native cattle were identified in pedigrees and confirmed as monozygotes.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.12 no.1
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• pp.49-56
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• 1997

This study was carried out to establish an effective and practical system for commercialization of embryo production techniques by analyzing several factors influencing in vivo embryo production on condition of donors treated FSH-P and SUPER-OV in Korean native cattle. In vivo embryos were flushed 226 times from 128 donors. The results obtained for the factors influencing in vivo embryo production by conditionof donors treated FSH-P and SUPER-OV were as follows :1. Age and parity of donors did not affect the transferable and freezable embryos among the treatments in FSH-P but the transferable and freezable embryos were decreased after 6 years old and 4th parity in SUPER-OV(P<0.01). 2. The production of embryos on the weight of donors was higher in over 400kg of body weight in FSH-P(P<0.01) and was higher in over 450kg than 400~450kg of body weight in SUPER-OV(P<0.05). For FSH-P embryo production was better responded in 350~450kg of body weight with 30~32mg doses, and showed a better result in over 450kg body weight with 32~34mg doses.(Key Words : in vivo embryo, donors, FSH-P SUPER-OV)

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2003.06a
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• pp.72-72
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• 2003

대부분의 동물에서 체내 또는 체외수정란의 체외 배양 시 일정한 발육 단계까지 발달한 후 발육지연이나 정지가 되는 체외 발육억제 현상이 나타나게 된다. 특히 돼지에서는 타 가축들과는 달리 4 세포기에서 체외 발육억제 현상이 일어나기 때문에 체외에서의 발육율이 매우 낮아 수정란 생산이 제한되고 있다. 따라서 본 연구는 이러한 돼지 체외발육 억제 현상을 극복하고 돼지 체외 수정란의 체외배양 체계의 기초 자료를 얻고자 돼지 미성숙 난자를 체외에서 성숙, 수정시킨 뒤, 체외 수정란의 배양 시 성장인자와 6탄당의 첨가에 따른 체외 발육율을 검토하였다. 난자의 핵 성숙과 세포질 성숙 및 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 성장인자로는 Insulin-like growth factor-I(IGF-I)과 Epidermal growth factor(EGF)를 사용하였고, 여러 종의 번식기관에 존재하여 배반포 형성을 촉진시키는 것으로 알려진 glucose, mannose, galactose 및 fructose가 6탄당으로 사용되었다. 체외수정란의 발육을 위한 기본 배양액인 NCSU-23에 각각 0, 1, 5, 10 및 20ng/ml의 IGF-I과 EGF를 각각 첨가하여 농도의 차이에 따른 발육율을 검토하였다. 또한 5.56mM의 glucose, mannose, galactose 및 fructose에 5ng/ml의 IGF-I 또는 10ng/ml의 EGF 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 마지막으로, 각각의 6탄당에 위와 같은 농도의 IGF-I와 EGF 공동 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 그 결과 돼지 체외 수정란의 체외 발육 시 배양액 내에 서로 다른 농도의 IGF-I과 EGF를 첨가하였을 때 IGF-I은 5ng/ml(12%)에서, EGF는 10ng/ml(10%)의 실험구에서 가장 높은 배반포기 배의 발육율을 나타냈다. 또한 각각의 6탄당과 IGF-I 또는 EGF 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 IGF-I과 EGF 모두 glucose 첨가 시 타 첨가구에 비해 초기 발육 단계의 수정란 발육뿐만 아니라 배반포까지의 배발육(10～11%)이 타 첨가구(3～8%)에 비해 높게 나타났다. 한편, 각각의 6탄당이 첨가된 배양액 내에 IGF-I파 EGF 공동첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 모든 실험구에서 EGF와 IGF-I 첨가 시 무첨가보다 높은 초기 배 발육율을 나타냈으며 특히 초기 분열단계 수정란에서는 발육의 차이가 크게 나타났다. 본 연구 결과 성장인자와 6탄당의 첨가는 돼지 수정란의 체외배양 시 초기배 배발육에 효과적인 영향을 미치는 것으로 사료되며, 이는 체외 발육율이 타 가축에 비해 낮은 돼지의 수정란 생산에 있어 체외배양체계의 개선을 위한 기초자료가 될 수 있을 것이라 기대된다.

• Korean Journal of Veterinary Research
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• v.30 no.2
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• pp.123-127
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• 1990

By nuclear transplantation technology twenty eight mice have been produced after transfer of heterozygous biparental eggs. Also heterozygous gynogenetic eggs with two female pronuclei and heterozygous androgenetic eggs with two male pronuclei have been obtained by injecting a male or female pronucleus with Sendai virus into the perivitelline space of enucleated haploid zygotes at pronuclear stage. The success rate of enucleation, karyoplast injection and fusion of both the pronuclei was 80.3, 83.4 and 81.8%, respectively. The overall pronuclei fusion rates by this technique were 56, 50 and 56% in biparental, gynogenetic and androgenetic eggs, respectively. The evidence was ascertained that the gynogenetic and androgenetic eggs were also able to develop in vitro up to blastocyst stage, even though their developmental potential was greatly diminished beyond 2-cell stage. The gynogenetic eggs were able to develop in vivo up to day 10 of pregnancy, while the androgenetic eggs failed to develop in vivo during the same period.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.58-58
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• 2001

본 연구는 섬유소 분해효소 유전자 Cel D(Cellulase Digestion)가 도입된 형질전환 돼지 생산을 통하여 섬유소 함유 사료의 이용 효율을 증대시키고, 나아가 장기이식동물 및 고가의 의료용 단백질 생산가축을 개발하기 위한 원천기술 확보에 있다. 섬유소분해 유전자의 크로닝 및 조직 특이적 발현벡터를 개발하기 위하여, 우선 소의 위중 제4위 내의 미생물로부터 전체 유전자를 분리하였고, 이렇게 작성된 DNA library에서 섬유소분해 관련 유전자인 약 2.0 kb의 Cel D유전자를 크로닝하였으며, 췌장 특이적 발현 프로모터(rat elastase I: 약 200bp)를 크로닝한 후, 미세주입용 형질전환 재조합 벡터를 구축하기 위하여 rElastase I 프로모터 하류에 섬유소 분해 유전자(Cel D)를 연결하여 약 3.0 kb 크기의 재조합 벡터를 준비하였으며, 재조합 유전자를 1세포기 수정란 전핵내에 미세주입 하기 위해 Sal I과 BglII를 이용 유전자 단편을 만들었다. 구축된 유전자를 미세주입하기 위한 수정란을 회수하기위해 총68두의 돼지를 4-5두씩 분리사육하면서 발정동기화 및 과배란 유기를 위해 PG600, Altrenogest, FSH, hCG를 투여하였으며 hCG투여후 약54시간에 외과적 방법에 의해 총 1,359개의 수정란을 회수하였고, 이중 미세주입가능한 1세포기 수정란은 1,296개로 두당 평균 15.9개 였다. 1,296개의 1세포기 수정란 중에서 재조합 유전자(rE I-CelD)가 미세주입된 660개의 수정란을 32두의 수란돈에 외과적 방법에 의해 이식하였으며, 이식되어진 모돈 13두가 분만하여 40.6%의 임신율을 나타내었다. 이렇게 분만된 13두에서 총 65두(암:33두, 수:32두)의 자돈이 생산되었으며, 형질전환 여부를 판명하기 위해 자돈의 꼬리조직으로 부터 genomic DNA를 추출하고 PCR 검정을 실시하였다. PCR 검정 결과, 섬유소 분해 유전자가 도입된 자돈은 5두 이었으며, 그 결과를 Table에 나타내었다.(Table Omitted) Table 1 에서와 같이 섬유소 분해효소유전자가 형질전환된 자돈은 65마리 중 5마리로 7.69%의 형질전환율을 나타내었으며, 5마리의 자돈중 2두(암:1두, 수:1두)는 분만 후 즉시 폐사되었으며 2두(암:1두, 수:1두)는 86일령 그리고 14일령에 폐사하여 현재 1두(암)가 생존하여 섬유소 분해 사양 실험 중에 있다.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.25 no.2
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• pp.191-198
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• 2001

The purpose of this study was to investigate the effects of embryo sources such as in vivo vs. in vitro produced blastocyst, and culture systems on the membrane permeability and viability of bovine blastocyst following GMP vitrification. To produce in vivo embryos, six cows were superovulated by administration of follicle stimulation hormone (FSH) and prostaglandin $F_{2{\alpha}}$(PG $F_{2{\alpha}}$). in vitro embryos were produced by two different culture systems, oviduct co-culture (OCS) and defined culture system (HECM-6; DCS). Ovaries were picked up at a local slaughterhouse and transported to laboratory in 3$0^{\circ}C$ saline within 2 h. Ovaries were washed with same saline three times and then placed in saline on warm plate adjusted at 3$0^{\circ}C$ during aspiration. The blastocysts produced were assigned for membrane permeability and viability following GMP vitrification. The membrane permeability of blastocysts was checked in 0.5 M sucrose solution on warm plate at 35$^{\circ}C$ for 0, 2, 5 and 7 min, respectively. Then the diameters (width and length) of embryo cytoplasms were measured by a eyepiece meter, and they were converted to their volume by 4/3 $\pi$ $r^3$. The blastocysts were cryopreserved by GMP vitrification method, where they were sequentially placed into vitrification solution before being loaded into GMP vessels and immersed into L$N_2$ within 20 to 25 sec. Post-thaw blastocysts were serially washed in 0.25 and 0.15 M sucrose in HM and TCM-199 for 5 min each, and then cultured in TCM 199 supplemented with 10% FCS for 24 or 48 h. The volume change of in vivo blastocyst at 0, 2, 5 and 7 min (100, 37.1, 34.3 and 31.6%) was significantly more shrunk than those of in vitro blastocysts derived from OCS (100, 59.8, 48.9, 47.9%) and DCS (100, 57.2, 47.3 and 46.9%) (P＜0.05). The viability of post-thaw blastocyst derived from in vivo (93.6%) was also significantly different from those in OCS and DCS (81.9 and 83.6%; P＜0.05). In the present culture system, the morphology of embryos produced in vitro was similar to that of in vivo embryos, but the quality in membrane permeability and post-thaw viability showed a big difference from their sources as in vivo or in vitro derived from OCS and DCS. The results indicated that the quality of in vivo embryos in membrane permeability and post-thaw viability was better than those of in vitro embryos derived from OCS or DCS.