난 발생 및 난 성숙을 위한 난소내의 제어기능의 이해는 흥미로운 연구대상이다. 그러나, 난포에 의하여 지엽적으로 분비된 어떤 스테로이드 물질도 난 발생 및 난 제어를 위해 관여하지 않는 것으로 알려져있다. 따라서, 난소내의 조절인자가 어떻게 난 발생 및 난 성숙을 위해 작용하는지를 구명하는 것은 난 발생 및 난 성숙을 위해 매우 중요한 연구과제라 할 수 있다. 본 총설에서는, 본 연구실의 최근의 업적을 중심으로 포유동물의 난 발생과 난 성숙을 위한 난소내의 조절인자에 대하여 정리하였다.
Differential display-PCR 방법을 이용하여, hCG 처리에 의한 참돔, Pagrus major의 난성숙 능력의 획득 경과시간에 따라 새롭게 발현하는 cDNA를 해석하였다. Differential display-PCR과 5'RACE 방법을 이용하여, 2,662 염기와 434개의 아미노산을 코드하고 있는 cDNA의 전염기배열을 결정하였다. DNA의 데 이터베이스인 GenBank 및 EMBL을 이용하여 상동성을 검색한 결과, 본 cDNA와 높은 상동성을 나타낸 유전자는 검색되지 않았다. 따라서 본 cDNA는 참돔의 난성숙 능력 유도와 함께 그 발현량이 증가하는 난성숙 관련 유전자로 판단되었다. 또한 본 cDNA에서는 protein kinase C 인산화 및 casein kinaseII 인산화 consensus 배열의 존재가 확인되었다. 본 연구에서 cloning된 난성숙 관련 유전자는 난여포에 hCG 처리 9~24시간 후에 그 발현량이 증가하였으며, GH-II (300 ng/ml)로 배양한 난여포에서 특이적으로 증가하였다. 또한 in vivo 실험에서 난성숙 관련 유전자는 난성숙 능력 획득 이전의 난소에서는 거의 발현하지 않았으나, 난성숙 능력을 획득한 난소에서 강하게 발현된 점으로 보아, hCG에 의한 난성숙 능력 유도에 성숙기간 중 새롭게 합성되는 난성숙 관련 유전자가 관여할 가능성이 높다.
연두금파리의 난세포성숙에 따른 단백질의 변화와 난특이성단백질의 특성을 확인하기 위하여 gel filtration, 전기영동 및 분자량측정, 아미노산과 지방산함량을 측정하여 얻은 결과는 다음과같다. 연두금파리 암컷성충의 난소단백질은 단백질원을 섭식시킨 후 72시간 이후 빠르게 증가하였고, 완전한 성숙이 일어나는 96시간에 최고의 함량을 나타냈다. DEAE-cellulose와 Sephacryl 5-200으로 gel filtration하고 7.5% native polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과 난소에서 분리된 특이단백질은 ${R}_{f}$ 0.4에서 혈림프 및 난소와 다른 밴드가 확인되었으며, 분자량은 110,000 dalton이였다. 분리된 난특이성단백질내 아미노산 조성은 asparagine 외 모두 13종이 검출되었으며, asparagine, glutamic acid와 함께 tyrosine이 특이하게 높게 나타났다. 지방산은 난소와 함께 난특이성단백질에서 palmitic acid의 4종이 분리되었다. 따라서, 연두금파리의 난에는 지방체에서 합성, 분비된 난황단백질이외에 난소에만 존재하는 특이단백질이 있음을 알 수 있다.
전복의 난황단백질의 특성을 조사하기 위하여 성숙한 참전복 암컷의 난소난 추출물로부터 sepharose Cl-4B gel chromatography을 사용하여 난황단백질을 분리하였다. 암컷과 수컷의 혈청과 난소난 추출물에 대한 항혈청을 이용하여 암수혈청과 난소난 추출물을 면역전기영동과 Ouchterlony 면역확산을 한 결과, 성숙한 암컷 혈청에는 암컷 특이 혈청 단백질(female specific serum protein) 이 존재하였으며, 이것은 난소난 추출물과 동일한 항원성을 가지고 있었다. 한 종류의 난황단백질이 난소난 추출물로부터 분리되었으며, 이 난황단백질은 SDS 전기영동에 의해 분자량이 각각 181kDa과 113kDa이 되는 2개의 subuit로 구성되어 있었다. 이들 난황단백질에 대한 항혈청은 성숙한 암컷 특이 혈청단백질과 간췌장 추출액과 침강반응을 보였으며 서로 교차반응이 일어났으나, 성숙한 수컷 간췌장 추출물에 대해서는 반응이 일어나지 않았다.
미성숙난자 성장과 핵성숙을 성공적으로 유도할 수 있는 체외 배양체계의 개발은 난자발생과정 등 기초 생리학 연구에 도움을 줄 뿐만 아니라, 산업적으로 필요한 난자를 공급해 줄 수 있다는 데 그 의의가 있다. 최근 보고에 따르면 성장 중에 있는 생쥐 난포란은 체외배양과 체외수정과정을 거쳐 산자 생산가지 가능하지만 돼지 난포란 성숙을 위해서는 좀더 고려해야 할 사항들이 있다. 즉, 난성숙 배양액에 낮은 농도의 FSH 첨가는 난자와 과립세포의 생존성을 유지시키고, Hypoxanthine의 첨가는 난성숙율의 향상에 도움을 준다고 한다. 따라서 금후 생쥐난자에서 얻어진 결과들을 기초로 하여 돼지 난포란의 성장과 성숙에 적합한 배양체계의 개발연구에서 괄목할만한 진전이 있다면 대가축들의 난포란 성숙기술을 개발하는데 큰 도움을 줄 것이라고 본다.
항생제는 일반적으로 포유동물 난자의 체외 성숙배지나 배양배지에 첨가된다. 그러나 이들 항생제들이 포유동물의 체외 난자성숙에 미치는 영향들은 아직 완전히 검토되지 않고 있다. 본 연구에서는 염소 난포란에서 체외성숙 능력과 그 후의 단위생식 활성화에 penicillin, streptomycin 또는 gentamycin이 영향을 미치는지에 대하여 조사하였다. 도축장으로부터 수집된 난소로부터 난자-난구세포 복합체들을 회수하여 5개의 처리구 [1) Control: TCM-199 medium with no antibiotics, 2) TCM-199 with 100 IU/ml penicillin, 3) TCM-199 with 50 ug/ml streptomycin, 4) TCM-199 with 50 ug/ml gentamycin, 5) TCM-199 with both 100 IU/ml penicillin and 50 ug/ml streptomycin]에서 24시간 동안 성숙시켰다. 그리고 성숙된 난자들은 ionomycin 처리에 의한 단위생식 활성화를 시킨 후 6-diethlaminopurine(6-DMAP)에서 노출시킨 다음 5개의 항생제 처리구에서 48시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 체외성숙이 유기된 난자에서 제 1 극체가 뚜렷이 방출된 것을 관찰하여 성숙율은 얻었고, 단위생식 활성화는 48시간 후 4-cell 단계의 난분할 관찰에 의해 평가하였다. 24시간 동안 체외성숙이 유기된 미성숙 염소 난자의 성숙비율은 69.1~73.8%로 나타났으나 Streptomycin 처리구에서는 42.5~45.7%로 나타나 유의적인 차이가 인정되었다. (p<0.01) 그러나 48시간 후의 성숙난자의 난할비율에서 5개의 처리구들 사이에는 유의적인 차이가 없었다. penicillin과 gentamicin 처리 집단들은 성숙비율과 48 시간 후 4-cell 단계로의 난분할 비율에 크게 영향을 미치지는 않았다. 그러므로 streptomycin은 미성숙 염소 난자의 체외성숙을 억제하지만 성숙된 난자에서 다음 단계로의 배발달에는 영향을 주지 않는 것이 나타났다.
사육수조내 자연산란이 이루어지지 않는 범가자미 암컷을 대상으로 호르몬 처리에 의안 인위적 성숙.배란 유도 실험이 이루어졌다. 산란시기에 범가자미 체중 kg당 HCG 265~678 IU, 17${\alpha}$ 20${\beta}$ OHP 0.5~1.0${\mu}$g 농도의 복강주사와 LHRHa 63~81 ${\mu}$g의 펠렛을 투여한 결과, HCG농도 약 300 IU가 범가자미의 최정성숙과 배란유도에 효과적인 것으로 나타났다. 17${\alpga}$ 20${\beta}$ OHP와 대조군에서는 난의 성숙이 거의 진행되지 않았으며, LHRHa 펠렛 실험군에서도 난의 최종성숙과 배란이 일어나지 않았다. 따라서 범가자미 암컷의 경우 현재 많이 사용되고 있는 LHRHa 펠렛 투여보다도 저농도의 HCG (dir 300 IU/kg 체중)o 주사가 난의 최종성숙과 배란에 더 효과적인 것으로 나타났다.
담수산 잉어과(Cyprinidae), 황어아과(Leuciscinae)에 속하는 버들치(Chinese minnow; Rhynchocypris oxycephalus)의 난자형성과정과 성숙난 난막의 미세구조를 광학현미경과 전자현미경으로 관찰한 결과는 다음과 같다. 난원세포의 세포질은 호염기성이었고 핵 내에 다수의 인들이 분포하고 있었다. 제1난모세포의 경우 난황포가 단지 난세포 가장자리에만 배열되어 있었고 난막의 형성은 관찰되지 않았다. 제2난모세포에서는 난막이 형성되었고 제1난모세포에 비해서 난황포가 점점 핵 쪽으로 증식된 경향을 보였다. 발생이 진행됨에 따라서 호염기성 물질들은 점점 감소하는 경향을 보였고 후에 난막 주위에만 국한적으로 분포하였으며, 난막의 두께와 난자의 크기는 점점 증가되었다. 배란된 성숙난 난막의 표면은 미세융모와 같은 구조물들에 의하여 덮혀 있었고 동물극 쪽에 깔떼기 형태의 난문이 발견되었다. 난막의 단면을 확인한 결과 부착성 외층과 섬유상 내층 모두 2층으로 구성되어 있었다. 이상과 같이 버들치의 난자형성과정은 난세포의 크기 증가, 난황낭의 축적, 염기성 물질의 감소, 난막발달 및 두께의 증가로 요약될 수 있으며 이 패턴은 잉어과의 공통적인 특징으로 생각된다. 그러나 배란된 성숙난 난막의 미세구조적 특징들은 이 종만이 가지는 종특이성으로 종을 분류하는 데 이용될 수 있다.
검정금파리의 변태에 따른 엑디스테로이드를 Radioimmunoassay법으로 측정하고, 난세포성숙에 미치는 엑디스테로이드의 효과를 조사하여 얻을 결과는 다음과 같다. 산락직후 존재하였던 난내 엑디스테로이드는 발생과정 중 감소하다가 부화 직전 다시 증가하였으며, 유충기와 용기의 성장 변태시 엑디스테로이드함량의 변화를 보면 유충-유충과 유충-용으로의 탈피시에 일시적인 증가현상을 나타냈다. 특히 용화 후 48시간에 높은 엑디스테로이드의 농도를 보였는데 이는 큐티클분비와 경화작용과 밀접한 관계가 있는 것으로 생각된다. 성충기에서는 수컷의 경우 엑디스테로이드가 거의 검출 되지 않은 반면, 암컷에서는 단백질원 섭식 후 96시간에 최고의 함량을 나타내어 난성숙도와 일치하는 변화를 보였다. 엑디스테로이드 처리와 난성숙도와의 관계를 보면, 1$\mu$g 처리군은 대조군에서와 같은 성숙도를 나타내 차이를 보이지 않았으나, 5$\mu$g처리군에서는 대조군에서 보다 12시간 빠르게 난세포성숙이 완료되어, 엑디스테로이드 처리시 임계농도 이상에서는 난세포조기성숙에 직접적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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