유기 용매에 추출되는 유리형의 홍국 색소를 보다 많이 얻기 위하여 Monascus anka의 균주를 자연 및 자외선 변이균주에서 선발하고 배양 조건을 탐색하였다. 균주 N3를 Lin's medium에서 진탕 배양, Nishikawa's medium에서 정치 배양 및 진탕 배양하여 균체성장과 색소생성에 소요되는 시간, 유기용매에 추출되는 색소의 양을 비교하여 보았다. Lin's medium에서의 액침 배양에서는 수용성 색소가 우세하게 생성되는 반면 Nishikawa's medium에서의 정치 배양에서는 보다 많은 유기용매 가용성의 색소를 얻을 수 있었다. 한편 탄소원으로는 자당외에 에탄올이 가장 효과적이었다. Sterol 합성저해제를 처리하였을 때는 상당한 색소 형성의 증가를 볼 수 있었다. 이차원 TLC로써 아직 보고된 바 없는 색소들이 존재함을 알 수 있었다. 이 균주의 색소중 가장 다량으로 존재하는 황색소의 하나를 분리하였고 분광학적 방법으로 ankaflavin으로 동정하였다.
한국의 제주도와 서해안 염전의 해수로 부터 각각 빨강 (JU11-1), 노랑(JU14), 주황(TA20)의 색소를 생성하는 3 균주를 분리하였으며, 이들의 분류학적 특성 및 16S rRNA 서열 분석 결과 3 균주 모두 Pseudoalteromonas 속 세균으로 밝혀졌다. 이들 각각의 색소 최대 흡수파장은 각각 537, 378, 387 nm로 나타났다. 균주는 Marine broth 2216에서 잘 자랐으며, $30^{\circ}C$, 2% NaCl, pH 6-7 의 조건에서 Ju11-1과 Ju14는 배양 24 시간에, TA20은 배양 28 시간에 최대 색소 생성을 나타냈다. 탄소원으로 maltose를 1% 첨가하였을 경우 색소 생성이 우수하였으며, 질소원으로는 beef extract를 1% 첨가하였을 경우 최적의 색소 생성을 나타냈다.
Rhodopseudomonas capsulata H161에 다량 축적되어 있는, 천연 색소 자원으로 중요한 carotenoid 색소 생성조건을 검토하기 위하여 본 실험을 행하였다. Rhodopseudomonas capsulata H161이 생성하는 주된 carotenoid는 spheroidene, rhodovibrin, spirilloxanthin, lycopene이었다. 본 균주는 anaerobic light, 온도 3$0^{\circ}C$, pH 7.4, 광도 5,000Lux에서 5일간 배양하였을 때 균체 생성과 carotenoid 생성량이 최대치를 보여주었다.
치자황색소로부터 미생물에 의해 변환된 색소의 색조차이를 규명하고자 L. plantarum과 S. epidermidis에 의해 변환된 색소를 Amberlite XAD-4 column chromatography로 정제 한 다음 Sephadex LH-20 column의 gel filtration 용출양상과 분리된 색소의 분광학적 특성을 조사 하였다. L. plantarum에 의해 변환된 색소는 crocetin보다 큰 분자크기를 갖고 588 nm에서 홉수극대를 갖는 단일의 청색소를 생성하며, S. epidermidis에 의해 변환된 색소는 L. plantarum에 의해 생성되는 588 nm에 흡수극대를 갖는 청색소와 함께 crocetin 보다 작은 분자크기와, 413 nm에서 흡수극대를 갖는 황색소를 동시에 생성함으로서 청녹색을 띠는 것임이 밝혀졌다.
한국 근해와 염전으로부터 40 균주의 색소 생성 호염세균을 분리하여, 16S rDNA PCR-RELP와 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 다양성을 파악하였다. 분리된 호염성 색소 생성 세균들은 Pseudoalteromonas, Photobacterium, Vibrio, Halobavillus, Bacillus, Paracoccus, Salinicoccus, Tenacibaculum, Flavobacterium의 다양한 속의 세균 종이었다. 해양에서 분리한 색소생성 호염 세균의 $80\%$ 이상이 그람음성인 Pseudoalteromonas 속이었으며, 염전에서 분리한 세균의 대부분은 그람양성의 Halobavillus속 세균이었다. 또한 Salinicoccus 속에 속하는 신종 가능성이 있는 균주 KK7을 분리하였다.
Monascus색소 주탄소골격의 생성 메카니즘을 연구하고, 새로운 개시체가 색소 생합성에 미치는 영향을 연구하고자 적절한 중간체와 개시체를 투여하였다. 크로톤산과 소르브산은 낮은 농도에서 균체의 증가 없이 색소 형성을 촉진하였다. 소르브산이나 그의 에틸에스테르를 투여하였을 때에는 크로톤산의 경우보다 약 2배 색소형성이 많았다. 이외에도 신남산과 비닐아크릴산을 개시체로 투여하였을 때에는 색소 혼합물은 암적색으로 나타났으며 색소의 형성은 감소하였다. 그러나 에틸에스테르로 변환시켜 투여하였을 때에는 색소의 형성이 증가하였으며 이차원 TLC 결과 새로운 적색소가 생성되었음을 알 수 있었다.
Monascus anka Y7이 생성하는 황색소의 항균활성 특성을 규명하였다. Y7의 조황색소는 그람 양성균보다 그람 음성균에 대한 항균 활성이 더 크게 나타났으며 Candida 등과 같은 효모에 대해서도 항균활성을 나타냈다. 특히 황색소의 항균성분 중 TLC로 분리한 E2 분획은 E. coli에 대한 항균활성이 크며 373 nm에서 주된 흡광 특성을 보이고 있고 흡수 파장 범위가 장파장 부위로 넓어져 있어 외관상 진한 밝은 황색을 나타내는 형광색소이다. Y7의 조색소 및 각 TLC 분획의 HPLC분석 결과 citrinin이 검출되지 않았다. 이는 Y7의 항균 특성이 최근 Monascus 색소에서 안전성의 논란이 되고 있는 citrinin과는 무관한 것을 의미한다. 한편 E2 분획을 주로하는 조황색소는 식품에 일반적으로 사용되고 있는 천연황색소인 치자황색소, 아나토색소, 홍화색소보다 황색도(b/a)가 매우 높고 이들 색소와 유사한 색조를 나타내므로 항균성을 보유한 대체 황색소로서의 가치가 높을 것으로 사료된다.
1. 증미(고체) 배양에서는 배양주(Type cultures)보다 분리주가 월등하게 많은 량의 색소를 생성하였다. 2. Lin씨(氏)의 Submerged culture에서는 IAM 8004(Monascus purbigerus)의 경우 carbon source로서 Rice powder 대신에 Wheat bran 1%, Starch 2%와 Corn meal 3%의 것이 색소의 생성량이 많았고, 분리주는 Carbon source를 Rice bran 1%, Starch 2%로 한 것이 가장 좋았다. 3. 사천씨(四川氏) 배지에서는 3%의 탈지대두분을 첨가했을 때 대체적으로 각 균주모두가 더 많은 색소의 생성을 보였다. 4. 추출한 색소액은 pH, 열처리등에 모두 안정하고 각종용매에 대한 추출성도 좋아서 많은 종류의 식품착색에이용될 수 있을 것으로 생각되나 내광성이 약한것이큰결점으로 보인다. 5. 본색소의 안전성은 Mouse의 경우 $LD_{50}$이 체중20g당 0.2359g으로서 안전한 편이며 더구나 시료를 25%의 에틸알코올 추출액으로 투여했기 때문에 에틸알코올의 독성을 감안한다면 색소자체는 극히 안전한 것으로 사려된다. 본연구는 산학협동재단의 학술연구비로서 이루워 진 것이다.
본 실험은 포도와 미국자리공의 세포현탁배양계에서 세포생장과 athocyaninn 및 betacyanin 색소생성에 미치는 광의 영향을 조사하였다. 그 결과, 포도의 세포현탁배양계에서의 세포증식 패턴은 광의 효과가 미약하였으나, 미국자리공의 경우는 암배양에 비하여 광조사구에서 뚜렷한 세포증식 패턴을 나타내었다. 포도세포는 12일간의 배양기간중 한번의 생장 피크를 보여주는데 비하여 미국자리공의 배양세포는 두 번의 증식 피크를 보여 광이 세포의 생장 및 분열 주기를 촉진시킬 뿐만 아니라 색소의 축적도 촉진시키는 것으로 나타났으며, 미국자리공 배양세포는 배양 후 4일째에 액포화에 따른 색소의 축적이 확인되었다. 한편, 색소생성에 미치는 광의 영향은 포도 현탁배양계에서는 배양후 6일째부터 생성되기 시작하여 배양 후 10일 전후에 최고치를 보이는데 비하여, 미국자리공의 현탁배양계에서는 세포증식 패턴에 따라 배양 후 4일째와 8일째에 두 번의 피크를 보였다. 그러나 이들 두 가지 모두 암배양하에서는 거의 색소 생합성이 이루어지지 않고 광상태하에서만 색소의 축적을 볼 수 있었다. 한편, 포도 세포배양계에서는 배양 후 4일째에 처리한 광은 약간의 효과가 있었으나, 배양 후 7일째 12시간 이상의 광에 의하여 색소생성이 크게 촉진되는 것을 알 수 있었다. 미국자리공의 경우에는 배양 후 7일 째보다는 오히려 배양 후 4일째에 광이 더욱 효과적이었다. 이상의 사실은 이들 두 가지 색소의 생합성과정에는 광이 절대적으로 필수적이지만 광을 필요로 하는 시기 및 요구하는 광량 등이 서로 다르다는 것을 시사해 준다.
본 논문은 피부미백에 관한 실험적 연구로서, 봉선화(Impatiens balsamina Linne)의 성분 중에서 하이드록시-나프타-퀴논(hydroxynaphthoquinone)이 멜라닌 생성억제 효능, 색소침착 저해 효과 등의 미백 활성이 있는 것으로 밝혀졌다. 피부흑화(melanogenesis)는 멜라닌 색소생성세포(melanocyte)에서 자외선 등의 자극에 대한 방어기작으로 멜라닌 생성 활동이 증가되고 이로 말미암아 만들어진 다량의 멜라닌이 각질형성세포(keratinocyte)로 전이되어 피부 표피층에 축척된 결과이다. 비록 멜라닌이 피부에 보호작용을 하나 피부의 과색소 침착은 기미, 주근깨, 피부염증 후의 피부흑화, 노인성 색소반점 등을 일으키며 이로 인해 피부미용 상의 불편뿐만 아니라 정신적으로 부정적인 영향을 미쳐 사회활동에 불편을 초래하기도 한다. 멜라닌 생성 과정은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화 반응을 거쳐 만들어 지며, 이것이 피부 내에 이상 침착하여 기미, 검버섯 등이 생기는 것이라고 알려져 있다. 이와 같은 색소침착, 기미, 반점 등의 완화, 예방 및 치료에는 멜라닌 생성을 억제하는 물질, 예를 들면 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴, 비타민 C 및 그 유도체 등이 개발되어 사용되고 있으나 이 중, 하이드로퀴논은 일단 효과가 인정되고 있지만 감작성이 있기 때문에 일반적으로 사용이 제한되고 있다. 아스콜빈산은 쉽게 산화되어, 이를 배합한 제품에는 변색, 변취가 되는 문제를 야기하고, 식물추출물 유래의 물질들은 식물의 산지에 따라 효능의 차이가 심하여 제품의 균질성이 유지되기 어렵다. 이러한 이유로 많은 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 개발하기 위한 연구들이 계속 진행하고 있다. 2-히드록시-[1,4]나프토퀴논 유도체는 다음과 같은 구조를 나타낸다. 상기 구조에서 R은 포화 혹은 불포화된 직쇄 또는 분지쇄의 알킬로서, 바람직하게는 C1 내지 C10의 포화 혹은 불포화된 직쇄 또는 분지쇄의 알킬이고, 보다 바람직하게는 C1 내지 C5의 포화 혹은 불포화된 직쇄 또는 분지쇄의 알킬이다. 실험에 활용된 화합물은 다음과 같은 반응식으로 얻어졌다. 2-히드록시-[1,4]나프토퀴논과 포타슘카보네이트(K2CO3)를 아세토니트릴에 용해한 후, 저온수조로 냉각하고 알킬할라이드를 적당한 당량비로 천천히 적하하여 히드록시기와 에테르(ether) 반응을 통하여 얻어질 수 있다. 상기 반응식에서 R은 C1~10의 포화 또는 불포화된 알킬기로서 직쇄형 또는 분지쇄형 모두 가능하다. 상기 화합물인 2-히드록시-[1,4]나프토퀴논(2-hydroxynaphthoquinone)은 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 하이드로퀴논과 대등한 멜라닌 생성 억제효과를 보였다. 하이드로퀴논은 저농도에서 강력한 멜라닌 생성 억제효과를 보이지만 상기 화합물들은 보다 낮은 농도에서도 세포독성을 나타내지 않으며 하이드로퀴논보다 높은 멜라닌 생성 억제 효과를 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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