• 한국전자현미경학회:학술대회논문집
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• 한국현미경학회 2003년도 제34차 추계학술대회
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• pp.41-42
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• 2003

• 한국진공학회:학술대회논문집
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• 한국진공학회 2009년도 제38회 동계학술대회 초록집
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• pp.42-42
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• 2010

전기천공(electroporation)은 세포에 nanosecond-millisecond 정도의 폭을 가지는 전기 펄스를 0.4-1.5 kV/cm 의 세기로 인가하여 세포 막 표면에 나노미터 크기의 미세한 기공을 형성하는 기술로서, 1970년대 처음 발견된 이래 수십 년 동안 다양한 생명공학 분야에 적용되어 왔다. 적절한 전기 펄스 조건 하에서 생성된 세포 막 표면의 미세 기공은 일정 시간 후 다시 사라지는 가역적 특성을 가져 이를 가역적 전기천공(reversible electroporation)이라 부르며, 주로 친수성약물, 유전자, 효소, 항체 등의 물질을 세포 내로 주입시키는 데 사용한다. 반면 이보다 강한 전기 펄스 하에 생성된 미세 기공은 사라지지 않고 결국 세포의 생명력을 잃게 하는 기전으로 작용하며, 이를 비가역 전기천공(irreversible electroporation)이라 한다. 비가역 전기천공 기술은 가역적 전기천공 측면에서는 바람직하지 않은 현상으로 인식되기도 하였으나, 최근 들어 그 장점을 이용한 기술적 접근이 이루어지고 있다. 전기천공은 주로 식품산업에서 미생물을 죽이는 기술이나 세포의 체외(in vitro) 유전자 주입 기술에 응용되어 왔으나, 현재는 암을 치료하기 위한 의학적 기술로 큰 주목을 받으며 많은 연구들이 진행되고 있고, 일부 기술은 이미 상용화 단계에 와있다. 본 발표는 전기천공의 기술적 이론적 배경과 함께 다양한 의학적 응용 기술에 대한 정보를 제공하며, 국내외 기초 및 응용 연구 동향 파악을 통해 국내 저변 확대 및 추후 발전 전망에 대해 논의 할 것이다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.55-55
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• 2001

Erythropoietin(EPO)는 적혈구 세포 증식, 분화 및 생존에 있어서 가장 중요한 요인이다. 또한, 빈혈성저산소증에 있어서도 EPO가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 태아에서 EPO 생산부위는 간이라고 알려져 있으나, 임신 120-140일에 신장으로 이동하기 시작하여 출생 후 약 40일경 이후에는 완전히 신장에서만 분비한다 EPO단백질의 분비는 오전 8시에 가장 낮고 오후 8시에 가장 높은 2중 리듬의 형태로 발현되어진다. EPO는 27개의 leader sequence와 165개의 아미노산으로 총 193개의 아미노산으로부터 분비된다. EPO단백질의 분자량은 18 kDa이나, 약 40%의 당쇄가 첨가되어있는 당단백질으로서 분자량은 30 kDa이다 N-linked 당쇄 3개(Asn-24, 38 및 83)와 O-linked 당쇄 1개(Ser 126)의 첨가부위가 존재하며, 2개의 disulfide bridges(7-161번, 29-33번)를 형성하고 있다. 이러한 당쇄의 수식은 EPO의 대사에 있어서 매우 중요하다. EPO를 가축의 소변으로부터 생산하기 위하여 생쥐의 3.6 kb UII promoter 하류에 genome hEPO와 SV 40 poly A를 연결하여 형질전환용 발현 벡터를 구축하였으며, 과배란 유기로 채란되어진 돼지의 1-세포기 수정란의 웅성전핵에 유전자를 미세주입기로 주입 후 즉시 대리모에 이식하였다. 66두에 미세주입된 1572개의 수정란을 외과적 방법으로 이식, 평균 23개의 수정란을 이식하였다. 생산된 자돈 112두중 2두(3-5, 3-15번)에서 PCR양성반응(304, 567bp)을 나타내어, 2두의 돼지로부터 소변을 회수하였다. 회수된 소변을 이용 Elisa방법으로 EPO를 분석한 결과 3-5번 돼지에서만 분만 후 지속적으로 EPO농도가 증가되었다. EPO의 최고농도는 1.1 IU/$m\ell$였으며, 이러한 결과는 CHO 세포에서의 500-1000 IU/$m\ell$의 생산량보다도 약 500-1000배정도 낮은 수준이었다. 이상을 종합하여 보면, 1) 가축에서도 생리활성물질을 소변에서 생산할 수 있는 UII promoter의 활용가능성을 제시하였으며, 2) 현재로서는 EPO의 발현량이 너무 낮아, 사용된 생쥐의 promoter를 보완할 필요성이 있다고 사료된다. 그러나, UII promoter를 이용하여 생리활성 물질을 생산할 수 있는 형질전환 돼지 생산의 성공은, 앞으로 형질전환 가축을 이용하는 활용 면에서도 더욱 더 활발할 것으로 기대된다.

• Applied Microscopy
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• 제27권2호
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• pp.145-153
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• 1997

꿀벌(Apis mellifera)의 독에 의해 야기되는 포유동물 피부의 조직병리학적 및 미세구조적 변화와 그 수복과정을 확인하기 위하여 실험용 생쥐의 피부에 직침법으로 꿀벌의 독을 주입한 후, 회복된 시점까지 일정시간 간격으로 조직의 표본을 제작하여 광학 및 전자현미경으로 관찰하였다. 독 주입 직후의 표본에서는 표피의 상피세포와 진피의 결합조직에서 현저한 염증반응이 유도되었고, 일부세포의 괴사가 관찰되었다. 고배율의 전자현미경상에서 교원섬유의 직경이 크게 증가되었으며, 면역 단백물질로 추정되는 전자밀도가 높은 grain의 침착이 확인되었다. 이러한 조직병리현상은 독 주입 후 12시간이 경과된 조직의 표본에서 서서히 회복되는 것으로 관찰되었다. 봉침 주위 피부조직의 조직학적 및 미세구조적 변화는 수 일간 지속되었으나, 병리학적 반응은 3일 이내에 거의 거의 소멸되는 것으로 관찰되었다. 또한 생쥐 피부에 대한 꿀벌 독의 병리반응은 다른 절지동물의 독에 비하여 비교적 경미한 것으로 확인되었다.

• 한국진공학회지
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• 제8권2호
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• pp.158-158
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• 1999

ME-ARE법에 의해 합성된 c-BN 박막의 초기성장층 및 이의 계면구조를 개선하고 밀착력을 향상 시키고자 후처리로서 질소이온을 주입$(PSII-N^+)$하였다. 이온 주입량이 c-BN 박막의 미세구조, 계면구조에 미치는 영향에 대하여 조사하였으며 이와 함께 박막의 경도 및 박리특성에 미치는 효과를 고찰하였다. 질소이온 주입시 약 $5.0{\times}10_15atoms/cm^2$ 이상의 주입량에서부터 IR스펙트럼의 변화가 보이기 시작하였으며 $5.0{\times}10_16atoms/cm^2$ 이상의 주입량 이상에서부터 급격한 c-BN$c-BN{\to}h-BN$상전환이 일어났다. HRTEM관찰 결과, 이온주입에 의해 $sp^2$ 결합을 하고 있는 취약한 초기성장층의 결정구조 개선을 확인할 수 있었으며 이온주입된 박막의 경도 및 박리거동을 비교하여 이온주입 및 주입량에 따른 경도 및 박리 상관관계를 설명하였다.

• 한국동물학회지
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• 제38권4호
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• pp.550-556
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• 1995

c-myc proto-oncogene은 여러 세포들의 분화와 형질전화에 뿐만 아니라 정상세포의 분열조절에도 관여한다고 알려져왔다. 특히 생쥐의 초기배아에서 c-myc mRNA가 발현되고 antisense c-myc oligomer의 미세주입에 의해 배발생이 억제된다는 연구결과는 c-myc이 초기배아의 발생 및 분열에 관여하는 것을 시사한다. 그러나 최근까지 초기배아에 존재하는 c-myc promoter의 기능적 활성화에 관한 연구는 미진하였다. 이를 위하여, c-myc promoter와 대장균의 lacZ 유전자를 결합시킨 두 종류의 vector(pcmyc-Gall, pcmyc-Ga12)를 만들어 수정란의 전핵에 미세주입한 후, 배 발생에 따른 c-myc promoter의 활성화를 lacZ 유전자의 산물인 $\beta$-galactosidase 에 의한 X-gal 염색으로 조사하였다. 미세주입된 초기 배아는 2세포기 배아를 포함하는 여러 발생단계에서 $\beta$-galactosidase 의 활성을 보였다. 이는 c-myc 유전자가 배아의 게놈유전자로부터 발현되며, 또한 궁극적으로 초기 배아의 발생과정에 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권3호
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• pp.237-242
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• 2001

본 실험실에서는 최근에 SINE계 B$_1$과 B$_2$의 융합서열이 리포터유전자의 게놈내 삽입을 증가 시킴을 증명하는 결과를 보고하였다. Supercoil 형태일 때 대조구가 6%, SINE 벡터가 25%, 그리고 linear 형태일 때 각각 16%와 63%로 나타났다. 이번 실험에서는 이들 두가지 형태의 벡터를 같은 양으로 혼합한 DNA를 미세주입에 응용함으로서, 전체 게놈내 삽입률 중에서 과연 supercoil 형태의 벡터가 어느 정도로 기여하는지를 조사하였다. 수정란의 전핵에 혼합형태의 DNA를 미세주입한 후 배반포기의 생쥐배아를 대상으로 베타-갈락토시데아제 발현 여부를 조사한 결과 대조구의 경우 17.3%, SINE계 벡터의 경우 46.6%가 양성을 나타내었다. 이 결과는 아마도 supercoil 형태의 벡터는 독자적인 삽입 경로를 가지지 않음을 의미하는 것이며, 대부분의 경우 외래 유전자의 삽입은 linear 형태로 삽입이 이루어지는 듯 하다. 부가적으로 미세주입 결과로부터 일부 삽입 기작을 짐작할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.371-378
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• 1997

본 연구는 인체 락토페린(hLF)을 우유 중으로 생산하는 형질전환 젖소의 개발에 관한 것이다. 이를 위한 모델 시스템으로서 락토페린 cDNAdhk 소의 베타-카제인 프로모터를 이용하여 형질전환 생쥐를 개발하였다. 발현 벡터의 락토페린에 대한 발현효율을 증가시키기 위하여 2개의 재조합 인트론을 삽입하였다. 20계통의 형질전환 생지를 개발하였는데 유즙에서의 락토페린 발현량은 1~200$\mu\textrm{g}$/ml이었다. hLF RNA의 발현 양상을 유선조직을 포함하여 뇌, 신장, 간 조직 등에서 조사하였을 때, 오직 유선에서만 발현되었을 뿐 아니라 엑손/인트론 경계 부위에서 정확하게 splicing되었다. hLF를 생산하는 형질전환 젖소를 개발하기 위하여 위에서 기술한 DNA를 소의 수정란에 미세주입한 후, 외과적 또는 비외과적 방법으로 대리모에 이식하였다. 한편, DNA가 주입된 수정란의 상태가 임신율에 미치는 영향을 조사하였다. 수정란을 최우수, 우수, 보통 등 3등급으로 나누었을 때, 각각의 임신율은 38.9, 15.4, 14.3%로 나타났다. 현재까지 유전자가 주입된 수정란을 대리모에 이식하여 태어난 35마리의 송아지 중, 30마리는 형절전환되지 않았으며 나머지는 현재 분석 중에 있다. 이상의 결과로 본 연구자들은 DNA가 미세주입된 젖소 수정란의 배양과 이식에 필요한 제반 기술을 확립하였으며, 아울러 임신율에 영향을 주는 여러 인자들에 대한 연구도 함께 조사하였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권2호
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• pp.167-176
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• 1997

본 연구는 수정란을 수란우에 이식하기 이전에 형질전환가능 수정란을 선발할 수 있다면 형질전환동물의 생산에 크게 도움이 되므로 3.2 kb $\beta$-actin promoter (lacZ/n대) DNA를 미세주입하여 배반포기배에서의 발현을 확인하여 이들을 선발할 수 있는가를 규명하고자 하엿다. 채란된 난포란은 10%FBS, 5$\mu\textrm{g}$/ml LH, 0.5$\mu\textrm{g}$/ml FSH, 100 unit/ml penicillin 및 100 $\mu\textrm{g}$/ml streptomycin이 함유된 TCM199에 22~24 시간동안 체외성숙을 유도후 5$\mu\textrm{g}$/ml heparin으로 수정능획득을 유도한 1$\times$106 sperm/ml의 정자로 체외수정을 시켰다. 체외수정후 18~20시간째에 vortexing에 의해 과립막세포를 제거하고 원심분리시켜 자/웅전핵이 확인되는 수정란의 핵에 3~4 ng/${\mu}\ell$ lacZ/neo DNA를 미세주입하였다. 모든 수정란의 배양은 3 mg/ml BSA, 20${\mu}\ell$/ml NEM AMINO acids 및 40${\mu}\ell$/ml BME amino acids가 함유되어 있는 CR1aa 배양액에 neo/DNA로 transfected 된 BRL 단층에서 실시하였다. G418에 대한 적정농도를 찾기 위하여 정상적인 수정란에 0, 50, 100 및 200 $\mu\textrm{g}$/ml G418를 첨가하여 배양한 결과 8일째에 30.3%(44/145), 8.7%(13/150), 0.7%(1/151) 및 0% (0/134)의 수정란이 배반포기까지 발달하였다. 그래서 본 실험에서는 일정하게 100$\mu\textrm{g}$/ml G418을 첨가하여 배양하였다. 총 1,127개의 수정란을 미세주입후 G418 없는 배양액에서 710개 (63.0%)가 분할하였다. 미세주입후 48시간째에 2-세포기이상 분할된 수정란을 대조구 및 100$\mu\textrm{g}$/ml G418처리구를 무작위로 할당하여 배양하였으며, 또한 740개의 정상수정란도 같은 반복수로 배양을 실시하였다. 미세주입한 수정란은 8일 후 11.6%(26/255) 및 5.2% (14/267)가 대조구 및 G418 처리구에서 배반포기까지 발달하였으며 정상수정란은 27.2% (151/740)가 배반포기 배까지 발달하였다. 미세주입후 대조구에서는 23.1$\pm$2.6/70.7$\pm$4.7 (32.7%)의 할구가 $\beta$-Gal 활력을 보였고, 반면에 100$\mu\textrm{g}$/ml G418 처리구에서는 40.3$\pm$4.1/48.8$\pm$7.5 (82.6%)가 $\beta$-Gal 활력을 보였다. 비록 mosaic 형태로 외래유전자가 발현되었지만 대조구에서 87.0% (26/30개) 배반포기가 $\beta$-Gal 활력을 보인 반면, G418 처리구에서는 모든 배반포기가 $\beta$-Gal 활력을 보였다 (P<0.05). 그러나 대조구 및 G418 처리구의 ICM colony에서는 영양배엽과 내배엽을 제외한 epiblast에서는 확인되지 않았다. 그러나 이 결과로부터 $\beta$-actin promoter/lacZ gene이 integration되지 않는 것인지 또는 다만 염색 확인이 되지 않는 것인지를 판단할 수는 없다. 이상의 결과는 미세주입후 G418에서 배양한 배반포기배에서는 대부분의 할구에서 주입된 gene을 발현하고 있었으나 ICM colony에서는 특히 epiblast에서는 발현되지 않거나 침묵하고 있었다. 비록 G418 처리구에서 훨씬 더 높은 비율로 주입된 gene이 발현되고 있으나 총세포수는 유의적으로 감소하여 이후 형질전환동물의 생산과 ES like-cell의 설립에는 감소될 것으로 사려된다. 그러나 형질전환 수정란의 선발 및 형질전환동물의 생산능력에 관해서는 더 많은 연구가 필요하다고 사려된다.

• 지질공학
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• 제29권4호
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• pp.405-415
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• 2019

수압암반절개에서 유도된 균열은 자유면에서 지반의 최소주응력에 수직인 방향인 자유면과 평행한 방향으로 형성되거나, 기존에 발달한 미세균열의 영향을 많이 받는다. 본 연구에서는 흑운모화강암 사면에서 시추공 축과 평행한 방향으로 유도슬롯을 생성하여 이중패커의 압력 및 인터벌 구간에 수압을 주입하는 수압암반절개 실험을 수행하고 그 결과를 분석하였다. 실험 결과, 이중패커 압력 및 인터벌 구간 내의 주입으로 형성된 균열은 유도슬롯 방향을 따라 미세하게 나타났으며, 일부 균열은 시추공을 가로질러 연장되었다. 따라서 수압암반절개는 절개할 방향으로 유도슬롯을 생성하여 보다 많은 유량을 주입하면 효율적인 유도균열 조절이 가능할 것으로 판단된다.