• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.17-25
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• 2013

메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로 부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 $Gly_4Ser_1$ linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 ($GFP_{uv}$)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제11권6호
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• pp.603-611
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• 2001

역병균 접종, UV-B 조사 등의 환경인자에 의해 고추의 생체방어물질 및 유도되는 화합물을 조사하엿다. Capsidiol은 2,4-D(1mg/$\ell$), benzyl adenine (0.001 mg/$\ell$)이 첨가된 MS배지에서 jasmonic acid 100$\mu$M을 처리한 담배와 고추 현탁배양세포의 추출물로 부터 Rf 0.32(TLC)에서 동정되었다. 고추식물체내에서 70개의화합물이 동정되었고, 그중 부위별 차이가 있는 성분은 30개 이었다. 역병균 접종, metalaxyl 처리, UV-B 조사 등과 같은 환경인자에 의하여 식물체 중의 1-propanethiol, $\alpha$-D-xylofur-anoside, phenol, hexadecanoni acid, linoleic acid, phytol, ethyl tridecanoate 및 capsidiol 등의 생성 성분 함량 간에 차가 있었다. Capsidiol은 역병균 접종, metalayl과 역병균 혼용 접종 및 UV-B 조사에 의해 생성되었다. capsidiol 함량은 역병균 단독 접종에 비하여 metalaxyl 혼용 처리가 높았고, 역병균 접종 전 metalaxyl(1${\mu}\ell$/$m\ell$)처리시보다 접종 후 처리시가 높았다. UV-B 조사시의 capsidiol은 잎에서 생성되었고, 특히 UV-B 20분조사후 24시간 incubationgon 했을때 가장 높았다.