• Journal of Plant Biotechnology
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• 제40권3호
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• pp.169-177
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• 2013

최근 급속도로 당뇨병 환자가 증가하면서 인슐린 시장이 크게 성장하고 있다. 또한 최근 식물체를 이용하여 의약용 단백질 생산이 경제적인 측면과 안정성 측면에서 매우 효과적임이 보고되고 있어 이를 이용한 분자농업이 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 인슐린 단백질을 식물체에서 생산하기 위한 유전자 발현 construct를 설계하기 위한 실험으로서 식물발현용 preprominiinsulin construct를 제조하기 위한 단계적 실험을 수행하였다. 우선 proinsulin이 무세포 식물 전사/번역시스템에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다. Prominiinsulin construct를 제조하여 대장균에서 발현시키는데 성공하였으며, 이를 트립신으로 절단한 후 인간 항인슐린 항체를 이용한 western 분석을 통하여 효과적으로 A-펩타이드와 B-펩타이드가 형성되며 이후 적절하게 접힘이 일어나고 hexamer로 조립됨을 확인하였다. 이후 식물체에서 재조합 인슐린 유전자가 발현되는지를 확인하기 위하여 RFP 결합 construct를 제조하여 담배의 현탁배양세포인 BY-2 세포에 형질전환시켜 RFP 결합 preprominiinsulin이 성공적으로 발현됨을 확인 하였다. 이러한 성공적인 연구 결과를 토대로 향후 이 construct는 RFP 단백질을 제거하여 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 ${\rightarrow}$ tobacco E2 시그널 펩타이드 ${\rightarrow}$ B-펩타이드(1-29 AA) ${\rightarrow}$ AAK ${\rightarrow}$ A-펩타이드(1-21 AA) ${\rightarrow}$ RR ${\rightarrow}$ His6 ${\rightarrow}$ KDEL ${\rightarrow}$ C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 활용하고자 한다.

• 생명과학회지
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• 제13권6호
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• pp.879-888
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• 2003

추에서 항균 phytoalexin으로 알려진 capsidiol의 생합성을 촉매하는 5-epi-aristolochene hydroxylase는 cytochrome P450 (P450) 억제제인 ancymidol과 ketocornazol에 의해 그 활성이 특이적으로 억제되어, 이 효소가 P450계 효소임을 알 수 있었다. P450 효소가 공통으로 보유하는 염기서열을 지닌 primer를 이용하여 RT-PCR과 cDNA screening을 실시한 결과 고추배양세포에서 elicitor 처리에 의해 강하게 유도되는 cDNA (P450Hy01)를 cloning하였다. 배양세포에 cellulase, arachidonic acid, jasmonic acid, 자외선 등을 처리하여 capsidiol을 생합성하는 량과 P450Hy01 mRNA의 발현정도는 밀접한 유사성이 있었다. P450Hy01의 염기서열은 담배에서 밝혀진 5-epi-aristolochene-1,3-hydroxylase와 98%의 유사성이 있었으며, P450 효소가 공통으로 지니는 heme-binding domain인 FxxGxRxCxG를 보유하고 있었다 이러한 결과는 본 연구에서 cloning된 P450Hy01이 고추의 세포에서 capsidiol의 생합성을 촉매하는 5-epi-aristolochene hydroxylase 효소를 coding 하고 있음을 시사한다.

• 한국연초학회지
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• 제17권1호
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• pp.33-40
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• 1995

Structures of the adventitious root meristem induced from callus culture of tobaco (Nicotiana tabacum cv. NC 82) leaves were investigated by light and transmission electron microscopy. Structural differences between in vitro root and callus cells were also examined by the microscopy. The submicroscopic features of the in vitro root cells were as follows. Intercellular spaces were not developed and nuclei with two nucleoli were observed occasionally. Plasmodesmate were found in groups or sing1y on transverse and longitudinal walls. Amyloplast solely filled with starch grains, with one to five electron - dense bands, was surrounded by single membrane. in the callus cells, vacuolization of central part in the cytoplasm having mitochondria with swollen cristae and starch grains like those of in vitro root cells was a distinct feature. Vesicles which were found between cell wall and plasma membrane may be arisen by a process of protoplasmic invagination. By comparing of ultrastructures between the cells of callus and in vitro roots we found that the distinct differences lied on thickened cell walls and hypertrophed vacuoles in the former, and less thickened cell walls and several small vacuoles in the later.

• 한국연초학회지
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• 제1권1호
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• pp.1-8
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• 1979

담배 (Va 115) 細胞의 液 培養에서 담배細胞의 多量生産을 할 수 있는 Tank 培養에 關한 基礎調査로 培地造成의 果를 調査하였으며 細胞增殖率에 큰 影響을 미쳤던 2,4-D와 無機燐酸의 果에 關하여 調査하였다. 1. 培地造成에서 細胞增殖率에 많은 影響을 미쳤던 要素는 무糖, 無機燐酸의 濃度,窒素源의 形態 및 植物홀몬,特히 2, 4-D의 有無였다. 2. 무糖의 最適濃度는 3%였으며 3%以上의 濃度에서는 多少 細胞增殖率이 좋은 듯 하였으나 그 差異는 크지 않아 3% 程度로 足하였다. 無機燐酸濃度는 LS 培地內의 無機燐酸의 約 2.5 培인 0.30mg/ml 일 때 細胞增殖率이 가장 좋았다. 3. 液 培地의 窒素源은 암모니아態窒素와 硝酸態窒素가 1 : 2 일 때가 가장 좋았고 窒素源이 암모니아태 만으로 使用하였을 때 細胞增殖率이 가장 낮았으며 硝酸態만 使用되었을 때는 암모니아태만 쓰였을 때 보다는 좋았으나 암모니아태와 硝酸態의 比가 1 : 2 일 때 보다는 떨어졌다. 4. 液 培地에 2,4-D 添加와 無機燐酸濃度를 높이면 細胞增殖率이 增加되는 機作을 調査하기 爲하여 呼吸率과 14C - glucose 吸收利用을 調査하였다. 細胞의 吸收率은 2, 4-D를 添加하면 增加되며 14C-glucose의 吸收는 培地內에 2, 4-D가 包含되거나 (0.2 ppm) 燐酸濃度가 높아지면(對照의 2.5培) 더욱 많았고, 吸收된 14C-glucose는 糖 상태보다 다른 形態,特히 amino 酸이나 有機酸으로 많이 变하였다.

• 한국잡초학회지
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• 제11권2호
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• pp.137-141
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• 1991

녹화된 cal1us의 제초제 paraquat와 diuron에 대한 반응을 요약하면 다음과 같다. LS 기본(基本) 배지(培地)에 sucrose 농도(濃度) 1.0%, NAA $10^{-5}$ M, BA $10^{-6}$ M을 첨가(添加)하여 paraquat를 처리(處理) 하였을때 농도(濃度)가 $10^{-6}$ M에 서 $10^{-4}$ M으로 증가(增加) 할수록 calli의 증식(增殖)이 억제(抑制)되고 엽록소(葉綠素) 함량(含量)이 감소(減少)되었다. $10^{-4}$ M에서는 완전(完全) 고사(枯死)하였으며 $CO_2$가 공급(供給)되는 조건(條件)에서 억제(抑制) 정도가 높았다. 제초제(除草劑) diuron 처리(處理) 시(時)에도 $10^{-6}$ M에서 $10^{-3}$M으로 농도(濃度)가 증가(增加) 할수록 callus 증식(增殖)이 억제(抑制)되었으며 sucrose농도(濃度) 2.0% 때 보다 1.0%에서 훨씬 높은 억제(抑制) 경향(傾向)을 보였다.

• 식물조직배양학회지
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• 제24권1호
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• pp.63-69
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• 1997

Erythropoietin(EPO)은 적혈구 모세포의 분화와 성장을 중재하는 당단백질이며 담배 식물체에서 재조합 사람 EPO를 생산하기 위해 CaMV 35S promoter를 갖는 발현 vector인 pBI$\Delta$GUS121, pBD$\Delta$ GUS121, pPEV-1을 이용하여 5.4kb의 EPO genomic DNA를 cloning 하였고 Agrobacterium tumefaciens에 의한 형질전환에 의해 Nicotiana tabacum (var. Xanthi)으로 도입되었다. Kanamycin을 포함하는 MS 배지에서 각각의 construct에 대하여 10 km 저항성 식물체들이 얻어졌다. 형질전환된 식물체의 게놈에 EPO genomic DNA의 정확한 결합은 polymerase chain reaction에 의해 332bP의 DNA 조각에 의해 확인되었으며 Northern blot 결과 1.8 kb의 전사체들이 식물체 잎에서 발현 축적되는 것이 확인되었다. Promoter의 수나 5'-UTS 서열에 의한 mRNA 양에는 변화가 없었지만 식물체 게놈에 결합된 위치 및 copy number에 의해 mRNA 수준에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. EPO 항체를 이용한 Western blot 결과 식물체에서 발현된 EPO 단백질의 크기는 동물세포에서 발현된 37kDa 보다 작은 30 kDa 이었다. 이는 식물체에서 modification(glycosylation) system은 동물세포에서와는 다르다는 것을 보여준다.

• 농약과학회지
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• 제18권3호
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• pp.202-209
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• 2014

RNA interference(RNAi)는 살아있는 세포 내에서 유전자의 표현 형을 억제하는 작용을 하고 Chitinase는 곤충이 탈피를 하는 동안 오래된 큐티클의 분해와 재흡수를 도와주는 효소로 알려져 있다. 이러한 작용기작을 이용하는 연구를 수행하기 위하여 담배거세미나방의 chitinase와 관련하여 탈피저해 효과를 조사하였다. 담배거세미나방 5령 유충으로부터 RNA를 추출하고 이용하여 cDNA를 합성하고 약 700 bp의 chitinase를 증폭 하였다. 증폭한 PCR product를 pGEM T-easy vector에 cloning하여 competent cell (E.coli)에 형질전환 시키고 mixture를 배양 후 colony를 선발하고 plasmid DNA를 추출하였다. 그 결과 약 3 kb size의 vector band와 약 700 bp의 insert band를 확인 할 수 있었다. dsRNA를 합성하기 위해 각각의 DNA를 Spe I과 Nco I의 제한 효소 처리를 하여 linear form의 DNA로 만들었다. dsRNA 합성 후 약 $10{\mu}g/{\mu}l$의 농도로 $5{\mu}l$씩 담배거세미나방 4령 유충에 주입하였다. 그 결과 유충-유충간의 탈피에서는 기형발육, 탈피저해, 표피의 색소 변이가 나타났다. 번데기-성충 간의 탈피에서는 탈피저해, 날개변이, 기형발육 현상을 볼 수 있었다. 용화율의 경우 무처리구 83.3%, DW 처리구 78.3%, dsRNA 처리구 66.7%로 나타났다. 우화율의 경우 무처리구 90.0%, DW 처리구 72.3%, dsRNA 처리구 65.0%로 나타나 dsRNA를 처리한 그룹에서 상대적인 탈피 저해 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 변이율의 경우 무처리구 8.9%, DW 처리구 2.9%, dsRNA 처리구 19.2%로 dsRNA를 주입한 처리구에서 변이율이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 표현형적 변이는 dsRNA 주입 후 약 18 시간 이후부터 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제5권2호
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• pp.175-182
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• 1990

N. tabacum $NR^-/SR^+$과 N. glutinosa의 엽육세포로부터 원형질체를 분리하여 전기적으로 융합 및 배양하였으며 AAPI 9M 배지에서 이 원형질체의 plating effici-ency는 30~35%였다. 분열 중인 소형 세포괴는 1.2mg / ml의 streptomycin이 포함된 $MSNO_3$배지에 치상하여 계속 분열을 유지하는 녹색 칼루스 계통을 선발하였다. 이 녹색 칼루스 계통에서 유래된 4계통의 식물들은 꽃의 형태, 화관의 길이와 염신의 모양에서 양쪽 모식물체의 중간형을 보였고, 엽조직의 peroxidase와 esterase의 isozyme분석에서도 양쪽 모식물체의 특성을 부분적으로 함께 나타냈으며 또한 결실되거나 새로운 isozyme band도 보였다. 이 융합체 추정계통들의 염색체 분석에서 L22계통에서 2n=66, L44계통에서 2n=54개가 조사되어 N.tabacum(2n=48)과 N.glutinosa(2n=24)의 융합체는 염색체의 부분적 감소현상을 보였다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권6호
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• pp.477-485
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• 1998

감자 plastid 형질전찬을 위한 새로운 DNA 절편을 확보하고자, 감자의 trnK-matK 유전자를 PCR 방법으로 클로닝하고 특성을 조사하였다. 염기서열 분석을 통하여 trnK-matK 유전자에는 두 종류의 polymerase 인지부위[Prokaryotic site(plastid encoded polymerase)와 eukaryotic site (nuclear-encoded polymerase)]가 족재함을 알 수 있었다. 이 사실은 trnK-matK 유전자의 발현이 광합성조직과 비광합성조직에서 서로 다른 polymerase에 의하여 조절됨을 시사하였다. 한편 MatK의 아미노산서열을 분석한 결과 식물에 따라 아미노산 identity가 39-75%로 다양하였으나, 감자와 담배는 98%의 아주 높은 identity를 보였다. Northern분석을 통하여 포장과 기내에서 생육된 감자 식물체 모두에서, trnK-matK 의 전사 수준이 잎에서 높고 괴경에서는 낮음을 알 수 있었다. 한편 잎에서의 16s rDNA의 전사수준은 괴경에 비해 약 50배 높았다. 이것으로 미루어보아 괴경에서 수준이 낮을 것은, 괴경에서는 plastid genome copy 수가 적거나 plastid 수가 적기 때문으로 추정된다. 이상의 결과로서 엽록체와 amyloplst 모두에서 trunK-matK 유전자가 활발하게 발현되고 있음을 알 수 있었다. Plastid genomic DNA의 Southern 분석을 통하여 trnK는 1 copy로 존재하고, matK는 trnK intron을 포함하고 있음을 확인하였다. 따라서 감자 plastid형질전환의 새로운homologous recombination 부위로 trnK-matK유전자를 이용할 수 있을 것이다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제50권4호
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• pp.426-436
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• 2001

흡연은 만성 폐쇄성 폐질환의 가장 흔하고 중요한 원인이며 발생기전으로 단백분해효소 및 그 억제제의 불균형에 의한 폐조직 파괴가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 생체내의 여러 단백분해효소 중 matrix metalloproteases (MMPs) 의 역할에 대한 연구가 최근 활발한데, 이들의 다수는 젤라틴 분해능을 보인다. 연구자들은 흡연에 의한 MMPs의 발현 및 폐기종 발생과의 관련성을 규명하기 위한 첫 단계로 기니픽에서 흡연에 의한 젤라틴 분해 단백분해효소의 발현 양상을 알아보고자 하였다. 방 법 : 500gm 가량의 건강한 기니핀 15마리를 대조군 5마리, 6주 흡연군 5마리, 12주 흡연군 5마리 씩 배정한 후, 하루에 5시간 씩, 담배 20개피를 간접 흡연시키는 과정을 일주일에 5회 반복하였다. 흡연력의 정도에 따른 폐조직 내 세포 침윤의 증가를 알아보기 위해, 폐조직을 H&E 염색한 후 400배 확대 시야에서 보이는 폐포벽의 세포 수를 계산하여 일반선형모델을 이용한 통계 분석법으로 처리하였다. 흡연에 의한 젤라틴 분해 단백분해효소의 발현 양상을 알아보기 위해 기관지폐포세척술을 시행하여 폐포내 세포를 얻은 다음 이를 배양접시에 $1{\times}10^6$개 씩 분주하였는데, 한 배양접시에는 아무 처치도 하지 않았고 다른 한쪽은 0.1mM의 EDTA를 첨가하였다. 48시간의 배 양 후 얻은 상층액으로 'gelatin zymography'를 시행하여 젤라틴 분해 단백분해효소의 발현 및 EDTA에 의한 억제 여부를 관찰하였다. 결 과 : 대조군의 혈중 평균 COHb 농도는 4.1g/dl인 반면, 흡연 노출군의 혈중 평균 COHb 농도는 5시간 노출 직후에는 24g/dl, 노출 후 30분에는 18g/dl, 노출 후 1 시간 후에는 15g/dl 로 측정되어 충분한 흡연노출이 이루어졌다. 400배 시야에서 보이는 폐포벽의 세포 수는 대조군은 $121.4{\pm}7.2$, 6주 흡연군은 $158.0{\pm}20.2$. 12주 흡연군은 $196.8{\pm}32.8$로 측정되어 선형회귀관계가 관찰되었다(p=0.001, $r^2=0.675$). 또한 침윤된 세포의 대부분은 염증 세포였다. 한편, 대조군에서는 젤라틴 분해 단백분해효소가 발현되지 않은 반면에, 6주 흡연군 및 12주 흡연군에서는 젤라틴분해 단백분해효소가 여러 개 관찰되었다. 또한 이 중의 일부는 EDTA에 의해 효소 활성도가 억제되었다. 결 론 : 흡연에 의해 기니픽의 폐조직에서 여러 젤라틴 분해 단백분해효소 발현이 증가하며 이 중의 일부는 MMPs의 억제제인 EDTA 에 의해 억제된다. 이는 흡연에 의해 MMPs의 발현이 증가할 가능성을 시사한다고 하겠다.