AcNPV에 대해 감수성을 보이는 파밤나방 세포주인 Se301 세포주의 AcNPV를 이용한 발현 벡터계에서의 유용성을 알아보기 위하여 Se301세포주에서 AcNPV의 감염 특성을 Sf-21 세포주에서와 비교하였다. 그 결과, 바이러스의 감염상은 두 세포주에서 거의 유사하였으나 감염 7일 후에 세포로부터 방출된 다각체의 비율은 Se301 세포주에서 훨씬 높았다. 또한 전체 다각체 생성율은 Se301 세포주에서 약간 높았지만 그 차이는 매우 근소하여 대체적으로 두 세포주에서 거의 비슷하였으나 생성된 다각체의 크기는 Se301세포주에서 더욱 컸다. 한편, 세포주나 바이러스의 증식율과는 무관하게 AcNPV에 의한 다각체 단백질의 발현량이 Se301 세포주에서 약 2.4배 높게 나타남으로써 Se301 세포주가 AcNPV를 이용한 발현 벡터계에서 숙주 세포로서 매우 유용하게 이용될 수 있음을 보여 주었다.
파밤나방 핵다각체병ㅂ이러스의 기주곤충 및 나비목해충에 대한 병원성과 10종 baculovirus의 파밤나방 유충에 대한 교차감염을 조사하여 방제에 이용하고자 시험을 수행하였다. 난에대한 중앙치사농도($LC_{50}$)는 2.855$\times$$10^{5}$ 다각체/ml로 유충보다 높았다. 령별 $LC_{50}$은 3령이 1.422$\times$$10^{4}$ 다각체/ml로 1령보다 1.16배, 5령보다 .11배의 높은 병원성을 나타냈다. 각 령의 중앙치사일수($LT_{50}$)은 1.56$\times$$10^{6}$ 다각체/ml에서 4.26~5.04일이었다. 8종 나비목 해충에 대한 파밤나방 핵다각체병바이러스의 병원성은 기주곤충인 파밤나방에서만 인정되었고 10종의 곤충간상바이러스 중 Autographa californica MNPV, Mamestra brassicae MNPV 및 Trichoplusia ni MNPV 등 3종이 파밤나방 유충에 대해 교차감염을 일으켰다.
담배나방 유충에서 분리한 세포질다각체병 바이러스의 형태, 다각체 단백질 및 핵산의 전기영동상과 바이러스의 병원성을 조사하여 본 바이러스를 이용한 담배나방의 생물적 방제 이용성을 검토하고자 본 실험을 수행하였다. 다각체의 형태는 외관상 6각형으로 0.5~3.7 ${\mu}m$ 크기이고 바이러스 입자는 정 20면체로 55nm였다. SDS-PAGE에 의한 다각체 단백질은 단일 롤리?타이드인 24.3 Kd와 5개의 작은 구성분으로 이루어졌다. 바이러스입자는 7개의 폴리?타이드로 구성되어 있으며 분자량은 28.0~133.6 Kd였다. 바이러스 게놈은 10개의 조각으로 된 총 분자량 18.08 Md인 이본쇄 RNA로 각 조각의 분자량 범위는 0.65~2.79 Md이였다. 3령 유충에 대한 담배나방 세포질 다각체병바이러스의 $LC_{50}$은 $2.895{\times}10^5PIBs/ml$이었으며 $5.0{\times}10^{6}PIBs/ml$의 농도에서 $LT_{50}$에서 16.4일이었다.
밤나방류에 대한 천적미생물을 중심으로 하는 신방제법의 개발을 목적으로 멸강나방에 강한 병원성을 갖는 바이러스의 선별시험을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 멸강나방(Pseudaletia(=Leucania) separata, Walker)유충에 강한 병원성을 가진 핵다각체바이러스를 선별코자 21종(개통)의 NPV를 orchard grass의 양면에 발라서 멸강나방 2령 유충에 첨식한 결과 멸강나방 핵다각체병바이러스 4계통과 벼밤나방 핵다각체병바이러스가 병원성이 높았다. 멸강나방 핵다각체병바이러스 3계통(LsNPV-F, LsNPV-G 및 LsNPV-Y)를 공시해서, 다각체를 인공사료에 혼합하여 해서 멸강나방 1~6령의 유충에 대한 병원성 시험을 행한 결과 1~2령 유충에 대한 병원성이 높고, 4령 이후에는 낮아 약령기방제의 중요성을 시사했다.
국내 분리주의 BmNPV를 이용하여 유용 단백질을 생산할 수 있는 새로운 전이벡터의 제작과 외내 유전자의 발현에 대한 연구결과는 다음과 같다. 1. PCR 기법에 의하여 다각체 단백질 유전자의 +1 - -194에 해당하는 promoter 부위를 증폭하고 클로닝 하였다. 2. 다각체 단백질 유전子의 5' 및 3'의 leader 부위를 promoter 부위와 함께 단계적으로 클로닝하여 전이벡터를 완성하였다. 3. 완성된 전이벡터는 pBmKSK1으로 명명하였으며, 염기서열 결정을 통하여 다각체 단백질 유전자의 +2 부터 +597까지 제거되고 외내 유전자의 클로닝 sites로 EcoRI, KpnI과 SacI을 가짐을 확인하였다. 4. 외래 유전자로서 E. coli의 $\beta$-galactosidase 유전자를 pBmKSKl에 클로닝하고 누에 세포주에 전이시킨 후, X-gal 염색 및 SDS-PAGE에 의하여 pB- mKSKl이 제 기능을 수행함을 확인하였다.
가잠의 Virus다각체의 저온 및 고온처리에 대한 유발현상을 조사하기 위하여 5령기잠을 공시하고 저온(5$^{\circ}C$, 24hrs.), 고온(Hot water bath 에 4$0^{\circ}C$, 5min으로 침지 및 Oven 내에 4$0^{\circ}C$, 30min.으로 단독 및 복합처리하여 핵다각체병(N) 중장형 다각체병(C), 병발형(NC) 유발률을 조사하고 동시에 핵다각체병(N)과 중장형다각체병(C)대하여 Giemsa solution 염색법에 의한 염색성을 조사하였다. 1. 냉장(5$^{\circ}C$, 24 시간) 처리와 고온(Hot water bath, 4$0^{\circ}C$, 5분간) 처리를 한 핵복다각체병(N)은 중장형다각체병(C)보다 그 유발률이 적고 또 복합처리에 있어서도 중장형다각테병(C)의 유발율은 핵다각체병(N)보다 많다. 2. 냉장처리후 고온(4$0^{\circ}C$, 30분간 건열) 처리, 반대로 고온처리후 냉장처리한 Virus다각체의 유발률도 중장형다각체병(C) 보다 핵형다각예병(N)의 유발현상이 현저하게 많이 나타났다. 3. Giemsa solution 염색법에 의한 핵다각체병(N)의 다각체는 염색이 되지 않으나 중장형다각예병(C)의 다각체는 잘 염색되어 염색성에 의하여 구별할 수 있었다.
광식성 난방제 해충인 미국흰불나방(Hyphantria cunea)의 친환경 방제를 위한 바이러스 살충제의 소재 활용을 위해서 국내에서 분리된 미국흰불나방 핵다각체병바이러스(H. cunea nucleopolyhedrovirus W1: HycuNPV-W1)의 다각체 형태 및 전장 유전체 서열을 결정하고 분석하였다. HycuNPV-W1의 다각체는 1.5-2.2 um 크기의 사면체에 가까운 부정형으로 확인되었다. 전장 유전체의 염기서열을 결정한 결과, 기존에 보고된 HycuNPV와 비교할 때 1,606 bp 더 짧은 131,353 bp로 확인되었다. 그러나 G+C 함량은 45%였으며 상동반복영역은 6개로 기존에 보고된 HycuNPV와 차이는 확인할 수 없었다. ORF 분석에서는 HycuNPV-W1은 기존의 HycuNPV와 비교할 때 3개의 ORF가 더 적은 145개를 가졌으나, HycuNPV-W1에만 존재하는 2개의 ORF가 확인되었다. 이들 ORF의 기능은 현재까지 밝혀지지 않았으나 바이러스의 생물학적 특성에 큰 영향을 주지 않을 것으로 추정되었다. 유전체의 vista 분석 결과에서는 HycuNPV-W1과 기존 HycuNPV의 전체 염기서열 유사도가 매우 높은 것으로 확인되었다. 국내에서 처음으로 분석한 HycuNPV-W1의 전장 유전체는 기존의 HycuNPV와 매우 유사한 것으로 나타났으나, 독자적인 특성을 가진 서로 다른 분리주로 국내 고유자원임을 확인할 수 있었다.
누에(Bombyx mori)와 흰불나방(Hyphantria cunea)으로 부터 분리된 핵다각체병바이러스(nuclear polyhedrosis virus: NPV)를 동정하기 위하여 전자현미경 관찰한 결과, BmNPV 다각체의 크기는 $3 \mu\textrm{m}$ 정도의 18면체로 외형이 균일하였으나, HcNPV는 1.5-$2 \mu\textrm{m}$ 정도이며 부정형이었다. Alkaline protease를 부활화시킨 후 SDS-PAGE한 다각체 단백질의 分子물은 BmNPV가 30 KD, HcNPV는 31 KD인 major band와 이들의 중합체(polymer)로 생각되는 57 KD, 112 KD의 minor band들이 관찰되었다. 또한 virion 단백질을 SDS-PAGE한 후 은염색한 결과, BmNPV는 분자량 9.6~112 KD인 47개의 band, HcNPV 경우는 분자량 9.4~l11 KD인 48개는 band가 관찰되었다. BmNPV와 HcNPV DNA의 제한효소 처이에 의한 전기영동 패턴을 관찰했으며, 각각의 genome 크기는 BmNPV가 약 116.4 Kb, HcNPV의 약 114.6 Kb였다.
담배거세미나방 핵다각체병바이러스에 섭식촉진물질, 다각체 침전방지제 및 전착물질과 자외선 차단제를 첨가하여 만든 3종의 바이러스 살충제를 담배거세미나방 유충에 먹여 제제별로 살충 효과를 비교하였다. 바이러스 살충제에 설탕농도 1-5% 첨가로 섭식촉진이 증대되어 살충효과가 높았으며, 바이러스의 불활화 차단효과도 있었다. 살충제 제형에 따른 바이러스 침전방지는 polyvinylalcohoI 0.5%, 식물체 전착성은 Triton X -100 0.1 %에서 효과가 좋았다. 자외선차단제의 양은 white carbon은 100 L 당 800 g, molasses는 30%첨가에서 바이러스의 불활화가 감소되었으며 white carbon-molasses 혼합제는 white carbon 500 g, molasses 10%의 비율에서는 살충효과가 약간 감소하였으나 세 제제 모두 살포 3일후 95%이상의 살충율을 보였다. White carbon 체제는 molasses 제제보다 다각체 포매가 뚜렷하여 잔류효과가 증대되었으나 유충의 섭식은 molasses제제에서 촉진되었다.
국내에서 분리된 파밤나방 핵다각체병바이러스(Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus: SeNPV)의 생화학적인 특성을 규명하기 위하여 몇가지 실험을 행하였다. SeNPV는 하나의 envelopeso내에 다수의 nucleocapsid가 존재하는 MNPV(multiple embeded NPV)형태였다. 다각체단백질은 분자량 30kb의 단일 band로 나타났으며, Spodoptera litura NPV와 Bombyx mori NPV의 다각체단백질 항체에 반응하여 뚜렷한 침강선을 형성하였다. 비리온 단백질을 은염색한 결과, 많은 수의 minor band들이 포함된 49개의 band로 나타났으며, 바이러스 DNA를 분리하여 여러종의 제한효소에 의한 대략적인 genome size는 약 110kb 였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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