녹차 추출물의 에탄올을 이용한 카테킨 성분의 고순도 및 고효율 추출을 위한 추출조건을 반응표면분석법을 사용하여 최적화하였다. 고형분 수율은 에탄올 사용 비율 및 온도 조건 모두 유의적으로 영향을 받았다(p<0.001). 녹차의 카테킨 성분 함량 및 총 카테킨 함량 모두 1%이내의 유의성이 인정되었고 온도보다 에탄올 사용 비율 조건이 추출결과에 더 영향을 미친다. 카페인 함량은 에탄올 사용비율에 유의적으로 영향을 받았다. 반응표면 분석 결과 카페인을 제외한 종속변수의 $R^2$값은 0.90 이상으로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 예측된 조건은 에탄올 사용 비율이 6 mL/g, 온도가 $0^{\circ}C$에서 고형분 수율 33.01%, EGC 12.56%, EC 3.78%, EGCG 22.43%, ECG 5.39%로 총 카테킨 함량은 40.17%이며 카페인 함량은 5.87%로 예측되었다. 예측된 조건에서 실제 추출시 고형분 수율은 35.02%, EGC 13.31%, EC 3.97%, EGCG 19.11%, ECG 4.29%로 총 카테킨 함량은 40.68%이며 카페인 함량은 5.30%로 분석되었다.
저자들은 녹차 카테킨(GTC)이 강한 항 혈전 작용을 나타내며, 이는 항 혈소판 활성에 의한 것임을 보고한 바 있다. 본 연구에서는, 8가지 녹차 카테킨 성분들의 항 혈소판 활성을 비교하였다. 실험결과, 갈레이트(gallate) 구조를 갖는 카테킨들(EGCG, GCG, ECG, CG)은 콜라겐$(5{\mu}g/ml)$으로 유도한 토끼 혈소판 응집능을 강하게 억제하였으며, 50% 억제농도$(IC_{50})$는 각각 79.8, 63.0, 168.2, $67.3{\mu}M$이었다. 또한 EGCG, GCG, CG는 아라키돈산(AA, $100{\mu}M$)으로 유도한 토끼 혈소판 응집능을 억제하였고, 50% 억제농도$(IC_{50})$는 각각 98.9, 200.0, $174.3{\mu}M$이었다. 반면에, 갈레이트 구조를 가지지 않는 카테킨들은 혈소판 응집능 억제 효과가 매우 약했다. 이 결과는 항 혈소판 활성에서 카테킨들의 C-3 위치의 갈레이트 구조의 존재가 매우 중요하다는 것과 카테킨들과 B-ring 갈레이트 구조의 존재 또한 녹차카테킨의 항 혈소판 활성에 중요한 작용한다는 것을 의미한다. 그리고, EGCG는 농도 의존적으로 세포내 칼슘 생성과 아리키돈산의 생성을 억제시켰는데, 이는 혈소판 응집능의 억제와 일치하였다. 반면에, EGC는 세포 내 칼슘 및 다른 혈소판 활성 기전에 아무런 영향이 없었다. 이들 결과는 EGCG의 항 혈소판 활성은 C-ring에서 carbon 3 자리의 에스테르화 된 갈레이트 구조의 존재에 의해서 강화된 항 혈소판 작용으로, 아라키돈산 생성과 세포 내 칼슘 생성을 억제하는 효과에 기인한 것이라 사료된다.
'EGCG(epigallocatechin gallate) rich Green Tea extract(EGTE)' was prepared by a convenient chromatographical manner using water and alcohol which was regarded as the most suitable and appropriate process for food manufacturing. The EGCG content in EGTE was estimated above 97%. Analysis of polyphenol components in green tea, i.e., catechin(C), epigallocatechin(EGC), epicatechin(EC), epigallocatechin gallate(EGCG), epicatechin gallate(ECG) and caffeine was performed by HPLC. The optimized HPLC method exhibited a good linearity of calibration curve, accuracy and precision. The long-term stability evaluation of EGTE was carried out with a powdered formulation and solution formulation by estimating the color change and measuring the EGCG content by HPLC analysis for one year. The EGCG content of the powdered EGTE stored in a transparent bottle at room temperature was retained over 97% at the end of the experimental period. The EGCG content of 0.1% water solution of EGTE stored in a transparent bottle at RT were observed to decrease below 30%, whereas that stored at $2^{\circ}C$ retained over 70%, respectively. These results suggested that a powdered formulation could be recommended for the commercialized nutraceutical product of EGTE rather than a solution formulation.
HPLC에 의한 카테킨류 5성분의 정량분석법을 검토한 결과, 종래의 이동상을 acetonitril, acetic acid 및 methanol 수용액에서 acetontrile, N,N-dimethyl formamide, ethyl acetate의 0.06% 인산수용액으로 전환하였을 때 컬럼에서의 용출시간을 45분에서 28분으로 줄일 수 있었으며, 특히 (-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG)나 (-)-epicatechin gallate(ECG)의 peak를 종래의 넓은 형태에서 예리한 chromatogram을 얻으므로써 분석값의 오차를 최소화 할 수 있었고 머므름시간$(0.32{\sim}3.97%)$이나 peak 면적$(1.61{\sim}7.02%)$의 변동계수도 신뢰할 수 있는 값을 얻었다. 또한 시판되고 있는 수종의 녹차류와 홍차 및 대만산 오룡차를 분석한 결과 녹차류의 카테킨 함량은 $120.3{\sim}153.7\;mg/g$ 이었고 홍차는 녹차류의 1/4수준 이었다.
본 연구는 국내에서 시판되고 있는 녹차, 현미녹차, 홍차 2종류, 오룡차 1종류 및 자스민 차 1종류의 티백 제품을 $80\%$ 에탄올과 물로 추출하여 7종의 catechins, 4종의 theaflavins 및 2종의 methylxanthins의 함량을 HPLC로 동시에 분석하였으며 그 결과는 다음과 같다. 1. 총 catechins의 함량은 에탄올과 물 추출 모두 자스민 차가 가장 높았으며 다음으로 에탄을 추출은 녹차, 홍차(II), 오룡 차, 현미 녹차, 홍차(I)의 순이었으며 물 추출은 홍차(II), 녹차, 현미 녹차, 오룡 차, 홍차(I)의 순이었다. 또한 두 추출법에서, 녹차, 현미녹차, 오룡차, 홍차(II)의 경우는 총catechi 중 EGCG가 차지하는 함량이 가장 높았으며 홍차(I)과 자스민 차는 ECG의 함량이 가장 높았다. 2. Theaflavin류는 TF, TF3G, TF3'G, TF33'G의 4종류가 홍차에만 분석되어 에탄을 추출은 홍차(I)과 홍차(II) 모두 TF33'G가 가장 높았으며 물 추출은 홍차(I)은 TF33'G가 홍차(II)는 TF가 가장 높았다. 3. Methylxanthin류로 caffeine과 theobromine은 에탄올과 물 추출에서 홍차(II)와 자스민차가 다른 차에 비하여 높았으며, 모든 시료에서 caffeine이 theobromine 보다 훨씬 더 많은 함량을 보였다. 이상의 결과, 13종의 차 성분 중 홍차(I)에서 caffeine이 가장 높은 함량을 나타낸 것을 제외하고는 대부분의 차에서 catechin 중 ECG와 EGCG의 함량이 많은 것으로 나타났으며, 이 성분이 차의 기능성 물질로 지배적인 물질이었다.
본 연구에서는 마우스 췌장의 선포세포(primary acinar cell)에서 에탄올에 의해 유도된 염증성 손상에 미치는 녹차의 생리활성 물질인 EGCG의 효과를 췌장분비 효소의 활성과 선포세포에서의 기능 회복 관련 마크로 알려진 유전자들(AMPK, RKIP 및 Reg1)의 발현 조절 측면에서 조사하였다. 대조군에 비해 에탄올이 처리된 세포에서는 ${\alpha}$-amylase와 chymotrypsin의 활성이 증가되었지만, EGCG 처리에 의하여 그들 활성이 유의적으로 감소하였다. 세포 생존 및 보호와 관련 있는 AMPK 인산화 수준은 에탄올 단독 처리시 그 발현이 감소하였지만, EGCG 처리에 의하여 유의적으로 회복되었다. 세포 사멸과 세포독성 조절과 연관이 있는 RKIP 또한 그 발현 경향이 AMPK인산화 변화의 정도와 유사하였다. 또한 베타세포 재생에 관여하는 Reg1 발현은 에탄올이 처리된 선포세포에 EGCG를 처리하였을 경우 그 발현량이 유의적으로 증가하였다. 이상의 결과들을 종합하여, 항산화성 폴리페놀인 EGCG는 알코올성 췌장염으로 인한 세포의 손상이나 당뇨병 예방과 회복에 치료적 효과를 가질 수 있다고 제안한다.
본 연구에서는 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 하는 DNA 메틸화를 식이성 폴리페놀의 하나인 녹차의 대표적인 추출물 EGCG로 억제하였을 때 C2C12 myoblast 세포에 일어나는 현상을 살펴보았다. 그 결과 smooth muscle의 지표인 transgelin, smooth muscle ${\alpha}-actin$ mRNA와 단백질이 현저히 증가함을 보였고, 형태학적으로도 smooth muscle의 전형적인 모습을 보였다. 식이에 포함된 DNA 메틸화 억제제인 EGCG가 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 분화를 유도하였으며, 암 예방 차원에서의 EGCG의 역할 외에 혈관질환과 같은 smooth muscle에 관련된 예방과 치료차원에서 EGCG의 역할이 있을 것으로 사료된다. 본 연구는 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 유도하는 결정적인 신호전달 역할을 하는 유전자에 대한 연구는 수행하지 못하였다. 따라서 EGCG에 의해 변화되는 유전자에 대한 기전연구가 필요하다고 하겠다.
파이토케미컬의 일종인 EGCG는 녹차의 카테킨 성분으로, 세포 내 신호 경로 조절을 통하여 항산화, 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 hypoxia 상태인 B16F10 피부암 세포에서 HIF-$1{\alpha}$를 포함한 AMPK의 신호경로를 통하여 EGCG의 apoptosis 유도 효과를 규명하였다. AMPK는 hypoxia, 영양분 결핍, 운동, heat shock 등, 세포 내 ATP의 결핍에 의해서 활성화되며 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도한다. 세포에서 중요한 에너지 센서로서 작용하는 AMPK가 hypoxia 상태의 암세포 내에서는 HIF-$1{\alpha}$의 전사 활성을 유도하는데, HIF-$1{\alpha}$는 hypoxia 상태에서 산소 결핍에 반응하는 첫 번째 전사 조절인자로서 암세포의 생존을 위한 세포내 산소공급과 혈관신생형성을 조절한다. Hypoxia 상태가 아닌 B16F10 세포에서와 hypoxia 상태에서의 B16F10 세포에서 EGCG에 의한 apoptosis 효과를 관찰하였다. 실험 결과, hypoxia 상태에서 EGCG는 더 강한 apoptosis를 유도하며, 혈관신생형성을 조절할 수 있는 HIF-$1{\alpha}$의 전사 활성을 억제시킨다. 이러한 관찰을 통해 EGCG가 hypoxia 상태의 피부암 세포에서 암의 성장과 신생혈관형성을 저해하는 것으로 보인다. 이와 같은 연구는 향후 식품에 첨가된 파이토케미컬을 이용하여 암을 예방하는 연구에서 있어서, 도움이 될 것으로 여겨진다.
본 연구에서는 다양한 사람의 암세포주(SNU-601, MKN74, AGS, MCF-7, U87-MG 및 A-549)와 정상세포주 [MRC-5 섬유아세포, 사랑니 유래 중간엽 줄기세포(DSC), 3T3-L1 생쥐의 지방전구세포]에 녹차에 포함되어 있는 epigallocatechin-3-gallate (EGCG)를 처리하여 세포 증식, 세포 노화, 지방세포로의 분화, 말단소립복원효소 활성과 암세포의 전이 능력 등을 검증하여 항노화, 항비만 및 항암 효과를 서로 비교 조사하였다. MTT 분석에서 다양한 암세포주는 정상세포주보다 유의적으로 낮은 반억제농도값을 나타내었다. 10 uM의 EGCG가 포함된 배양액에서 정상체세포인 MRC-5와 DSC를 5 계대배양한 결과 세포증식 및 세포 노화에 큰 변화를 관찰하지 못하였고, 3T3-L1 생쥐의 지방전구세포를 지방분화 배양액에 EGCG를 첨가하여 지방세포로의 분화 억제를 유도하였지만 지방세포로의 분화를 역시 억제하지 못하였다. 그러나 여러 다양한 암세포주에 10 uM의 EGCG가 포함된 배양액에 배양한 결과 암세포의 세포증식 억제, 세포노화 유도, 말단소립복원효소 활성과 암세포의 전이 능력이 현저히 감소됨을 관찰하여 EGCG는 항노화나 항비만 효과보다는 항암효과에 더 효율적인 것으로 관찰되었고, 적당한 농도에서 잠재적인 항암물질로의 한 종류로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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