• The Korean Journal of Zoology
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• v.30 no.1
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• pp.89-98
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• 1987

The research of fused oocytes was conducted to investigate the in vitro mejotic maturation of immature oocytes (GV oocytes) fused with oocytes in germinal vesicle breakdown (GVBD oocytes) in the presence of dbcAMP which is known as one of the strong inhibitors to GVBD. The immature oocytes fused together as well as those fused with GVBD oocytes proceeded to GVBD in 3 hr culture in plain medium. But in the medium containing dbcAMP (100$\mu$g/ml), the immature oocytes fused together did not show any GVBD and thus the fusion itself could not affect the inhibitory activity of dbcAMP. However, all of the immature oocytes fused with GVBD oocytes underwent GVBD in 3 hr culture despite of the presence of dbcAMP. When the culture was extended to 20 hr, nearly all of the immature oocytes fused together were still arrested at the GV stage in the presence of dbcAMP. But most of the fused oocytes which had shown GVBD during 3 hr culture developed to metaphase II stage extruding one or two polar bodies regardless of the presence of dbcAMP. In this experiment, it was found that two sets of the metaphase chromosomes were somewhat concomitant with a pair of the polar bodies in the fused egg. Upon the results of the present studies, it is assumed that there may be a maturation promoting factor(s) in the cytoplasm of the GVBD occytes, and this factor(s) possibly nullifies the function of dbcAMP.

• The Korean Journal of Zoology
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• v.10 no.1
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• pp.1-9
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• 1967

본 실험은 4 일간의 성주기가 뚜렷한 성체인 golden hamster로부터 미성숙인 난자를 적출하여 화학적배양액내에서 그의 성숙을 유도시키고 성주기에 따른 미성숙 난자의 성렬율을 관찰하는 것을 주요 목적으로 하여 행하여졌다. 한 개의 난소로부터 5-6개의 미성숙 난자를 적출하여 5% bovine serum albumin이 섞인 TC Medium 199에 넣어서$CO_2$-incubator를 이용하여 6 시간내지 24시간 동안 37$^{\circ}C$를 유지해가며, 배양액이 직접 공기와접촉하는 것을 막기 위해 유동성인 paraffin oil로 배양액을 덮고서 배양을 완수했다. 실험의 결과를 다음과 같이 완수했다. 1. Hamster의 난자의 성숙분렬을 유발시키는데 가장 적합한 배양액은 BMOC, Eagle's Medium , Waymouth's Medium 그리고 TC Medium 199의 네가지 가운데 TC Medium199이었다. 즉 이 배양액을 이용했을 때 난자가 높은 성렬도를 보여주었다. 2. 5% bovine serum alumn을 TC Medium 199에 섞어주었을 때 미성숙 난자가 성순분렬을 유기하는 율이 가장 높았다. 3. 발정기에 있는 난소로부터 얻은 난자가 가장 현저하게 높은 율로 성숙분렬을 보여주었다. 반대로 발정후기의 난자는 배양 시작 후 단시간 내에 대부분이 퇴화하였으며 발정기에 가까워 갈수록 퇴화율이 줄어들었다. 이것은 노포가 성숙분렬을 억제하는 물질을 생성하리라고 여겨지고 있긴 \ulcorner만, 동시에 이 노포는 또 한편 난자의 배란뒤에까지도 생명력을 유지할수 있는 능력을 발정기에 이르기까지의 기간동안 난자에게 부여하며, 난자는 이 능력을 배란전까지 축적하게 되며 이 때문에 노포로부터 유리되어 나온 난자가 장기간 그 생명력을 유지해나가는 것이라고 추정된다. 4. Paraffin oil 로 공기를 차단하여서 배양한 난자나 혹은 watch glass를 이용하여 공기와 접촉시킨 난자에서나 모든 비슷한 율로 성숙분렬을 보여주었다. 이로 보아 조작이 까다로운 paraffin oil을 이용하는 방법보다는 손쉽게 배양할 수 있는 watch glass 의 방법이 오히려 유용하다고 할 수 있다.

• The Korean Journal of Zoology
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• v.37 no.2
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• pp.174-181
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• 1994

3 종의 한국산개구리를 사용하여 여포들이 생성하는 스테로이드와 난자의 성숙능이 번식기 근처에서 어떻게 변하는가를 조사하였다. 개구리의 여포를 생체외 배양하면서 이들이 뇌하수체추출물(frog pituitary homogenate, FPH) 혹은 CAMP의 자극으로 생성하는 progesterone(Pa)과 testosterone(T)의 양을 측정하여 이로부터 P4yT의 비율을 구하였으며 여포난자들이 FPH. P4 혹은 12-0-tetrsdecanoyl phorbol-13-acetate(TPA)에 반응하여 성숙을 일으키는 시기를 조사하였다. 북방산개구리의 여포난자는 11월 부터 호르몬에 반응하여 성숙을 일으켰으며 2월에 PJT의 비율이 급격히 증가하였다 참개구리는 5월에 가서of PJT의 비율이 현저히 증가하고 FPH에 반응하여 성숙을 일으켰다. 그러나 P4에 의한 난자성숙은 3월부터 시작하였다 옴개구리는 7월에 P4/T 비율의 증가가 있었으며 이때부터 또한 TPA에 반응하여 난자의 성숙을 일으켰다 따라서 3종의 개구리에서 모두 각각의 번식기 근처에서 PJT의 비가 급격히 증가하고 또한 성숙능이 생긴다는 것을 알 수있었다.

• The Korean Journal of Zoology
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• v.33 no.1
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• pp.53-62
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• 1990

Fully grown amphibian oocytes undergo their maturation (germinal vesicle breakdown, GVBD) during in vitro follicle culture when they are stimulated with frog pituitary homogenate (FPH) or progesterone. Present experiments were designed to determine whether proteolytic enzymes are involved in the regulation of the matunation process. Treatment of a $\alpha$ -chymoiyypsin inhibitor, N a -tosyl-L-phenylalanine-chloromethyl-ketone(TP) to the oocytes exhibited a biphasic phenomenon, the induction of the maturation without added hormone at relatively low doses (0.001-1 $\mu$M) and inhibition of the hormone induced oocyte maturation at a high dose (100 $\mu$M). Treatment of a trypsin inhibitor, N a -tosyl-L-lysine-chloromethyl ketone(TLCK) to the oocytes did not induce the maturation, but rather suppressed the hormone induced oocyte maturation in a high dose(100 $\mu$ M). Treatment of exogenous iyypsin to the oocyte induced their maturation without added hormone in a dose dependent manner (0.001-1 $\mu$ M). The data presented here indicate that some proteolytic enzymes play a role in the regulation of the maturation(meiotic arrest or reinitiation) in amphibians.

• Proceedings of the Korean Society of Developmental Biology Conference
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• 2003.10a
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• pp.87-87
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• 2003

난자성숙 중 MPF활성은 MI 과 MII에서 최대로, MII로의 성숙 직후 난자를 핵이식에 이용하는 것은 핵과 세포질 사이의 reprogramming에의 효율을 높일 수 있을 것이다. 일반적으로 돼지의 IVF나 핵이식은 체외성숙후 44h에 이뤄지고 있다. 이는 aging을 낳을 수 있고 aging은 또한 발달능을 떨어뜨릴 수 있다. 따라서, 본 실험은 돼지의 체외성숙시간에 따른 체외성숙율과 단위발생후 체외발달율을 비교하여 최적의 체외성숙시간을 찾고자 실시하였다. 돼지 난포란을 10% pFF, 0.1mg/ml cysteine, 10IU/ml PMSG, 10IU/ml hCG, 10ng/ml EGF가 첨가된 TCM-199배양액에서 22, 30, 44시간 동안 배양하여 성숙을 유도하였다. 체외성숙이 야기된 난자는 난구세포를 제거한 후 전기자극(2.0kv/cm, $30 \mu s$) 후 5분 동안 TCM-199에서 세정하고 다시 4시간 동안 6-DMAP에서 배양된 후 4mg/ml BSA가 첨가된 NCSU-23에 넣어 $39^{\circ}C$, 5% $CO_2$배양기에서 각각 6-7일 동안 배양을 실시하였다. 체외성숙 22시간 성숙난자는 M I 44.3%(35/79)와 A I -T I 36.7%(29/79)로 81%가 M II로의 성숙에는 아직 미치지 못했다. 30시간 성숙난자는 46.3%(56/121)가 M II로 성숙하였고, M I과 A I -T I 은 각각 25.6%(31/121), 27 3%(33/121)이었다. 44시간 성숙난자는 78%(71/91)가 M II로 성숙하였고, M I 과 A I -T I 은 각각 12.1%(31/121), 7 7%(33/121)이었다. 단위발생율은 22시간에 난할율은 35.4%(75/137)이었고, 배반포 발달은 없었다. 30시간에 난할율은 51.8%(145/280)이었고, 배반포 발달율은 5.5%(8/145)이었다. 44시간에 난할율은 80.0%(244/306)이었고, 배반포 발달율은 14.3%(35/144)이었다. 본 연구결과 핵 및 세포질의 완전한 성숙은 44h에 이루어지고, 이에 따른 배발달율도 뒤따름을 알 수 있었다. 난자가 핵성숙의 완성에도 불구하고 완전한 활성을 위한 발달능은 갖지 못함을 알 수 있었으며, 질 좋은 배반포 생산을 위해 핵과 세포질 성숙의 synchronous가 중요하다 사료된다. 체외성숙을 위한 배양기술의 진전과 더불어 체외성숙 시간에 따른 세포질적인 기전에 대한 연구가 필요하다.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.21 no.1
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• pp.29-34
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• 2006

본 연구는 개 체외성숙 난자를 안정적으로 생산하기 위하여 채취시기, 난구세포 부착 여부 및 배양액에 EGF와 호르몬을 첨가 후 배양했을 때 체외성숙율에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 미성숙 난포란을 TCM-199 배양액에서 24, 45시간 배양했을 때 체외성숙율은 각각 7.93%, 8.94%로서 48시간 배양했을 때 가장 높은 체외성숙율을 나타냈다. 2. 휴지기, 난포기, 황체기에 채취한 난소로부터 회수한 난자를 20 ng/ml의 EGF가 첨가된 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 14.3%로서 0, 10 ng/ml의 EGF 첨가군(3.1%, 7.5%)에 비해 높은 체외성숙율을 나타냈다. 3. 난구세포 부착 및 미부착 난자를 48시간 배양했을 때 체외성숙율은 각각 18.8% 및 7.5%로서 난구세포 부착 난자가 미부착 난자보다 높은 체외성숙율을 나타냈다. 4. 난자의 체외성숙 배양 시 0.5 mg/ml FSH, 5 mg/ml LH, 1 mg/ml $E_2$와 FSH+LH, $FSH+LH+E_2$를 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 각각 1.2%, 10.0%, 2.0%와 10.0%, 31.2%로서 호르몬의 병용처리군이 높은 체외성숙율을 나타냈다. 5. 난자의 체외성숙 배양 시 EGF와 FSH, LH, $E_2$ 및 EGF와 FSH+LH, $FSH+LH+E_2$를 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 32.3%, 27.0%, 3.0%와 36.2%, 69.4%로서 EGF와 호르몬 병용 처리군이 높은 체외성숙율을 나타냈다.

• The Korean Journal of Zoology
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• v.38 no.1
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• pp.96-105
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• 1995

본 연구는 옴개구리(Rana rugosa)의 생식주기를 파악하고 이들 난자들의 체외 성숙조건을 구하기 위하여 수행하였다 개구리들의 gonadosomatic index(G51)는 4월에서 8월사이에는 비교적 낮았고 9월에서 이듬해 3월까지는 높았다 여포들의 성장은 주로 6월에서 9월 사이에 이루어지는데 난소내에서도 여포들의 성장 속도는 일부 다른 것으로 나타났다. 야외 관찰에서 이 개구리들은 서식지의 온도에 따라 4월에서 7월 사이에 산란을 한다는 것과 10월에서 이듬해 3월까지 동면을 한다는 것을 말았다. 산란기에 취한 여포 난자들은 생체외 배양에서 progesterone에 성숙반응(germinal vesicle breakdown(GVBD))을 일으키지 않았다. 그러나 protein klnase C(PKC)의 촉진제인 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate(TPA) 혹은 Na+/K+ ATPase의 저해제인 ouabain을 progesterone과 동시에 처리했을 때에는 성숙반응을 일으켰다(각각 86%와 80%). TPA 로 핵붕괴를 일으킨 난자의 세포질을 미성숙 난자에 주입하면 미성숙 난자의 핵붕괴를 유도하였으며 성숙된 다른 종의 난자들의 세포질도 이와 같은 효과를 나타내었다. TPA의 성숙유도 효과는 5분의 노출 기간으로도 충분하였으며 PKC의 저해제인 H-7을 처리하면 그 효과가 없어졌다 이러한 결과들은 옴개구리의 난자는 호르몬에 성숙반응을 일으킨지 않으나 PKC 활성화 이후 단계는 정상이라는 것을 의미한다.

• Proceedings of the Korean Society of Developmental Biology Conference
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• 2003.10a
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• pp.142-142
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• 2003

TGF-$\beta$ super family는 난소를 포함하여 여러 기관 및 조직의 성장에 광범위하게 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, TGF-$\beta$ super family는 난자의 매우 초기에 영향을 미치며, 난포의 성장을 촉진하여 초기의 난자의 형태를 이루는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편 TIMP-1은 난관상피세포로부터 분비되는 난자의 생리활성 촉진인자로 보고되고 있다. 따라서 본 연구는 한우난포란의 체외성숙에 난자의 생리활성 촉진인자를 이용하여 한우 체외성숙 및 체외수정에 미치는 영향을 구명하고자 실시하였다. 한우 난포란은 도축암소의 난소를 채취하여 회수하였으며, 체외성숙은 HP-TCM를 기본 배양액으로 TGF-$\beta$ 0.1, 1, 10 ng/ml를 첨가하여 실시하였고, TIMP-1은 0.05, 0.5, 5ng/ml를 첨가하여 6, 12, 24시간 동안 체외성숙시켰다. 체외성숙된 난자는 체외성숙율을 검사하기 위하여, 0.1% aceto-orcein으로 염색을 실시하여 핵의 변화를 검사하였다. (중략)

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• v.16 no.1
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• pp.1-7
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• 1989

배양중인 생쥐 난자의 성숙에 미치는 배양액 내 calcim의 영향을 알아보기 위하여 1.71mM $Ca^{2+}$을 처리한 배양액과 $Ca^{2+}$이 존재하지 않는 배양액에서 난자를 배양하여 불꽃 원자 흡수 분광 광도계를 이용하여 배양된 난자의 $Ca^{2+}$농도를 측정하였다. 1) $Ca^{2+}$처리한 배양액에서 배양된 cumulus-cell이 제거된 (denuded oocyte)난자들은 시간이 지남에 따라 $Ca^{2+}$농도가 높게 나타났고, 2) $Ca^{2+}$처리하지 않은 배양액에서는 denuded난자는 3시간째 배양될때 부터 $Ca^{2+}$양이 줄어 들었다. Cumulus-enclosed난자는 $Ca^{2+}$존재하에서는 GVBD가 일어났다고 생각되는 4시간까지 계속 증가를 보인 반면 $Ca^{2+}-free$에서는 배양되지 않은 난자와 거의 차이가 없게 나타났다. 3) 핵막붕괴가 일어난 후부터 15시간까지 배양시컸을 때에는 CEO와 denuded oocyte에서 공히 $Ca^{2+}$의 농도는 다시 증가된 상태로 계속 되었다. 이런 결과로 미루어 보아 난자 성숙시 부터 성숙과정이 끝날때가지 exteral $Ca^{2+}$이 요구되고 있음을 증명해 주고있다. 그러나 이러한 세포질내의 $Ca^{2+}$및 bound calcium이 난자 성숙시부터 어떤 역활을 하고 있는 기작에 대해서는 좀 더 연구가 있어야겠다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• v.35 no.4
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• pp.285-291
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• 2008

Objective: This study was performed to investigate whether cumulus morphology and oocyte diameter influence on in vitro maturation (IVM) of human germinal vesicle (GV) stage oocytes obtained from stimulated in vitro fertilization (IVF) cycles. Methods: Forty-one GV stage oocytes were obtained from 21 patients who received ovarian hyperstimulation and IVF. According to cumulus morphology before denudation, GV oocytes were classified into oocytes with dispersed cumulus cells (CCs) or compacted CCs. The diameters of denuded oocytes, both including and excluding the zona pellucida, were measured. All oocytes were cultured in commercial IVM medium. Maturation was defined as extrusion of the first polar body and the matured oocytes were inseminated by ICSI method. Results: Overall maturation and fertilization rate were 56.1% and 73.9%. Matured oocytes had significantly higher proportion of oocytes with dispersed CCs compared to oocytes failed to mature (91.3% vs. 55.6%, p=0.023). There were no significant differences of oocytes outer ($155.7{\mu}m$ vs. $152.4{\mu}m$, NS), inner ($114.3{\mu}m$ vs. $113.4{\mu}m$, NS) diameters and zona thicknesses ($41.3{\mu}m$ vs. $39.1{\mu}m$, NS) between matured and not-matured oocytes. In-vitro maturation rate of oocytes with dispersed CCs was significantly higher than which of oocytes with compacted CCs (67.7% vs. 20.0%, p=0.044). Oocyte diameters (outer and inner) and thicknesses were not related with maturational competence. Conclusion: Our results suggest that in vitro maturational competence of GV stage oocytes obtained from stimulated IVF cycles is closely associated with the cumulus morphology but not oocyte diameter.