• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.265-273
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• 2004

본 연구는 mNCSU-23에서 체외성숙시킨 난자를 이용하여 돼지 체외수정시 적절한 배양액과 정자농도를 구명하고자 수행하였다. 정액은 액상정액을 이용하였고 체외수정배양액으로 mTBM과 mTLP-PVA, 정자농도는 운동정자수 5${\times}$$10^4$, 1${\times}$$10^{5}$ , 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$로 체외수정 한 다음 NCSU-23에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 체외성숙란을 mTBM 또는 mTLP-PVA에서 운동정자수 1${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$로 체외수정시킨 다음 체외발달시킨 결과, 정자침투율, 웅성전핵형성율, 다정자수정발생율, 난분할율, 배반포 발달율 등 어느 것도 두 배양액간 차이를 나타내지 않았다. 2. 체외성숙란을 mTBM에서 운동정자수 5${\times}$$10^4$, 1${\times}$$10^{5}$ , 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$l로 체외수정시킨 다음 체외발달시킨 결과, 정자침투율, 웅성전 핵형성율, 다정자수정발생율 등은 모두 정자 농도간 유의적인 차이를 보였고(P<0.05), 난 분할율과 배 반포발달율은 5${\times}$$10^4$이 1${\times}$$10^{5}$ , 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$보다 유의 적으로 낮았으나(P<0.01), 1${\times}$$10^{5}$ 와 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$ 간에는 차이가 없었다. 따라서, 액상정액을 이용한 돼지 체외성숙란의 체외수정배양액으로 mTBM과 mTLP-PVA간 차이는 없으며, mTBM에서 체외수정시킬 때 정자농도는 운동정자수로 1${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$가 적절할 것으로 사료된다.

• 한국임상수의학회지
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• 제31권5호
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• pp.394-402
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• 2014

본 연구의 목적은 예측 불가능한 만성적인 스트레스가 생식기능과 황체형성호르몬 수용체의 발현에 미치는 영향을 알아보는 것이다. 9 주령 암컷 C57BL/6 마우스를 무작위로 선택하여 대조군과 스트레스군의 두 집단으로 분류하였다. 스트레스군은 35일 동안 하루에 두 번씩 12가지의 서로 다른 스트레스를 무작위로 선택하여 스트레스를 주었다. 대조군에 비하여 스트레스군에서 불안과 관련된 행동들이 유의성 있게 증가하였으며(P < 0.05), 스트레스를 받는 동안의 증체율 또한 유의성 있게 감소하였다(P < 0.01). 그리고 평균 산자수도 대조군에 비하여 스트레스 군에서 유의하게 감소함을 관찰 하였다(P < 0.01). 조직학적인 검사에서 일차, 이차 및 초기 성숙 난포의 비율이 대조군에 비해 스트레스 군에서 유의하게 감소한 반면(P < 0.05) 폐쇄 난포의 비율은 유의하게 증가하였다(P < 0.01). 면역조직화학적 검사를 통해 과립막세포와 황체세포의 황체형성호르몬 수용체 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 스트레스군에서 그 발현이 감소하였고, 웨스턴 블롯을 통해 난소 내 황체형성호르몬 수용체의 단백질 양을 측정한 결과 또한 대조군에 비하여 스트레스군에서 유의하게 감소하였다(P < 0.05). 본 연구를 통해 난소의 황체형성호르몬 수용체는 예측 불가능한 스트레스에 의해 영향을 받으며, 변화된 황체형성호르몬 수용체가 난자의 난포 발육 불량과 생식기능의 이상에 영향을 미친다는 것을 실험적으로 증명하였다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제5권1호
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• pp.47-52
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• 2001

X, Y정자를 분리하여(sexing techlology)필요한 성을 조절한 배아의 연구가 아직 실용화되지 않고 있다 본 연구는 이에 대한 기초연구로서 돼지의 X 정자와 Y정자를 분리하기 위하여 불연속 percoll농도구배를 제조한 후 상층에 정액을 분주하여 120${\times}$g에서 20분간 원심분리 하였다. 분리된 각 층의 정자를 회수(7${\times}$10$^6$ sperms/ml)하여 genomic DNA를 추출한후, PCR 방법을 이용하여 Y 염색체의 성 결정 유전자(TDF)인 SRY(sex determining region of Y chromosome) 유무를 판단하였다. TCM-199배양액에 성숙시킨 난자와 분리하지 않은 정자를 대조군으로, 분리한 X 정자를 실험군으로 인공수정을 한 후 돼지 체외 수정란을 획득하였다. 체외 생산된 2세포기의 배아의 SRY 유전자를 PCR증폭하여 성 판별에 사용하였다. 불연속 percoll 원심분리 후 정자의 생존율은 95%층에서 94.4% ${\pm}$ 5.1% (P < 0.01)로써 가장 높았다. 체외수정한 결과 분리하지 않은 대조군(47.1%)보다 자성정자가 많다고 판단되는 실험군에서 수정율이 높았다(80%).불연속 percoll 원심분리 후 SRY유전자의 PCR을 실시한 결과 30%, 50%, 65%농도에서 80%, 95% 농도보다 Y 염색체 특이적인 밴드가 많이 증폭되는 것을 확인하여 상층에 Y 염색체를 가지는 웅성 정자가 많이 있으며 하층에 X 염색체를 가치는 자성정자가 많이 있는것으로 확인하였다. 또한 95% 농도 층의 정자를 인공수정한 초기배아의 자성은 66.7%로서 대조군 33.3%보다 높았다. 따라서 불연속 percoll 원심분리 후 80%, 95%층에서 X 정자가 많이 회수되고, 활동성이 증가하는 것뿐만 아니라 정자의 질도 개선할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

• Applied Microscopy
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• 제7권1호
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• pp.21-43
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• 1977

This experiment was undertaken in order to localize the labeled dbcAMP (dibutyryl cyclic AMP) in oocytes whose development has been suppressed by cold dbcAMP for 6 or 19 hours in vitro. Mouse oocytes were obtained from the ovaries of 3-4 week old A strain female mice, by puncturing the Graafian follicles in the modified Krebs-Ringer bicarbonate salt solution under the dissecting microscope. Those oocytes which have intact germinal vesicle were cultured in the basic culture medium supplemented with 0.4% bovine serum albumin (BSA). Cultivation of the oocytes was carried out in a microtube developed by Cho (1974). The cultures were then incubated in a humidified 5% $CO_2$ incubator maintained at $37^{\circ}C$ for 6 or 19 hours (Donahue, 1968). DbcAMP was added to culture medium for a final concentration of 100ug/ml, and $^3H-dbc$ AMP (specific activity 13 Ci/mM) for a final concentration of $40{\mu}Ci/ml$ was also added to the medium. For electron microscopic autoradiography, those oocytes recovered from the culture were washed with phosphate buffer (pH 7.4), and immediately prefixed in a 2.5% glutaraldehyde overnight and postfixed for 2 hours at $4 ^{\circ}C$ in 1% osmium tetroxide in phosphate buffer with pH 7.4 (Palade, 1952). After fixation, the materials were dehydrated in graded alcohol series and embedded in Epon 812 mixture based on the standard procedures (Luft, 1961). The thin sections $600-700{\AA}$ thick were mounted on the grids of 200 meshes. The grids containing sections were coated with a nuclear emulsion Kodak NTB-3 and stored in a cold dark box (at $4^{\circ}C$) for 3 weeks. After exposure, the samples were developed with Kodak D-19 and stained with uranyl acetate and lead citrate. Routine observation was made with Hitachi HU-11E electron microsocope. The results of the observation were as followings: 1. It was found that the labeled dbcAMP penetrated the egg plasma membrane and dispersed at random in the cytoplasm. 2. It was also observed that most of the labeled dbcAMP was attached to microfibrillar lattices portion of the oocyte cytoplasm. There fore, it is presumed that the receptor of the dbcAMP is localized in the microfibrillar lattices of the oocyte. 3. It also seems that some other cell organells such as mitochondria, Golgi complex, cortical granules are not directly related to the action of the dbcAMP. 4. The labeled dbcAMP was neither observed in the membrane nor in the nucleus. Therefore, it seems that there is no relationship between the concentration of dbcAMP and the nuclear membranous permeability. 5. There was no difference in number of dbcAMP particles when oocytes were cultured for 6 hours and 19 hours. 6. However, it was observed that, in same of the oocytes suppressed in germinal vesicle by dbcAMP for 19 hours, cell organells were moved and concentrated to a small portion of the cytoplasm, and that the morphology of the organells greatly changed to an abnormal. form. Therefore, it is supposed that those oocytes were in the process of degeneration. From the above results, it is expected that dbcAMP penetrated the egg membrane and was bound to the receptor which seems to be located in the microfibrillar lattiees portion, and that this dbcAMP-receptor complex inhibited some enzyme system of the oocytes which are essential for the germinal vesicle breakdown.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권3호
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• pp.289-296
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• 2008

BPES($\underline{B}$lepharophimosis/$\underline{P}$tosis/$\underline{E}$picanthus inversus $\underline{S}$yndrome)는 FOXL2 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 우성질환이다. 눈꺼풀이 갈라지거나 쳐지고 넓은 미간이 나타나는 특징이 있으며, 여성의 조기 난소 부전증(premature ovarian failure, POF)을 일으켜 불임을 유발한다. FOXL2는 forkhead family에 속하는 전사인자로서 FOXL2가 결여된 난소에서는 granulosa cell의 분화가 진행되지 않아 난포 성숙과정의 멈춤과 난자의 폐쇄증을 유발한다. FOXL2를 bait로 하여 rat의 난소 cDNA 라이브러리의 yeast two-hybrid screening을 시행하여 FOXL2 단백질과 상호작용을 하는 small ubiquitin-related modifier(SUMO)-conjugating E2 효소인 UBE2I 단백질을 찾았다. UBC9이라고도 알려진 UBE2I 단백질은 SUMO 변형 과정을 위한 필수적인 단백질이다. Sumoylation은 수 많은 전사인자의 전사능력의 조절을 포함하여 다양한 신호전달체계에 관여하는 번역 후 변형 과정이다. 본 연구에서 인간세포인 293T 내에서 면역침전반응 실험을 통해 FOXL2와 UBE2I의 단백질-단백질간의 상호작용을 확인하고, FOXL2의 돌연변이형을 제작하여 yeast two-hybrid system을 이용해 UBE2I와 결합에 필요한 FOXL2의 부분을 규명하였다. 따라서, FOX2에 상호작용하는 UBE2I의 규명은 sumoylation에 의한 FOXL2의 새로운 조절 메커니즘을 시사한다.