Lipase(E.C. 3.1.1.3)는 triglyceride의 ester 결합을 가수분해하여 glycerol과 지방산을 생성하거나 기질에 특이적으로 계합성하는 효소로, lipase의 생산 및 용도의 개발에 관한 많은 연구가 진행되어져 왔다(Macrae et al., 1985). 미생물 유래의 lipase는 기존의 화학적인 처리에 의한 생산물을 얻을 때 생기는 여러 부산물에 대한 문제를 해결할 수 있고, 일단 순수한 형태로 분리된 균주는 배양조건이 수립되면 원하는 시간에 필요한 양의 균체를 유용물질의 원료로 공급하여 생산 작업의 규모도 필요에 의해 증대할 수 있다. (중략)
우리나라에서 쉽게 얻을 수 있는 각종 섬유소 폐기물을 유일한 탄소원으로 하여 전보에서 분리 동정한 섬유소 자화 세균 Cellulomonas flavigena KIST 321을 배양하여 균단백의 생산에 대하여 살펴본 결과는 다음과 같다. 1) 당류를 탄소원으로 했을 때 cellulose꼭 xylose에서 균체생성량이 제일 많았다.(중략)
Undigested cellulosic substrate was frequently replaced with new substrate during fermentation. About 3-fold increase in cell density could be obtained by changing the substrate.
이산화탄소 측정기 및 제어기를 사용하여 글루탐산 발효공정의 자동화 방법을 개발하였다. 이는 발효배기가스 중의 이산화탄소와 균체의 성장 간에 직선관계가 있고 따라서 적절한 균체농도에서 페니실린 투여를 자동화할 수 있었다. 페니실린 투여 후 균체성장 및 글루탐산 생성의 고농도당에 대한 저해작용을 감소시켜 주기 위한 방법으로서 회분식 추가당 첨가공정을 자동화할 수 있었으며, 그 결과로서 회분식 발효에 비하여 생산성과 수율이 향상되었다.
본 연구에서는 담자균류의 일종인 Agaricus blazei를 이용한 polysaccharide의 생성을 증가시키고자 glutamic acid의 첨가시기의 영향을 비교${\cdot}$검토하였다. 그결과 2 g/L의 glutamic acid를 배양 4일째인 대수증식기에 첨가하여 polysaccharide 생성을 유도한 경우 배양 7일째에 12.9 g/L의 균체량과 9.1 g/L의 polysaccharide를 생성하였다. 그러나 이런한결과는 배양 초기에 glutamic acid를 첨가했을경우와 비교하여 볼 때 균체량은 다소 증가 했으나 polysaccharide 생성량에 있어서는 거의 유사한 결과를 나타내는 것이다. 생물반응기를 이용한 회분배양에 있어서도 2 g/L의 glutamic acid를 대수증식기인 배양 4일째에 첨가한 경우 균체량은 13.5 g/L, polysaccharide 생성량은 9.9 g/L를 생산하여 배양결과 최대 생산량을 나타내었다.
황색포도상구균이 Capsular polysaccharide (CPS)는 백혈구의 탐식에 저항하기 때문에 젖소의 유방염 발생의 중요한 병원상 인자로 오랫동안 연구자들의 관심이 집중되어 왔다. 따라서 CPS는 젖소의 유방염을 최소화시키기 위한 유방염 백신개발에 있어 잠재적인 백신 항원물질로 알려져 왔다. 본 연구의 복적은 황색포도상구균의 CPS 항원물질을 좀더 효과적으로 발현시키고 향후 백신항원으로 사용시 좀 더 간편하게 정제하는 방법을 찾아보고자 본 연구를 수행하였다. CPS는 락토스와 덱스트로스를 첨가한 brain heart infusion media 에서도 부분적으로 발현되었지만 CPS가 가장 잘 발현되는 배지 조건은 젖소 유래의 유청을 10% 첨가한 조건에서 가장 발현율이 높았다. 또한 CPS발현은 salt agglutination test, india ink법 및 투과전자현미경을 이용하여 확인하였으며 균체표면의 hydrophobicity에서는 락토스, 덱스트로스 및 젖소 유래의 유청을 첨가한 배지조건에서 다른 조건에 비해 높았다. CPS의 가장 손쉬운 검사법은 균체를 절편하지 않고 직접 투과전자현미경상에서 염색없이 관찰하는 것이 가장 간편한 방법이었다. CPS정제는 상층액을 농축시킨후 이온교환크로마토그라피와 젤 여과법을 이용하여 정제하였으며 CPS의 분자량은 대부분 97kDa이상이었다. CPS 회수율은 배지와 균체 1리터당 1.5mg이었다. 결론적으로 CPS를 백신항원으로 포함하고자 할 경우, CPS의 최적 발현조건은 젖소 유래의 유청을 10% 첨가한 Brain heart infusion 배지에서 배양하여 사용하는 것이 가장 좋은 방법이라고 생각된다.
절간고구마원료주정폐액을 이용하여 단세포단백질을 생산함과 동시에 폐액의 BOD를 제거할 목적으로 우수효모를 선발하고, 선발된 효모의 배양조건을 검토한 후 3$\ell$ -jar fermenter에 의한 통기 배양을 한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 폐액을 여과한 여액의 조성은 BOD$_{5}$ 15700ppm, COD 36800ppm, 환원당 3300ppm, 총질소 710ppm, 고형물51800ppm, 조회분390ppm이었다. 우수효모로 선발된 Torulopsis candida FRI YA-15를 $25^{\circ}C$에서 48시간 진탕배양하였을 때, 배양폐액에 대한 균체수율은 3.38g/$\ell$, BOD$_{5}$ 및 COD제거율은 각각 38.9%, 31.8%이었다. T. candida의 최적생육초기 pH는 4.0이었으며, 최적배양온도는 35$^{\circ}C$였다. 설정된 초기PH 및 온도하에서 3$\ell$-jar fermenter를 사용하여 통기량 2vvm, 교반속도 100rpm으로 배양하였을 때, 배양 28시간후에 최대로 생육하였으며, 그 때 배양액에 대한 균체수율은 3.2g/$\ell$였다. 건조균체의 조단백질함량은 47.98%였다.
네 종류의 질소원 yeast extract, sodium glutamate, peptone, tryptone과 각 질소원의 농도 및 포도당의 초기 농도가 해양 미생물 Thraustochytrium aureum ATCC 34304의 linoleic acid 생산성에 미치는 영향을 규명하여 다음의 결과를 얻었다. 초기 당 농도를 10 g/L로 하고 질소원으로는 sodium glutamate를 사용하였을 때 균체 단위 질량에 대해 생성된 지질의 중량 분율이 최대값 0.302 mg/g를 나타내었으며, 균체에 대한 linoleic acid 중량 분율도 8%로 최대값을 나타내었다. Lino-leic acid의 생성속도는 질소원으로 peptone과 sodium gluta-mate를 사용하였을 경우 다른 질소원으로 peptone과 sodium gluta-mate를 사용하였을 경우 다른 질소원을 사용하였을 때 보다 2.5 배까지 높은 수치를 나타내었다. 초기 당 농도가 증가하면 linoleic acid의 생산성은 상승하나 당 농도 30 g/L 이상에서는 그 상승폭이 대단히 완만하였다. 초기 당 농도가 30 g/L 경우 질소원으로 peptone을 사용하였을 때는 linoleic acid의 생산량이 200 mg/L, sodium glutamate를 사용하였을 때는 130 mg/L를 나타내었다. 질소원의 농도가 증가하면 균체 내에 생성되는 지질의 양도 증가하는 경향을 나타내었다. 질소원이 sodium glutamate인 경우 농도 1 g/L까지는 지질의 함량이 뚜렷한 증가현상을 나타내었으나 농도 1.0 내지 2.0 g/L 이상에서는 질소원의 농도가 증가하면 지질의 생성량이 감소하였다.
Poly(ethylene glycol)/salt가 형성하는 액상 2상계에서 균체내 효소인 $\beta$-galactosidase 분리를 최적화하는 실험을 수행하였다. L. sporogenes에 의해 생산된 $\beta$-galactosidase의 분획은 2상계를 형성하는 PEG 분자량이 작을수록 상층부로 이동하였으며, 상층부 PEG 농도가 증가할 때 salting-out 현상이 나타나서 단백질 뿐아니라 $\beta$-galactosidase는 상층부로 크게 이동하였다. 또한 균체내 효소 정제에서 문제가 되는 세포벽잔사(cell debris)들은 조성이 binodial line에 접근할수록 효소 fraction과 반대방향으로 이동되었다. PEG-salt를 이용한 $\beta$-galactosidase 분리는 조성을 binodial line레 접근시키면서 동시에 상층부의 부피를 줄이는 것이 효과적이었다. PEG1000, 300을 각각 단계적으로 이용한 2단계 추출(two-step extraction)로써 세포벽 잔사, bulk protein, 색소물질 및 핵산 등을 제거할 수 있었으며, 이때 효소의 회수율은 74%, 단백질 회수율 35%로서 정제도는 2 배 이상의 효과를 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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