본 연구에서는 실리콘 실란트 총 6종을 제작하여 곰팡이 저항성 시험 방법인 ASTM G 21, LH 전문 시방(LHCS 41 40 12) 시험과 신규 제정된 KS F ISO 21265 시험법에 따라 곰팡이 저항성을 평가하였다. 그 결과, KS F ISO 21265 시험법이 ASTM G 21과 LH 전문 시방(LHCS 41 40 12) 시험법에 비해 곰팡이 저항성 평가에 대한 변별성이 더 큰 것으로 판단되었으며, 알콕시 경화형 실란트에 비해 옥심 경화형 실란트의 곰팡이 저항성이 더 큼을 확인하였다. 또한, KS F ISO 21265 시험법에서는 50℃에서 4주간 침수 후 곰팡이 저항성을 평가하는 조건 도입을 통해 실란트의 장기적인 곰팡이 저항성 평가가 가능할 것으로 판단된다.
작물 병해충에 대한 무공해 미생물 농약 개발의 일환으로 곤충 병원성 곰팡이 Metarhizium anisopliae의 분자생물학적 육종을 위해 이 균주의 형질전환계를 확립하였다. M. anisopliae의 원형질체를 제작하여 benomyl 약제에 대하여 저항성을 나타내는 Aspergillus flavus 유래의 ${\beta}-tubulin$ 유전자를 갖는 pBRG-4 plasmid DNA를 polyethylene glycol 방법으로 형질 전환하였다. 이 형질전환은 pBRG-4 DNA $50\;{\mu}g$당 10개의 효율로 이루어졌으며, 그 결과 야생형 균주들의 $2.5\;{\mu}g/ml$ 농도의 benomyl 존재 하에서도 성장이 억제되는데 반하여 선발된 형질전환체들은 $5.0\;{\mu}g/ml$ 농도의 benomyl 함유 배지에서도 잘 성장하였다. 또한 이 형질전환체들의 chromosomal DNA를 분리하여 Southern 분석한 결과 ${\beta}-tubulin$ 유전자가 homologous recombination에 의하여 M. anisopliae의 genome속에 삽입 되었음을 확인하였다.
목재의 탄화과정 산물인 목탄과 목초액의 농업적 이용의 일환으로 고추 생육 및 토양미생물에 미치는 영향을 조사하였다. 목탄과 목초액을 토양에 처리할 경우 토양을 중성으로 개량하는데 효과적이고 토양의 이화학적성질이 유용 미생물이 생육하기에 적합한 환경조건으로 변화되어 토양내 유용미생물의 밀도 증가로 나타났다. 고추의 생육에 있어서도 탄화물 처리로 고추모의 길이, 직경생장 및 고추 결과 수가 증가되었다. 특히 결과 수에서는 목탄 1kg, 목초액 1000배액 및 세균처리에 의하여 대조구보다 약 50% 정도의 증수 효과를 나타냈다. 고추모의 길이 및 줄기직경 증가는 노지에서 여러 가지 환경 변화 요인에 대한 저항성을 갖게 하여 최종 수확량의 증대로 나타날 것으로 사료된다. 고추 탄저병균에 대한 길항성 실험에서는 목초액 농도 2배, 10배에서는 곰팡이가 사멸되었고, 100배, 1000배 희석농도에서는 대조구보다 성장 속도가 둔화되었다.
본 연구는 치어기 넙치 사료내 성장 및 면역 증강을 위한 사료 첨가제로서 송강약돌의 이용가능성을 알아보기 위해 성장실험, Ε. tarda복강주사에 의한 누적생존율 조사, Α. niger, Ρ. piilophilum, C. globosum에 대한 항곰파이 효과 실험이 실시되었다. 첫 번째 성장실험에서는 8주동안 평균무게 4.7$\pm$0.04g (mean$\pm$SD) 실험어를 40 L 사각 수조에 각 실험구 당 각각 25 마리씩 3반복으로 무작위 배치하여 실시하였다. 실험사료는 송강약들을 사료내 0, 0.5, 1.0, 2.0%수준으로 첨가하여 제작되었으며, 일일 사료공급량은 어체중의 4∼5%를 1일 2회 공급하였다. 8주간의 실험결과, 성장률, 사료효율 등 성장효과에 대해서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 헤모글로빈(4.66∼4.98 g/ 100 ㎗), 헤마토크리트(20.7∼24.7%), 총단백질(4.3∼4.6 g/㎗), 트리글리세라이드(327∼366mg/㎗), GOT (49.4∼50.3IU/L), GPT (14.2∼14.4IU/L)와 글루코스(37.3∼49.7 mg/㎗)함량에 있어서도 모든 실험구에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 또한 전어체의 일반성분 조성에서도 유의차가 없었다. 두번째 Ε. tarda 복강주사에 의한 누적생존율 조사 실험은 박테리아 부유물을 0.1$m\ell$씩 복강 주사한 후 누적생존율을 기록하였다. 13일 후에 SGS$_{50}$ 은 72.7%의 생존율을 나타났으며, SGS$_{1.0}$ 은 22.2%, SGS$_{2.0}$ 은 16.7%, SGS$_{0}$ 은 0%의 누적생존율이 나타났다. 세 번째 실험은 Α. niger, Ρ. pinophiium, C. globosum에 대한 사료의 항 곰팡이 효과 실험이었다. 곰팡이 접종후, 4주 후에 사료내 송강약돌 첨가시 곰팡이의 성장을 인지 할 수 없었다. 따라서, 상기결과에 의하여 치어기 넙치에 있어서 사료내 송강약돌 0.5%첨가하였을때 성장 및 사료효율의 저하없이 질병저항성 및 항균제로서 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.
작물 근권 토양으로부터 분리한 5,000여 길항 균주로부터 Erwinia 및 Pseudomonas등의 세균과 Trichoderma, Colletotrichum 등 곰팡이의 성장을 동시에 억제하는 Bacillus sp. N 32 균주를 선발 동정 하였다. 특히 Bacillus sp. N32 균주는 고추 탄저병균인 Colletotrichum gloeosporioides에 대하여 열에 저항성이 있는 단백질과 열에 민감한 단백질의 2종류의 항균 단백질을 동시에 생산함을 단백질 침전과 활성 검정을 통하여 확인하였다. 이 항균 단백질들을 FPLC를 이용한 gel filtration chromatography방법으로 분리한 후 SDS-PAGE와 bioautography로 항균력을 확인하였다. 또한 이 항균 단백질의 유전자들을 선발하기 위하여 기존의 알려진 그람양성 세균의 대표적인 열 저항성 항균 펩타이드 생합성 유전자 서열을 primer로 이용한 PCR 방법으로 fengycin의 생합성 유전자 단편을 분리하고 이 PCR 산물을 이용하여 Bacillus sp. N32 균주의 cosmid library로부터 fengycin의 생합성 유전자 cluster중 일부를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 또한 열에 민감한 항균 단백질 생산 유전자는 이 항균 단백질을 SDS-PAGE 및 electroblotting으로 분리한 뒤 N-terminal 부위의 15개의 아미노산 서열을 분석하고 이를 DNA 염기배열로 치환한 다음 probe로 이용하여 ${\lambda}-ZAP$ library로부터 항균 단백질 생산 유전자가 포함된 다수의 clone을 선발하였다.
붉은곰팡이병은 곡류의 중요한 병이며 Fusarium graminearum species complex (FGSC)에 속하는 균들에 의해 발생한다. 맥류 재배 농가들은 이 병을 방제하기 위해 탈메틸화 억제제인 triazole계 살균제를 살포한다. 본 연구는 FGSC 집단에서 triazole계 살균제인 propiconazole에 대한 감수성의 변화를 조사하기 위해 수행되었다. 2010-2016년과 2020-2021년 동안 전남북의 보리와 밀에서 124개와 350개의 FGSC 균주를 각각 분리하였다. 균주들의 종 동정 및 트리코테센 독소화학형은 각각 translation elongation factor 1-alpha 및 TRI12 유전자를 표적으로 하는 PCR 분석을 기반으로 결정되었다. propiconazole에 대한 민감도는 한천 희석법을 사용하여 균사체 성장을 50% 감소시키는 유효 농도(EC50)를 기준으로 결정되었다. 모든 균주에서 nivalenol 독소화학형의 F. asiaticum이 가장 많았으며(2010-2016년 83.9%, 2020-2021년 96.0%), 3-acetyl deoxynivalenol 독소화학형의 F. asiaticum (2010-2016년 12.1%, 2020-2021년 2.9%)이 그 다음이었다. 2010-2016년과 2020-2021년에 수집된 균주의 EC50 값은 각각 0.0180-11.0166 ㎍/mL 및 1.3104-17.9587 ㎍/mL 범위였으며, 평균 EC50 값은 2010-2016년 3.8648 ㎍/mL에서 2020-2021년 5.9635 ㎍/mL로 증가했다. 2010-2016년 균주의 EC50 값을 바탕으로 7.0 ㎍/mL을 저항성 기준으로 정하였고, 저항성 균주의 수는 2010-2016년 9.7%에서 2020-2021년 28.6%로 증가한 것으로 나타났다.
본 연구는 항진균성 천연물 의약품을 개발하기 위한 생물자원의 연구로서 미나리아재비과에 속한 여러 한약재의 항진균활성을 새롭게 검증하고 비교하는 것을 목표로 한다. 한약재에서 진균류 생장을 저해하는 물질을 효과적으로 추출하는 방법을 찾고 추출물들에 포함된 항진균성 유용 물질을 탐색하였다. 위령선, 황련, 백두옹 한약재의 열수 추출 및 유기용매 추출을 진행하여 액체배지에서 항진균활성을 측정하였을 때 클로로포름 분획물에서 효과적인 결과를 얻었다. 또한 단세포성 진균인 Candida albicans, Candida tropi- calis, Candida lusitaniae 그리고 사상성 곰팡이인 Pythium ultimum KACC 40705, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum을 대상으로 고체배지에서 disc diffusion 실험으로 진균 성장 저해 실험을 수행하였다. 백두옹 추출물은 Candida spp.에 대해서, 위령선은 사상성 곰팡에 대해서 우수한 항진균활성을 가지고 있다는 것으로 확인했다. 마지막으로 추출물에 존재하는 항진균성 유용물질을 탐색하기 위해 GC-MS 분석을 진행하였다. 연구 결과 미나리아재비과의 한약재에서 항진균활성을 확인할 수 있었으며 위령선에서 thur- berogenone, 황련에서 16-HCDO를 항진균성 후보물질로서 확인하였다. 결론적으로 백두옹, 위령선 및 황련은 다양한 진균류에 대하여 항진균활성을 가지고 있음을 확인하였으며, GC-MS 분석에서 세 한약재 모두 서로 다른 항진균성 후보물질을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 미나리아재비과 생물자원이 진균류 저항성에 대해 여러 방향으로 진화되었음을 나타낸다.
C. polykrikoides의 항생제에 대한 특이성을 알아보기 위해 C. polykrikoides의 항생제에 대한 $50\%$ 생존시간을 조사하였다. C. polykrikoides는 tetracycline과 thlorarnphe-nicol에 대해서는 아주 민감하였고, polymixin-B, ampicil-lin, penicillin-G, dihydrostreptomycin, neomycin에 대 해 서 는 저항성이 큰 선택적 특이성을 가졌다. C. polykrikoides에 민감한 항생제인 tetracycline과 chloramphenicol의 경우는 사멸곡선을 분석하여 사멸에 영향을 주지 않는 농도를 확인했으며, 또한, 농도에 따른 C. polykrikoidess에 대한 항생제의 작용특성을 분석하였다. 박테리아에 오염된 C. polykrikoides 배양액을 percoll 원심분리로 박테리아를 제거하기 전에 C. polykrikoides에 저항성이 큰 항생제에 대한 박테리아 군집의 감수성 시험을 행하여 박테리아 제거를 위한 적당한 항생제와 농도를 결정 한 뒤, percoll 원심분리로 박테리아와 곰팡이를 제거하고, 조체를 회수한 후, 남아있는 소량의 박테리아를 감수성이 큰 항생제를 연속적으로 처리 (antibiotic cascade)하여 C. polykrikoides의 순수배양(axonic culture)이 가능하게 되었다. 순수배양한 C. polykrikoides은 밀도가 약 740cells/ml 이상에서 대수증식기에 접어들었고 최대 5,800cells/ml까지 증식하였다. C. polykrikoides의 하루당 분열율 k 값은 저밀도 세포 상태에서 아주 정확한 증식지표를 제시하였고, 대수증식기 전에 반드시 최대의 k 값 변화를 가진 세포의 밀도가 존재하였으며, 우리는 이 최대 k 값 변화를 가진 밀도를 정확한 적조 예보와 초기에 적조제어를 위한 모델로서 사용될 수 있음을 제시한다. 결론적으로 본 연구에서 확립된 C. polykrikoides의 순수분리에 의한 배양방법은 C. polykrikoides 뿐만 아니라 다른 적조 생물의 독성학적, 면역학적, 생화학적, 생태학적, 분자생물학적 연구를 위해 편리하게 이용할 수 있을 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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