국내에서 대량생산될 수 있는 자생가능한 자원인 배추의 비전통적 이용을 위해 배추즙액에 효모 Candida utilis를 배양하여 단세포단백을 생산하는 연구를 하였다. 배추의 당함량은 $2.1{\sim}4.0%$의 범위에 있었고 배추원액을 그대로 사용하여 C. utilis를 배양했을 때보다는 배추즙액을 적절히 희석하여 배양하였을 때 증식속도가 빨라졌고 소비된 당에 대한 건조균체생산율도 17%에서 약 50% 정도로 향상되었다. 배추즙액에 C. utilis를 배양하여 단세포단백을 생산하고자 할 때는 당의 함량이 1.0% 정도로 희석하는 것이 적절하였고 당함량을 1.0%되게 조정한 배추희석액에 영양원을 첨가하여 그 영향을 평가해 보았을 때 glucose, $KH_2PO_4$나 $(NH_4)_2SO_4$는 첨가효과가 없거나 오히려 균체생산량을 감소시킨데 비하여 yeast extract나 peptone은 건조균체 생산 및 균체의 단백질 함량을 $10{\sim}20%$씩 증가시키는 효과가 있었으나 yeast extract나 peptone의 첨가량에 비해 건조균체생산량의 증가가 적어서 배추즙희석액 자체로만도 효모배양을 위한 좋은 기질임이 확인되었다.
전분이용성 세포융합 효모를 이용하여 단세포단백질 생산을 위한 기초실험을 행하였다. 전분배지에서 균체생성이 우수한 fusant12 균주의 배양조건은 최적질소원 (NH$_4$)$_2$SO$_4$ 0.1%, 최적 soluble starch 농도 7%, 최적 초기pH5.6이었다. Fusant12균체의 자기소화에 의한 가용성 단백질의 추출은 효모현탁액에 ethyl acetate를 5%(v/ v)되게 첨가하여 30min간 액화전처리과정을 행하므로 효과적으로 얻을 수 있었다. 전분이용성 효모인 fusant 12균주와 비전분이용성 효모인 Torulopsis candida의 혼합배양으로 균체생성량을 증가시킬 수 있었으며, 혼합배양시 종균접종혼합비는 6대4일 때 효과적이었다. Fusant 12균주 단독 및 Torulopsis candida와의 혼합배양시 tapioca 배지에서의 균체생성량은 soluble starch 배지에서 보다 약 2.5배 증가하였다. 건조균체의 조단백질함량은 39%, 핵산함량은 5.8%이고 균체단백질은 FAO 표준단백질과 비교하여 필수아미노산중 methionine 함량이 낮으며, Iysine 함량은 높았다.
본 연구에서는 새로운 자당대체제인 투라노스의 동결건조 과정에서 빵효모로 널리 활용되고 있는 S. cerevisiae에 대한 동결보호 효과를 평가하였다. 빵효모 세포의 생존율은 동결보호제로서 투라노스를 첨가함에 따라 증가되는 것을 확인하였으며, 세포표면의 손상을 동결로부터 보호해주는 것을 규명하였다. 또한, 탈지유가 포함된 투라노스는 냉동보관 시(-20℃), 빵효모의 생존력이 크게 향상되는 것으로 확인되었으며, 이는 빵효모의 유통 과정에서 우수한 보존 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 투라노스는 동결보호 능력이 강화된 신개념의 소재로서 활용이 기대된다.
효모를 최적 배양조건에서 키운후 $1.14{\times}10_-3 M$의 셀레늄을 배양액에 가하여 24시간 배양한 후 효모를 얻는다. 효모의 건조중량에 대하여 약 $0.1{\%}$(w/w)이상의 셀레늄을 함유하는 고농도의 셀레늄-효모를 얻었고 세포벽에 부착된 무기셀레늄은 세척후 MBRT과정으로 확인하였다. MBRT에서 15분 이상 푸른색이 지속되는 결과로 무기이온의 세포벽 흡착이 거의 없음을 확인하였다. 셀레늄이 함유된 효모를 초음파로 분해한 후 $80{\%}(NH_4)_2SO_4$ 용액을 이용하여 단백질을 부분 정제하였고 ICP-AES로 측정된 효모내의 셀레늄 농도와 비교하였을 때 약 $60.6{\%}$의 셀레늄이 단백질 내에 존재함을 확인하였다. 전기이동으로 단백질을 분리하여 확인한 결과 많은 양이 발현된 단백질 띠에서는 상대적으로 셀레늄의 농도가 높았다. 그중 47 kDa 단백질의 경우 69.5 ${\mu}$g Se/g의 농도로 가장 많은 함량을 보였다. 이 단백질을 PVDF 막에 electroblotting하여 분리하였고 이를 산으로 가수분해하여 얻어진 아미노산들을 PITC와 반응시켜 유도체를 얻었다. 아미노산유도체들을 HPLC로 분리 확인한 결과 셀레노메티오닌의 상대적인 비율이 총아미노산의 $2{\%}$로 얻어졌다. 이러한 셀레늄은 단백질과 킬레이트의 형태로 존재하는 것이 아니고 대부분이 셀레늄의 유기체인 셀레노메티오닌으로 효모 내에서 생합성 된다고 볼 수 있다.
한국산 rotifer, B. plicatilis, S-type를 대상으로 식물부유생물, 농축 Chlorella 및 효모류에 대한 내구란 생산과 먹이 종류에 따라 생산된 내구란의 부화율을 조사하였다. 4 종류(Chlorella ellipsoidea, Nannochloris oculata, Tetraselmis suecica, Pavlova lutheri) 가운데 N. oculata는 3,760개/20 ml로 가장 많은 내구란을 생산하였다. 그러나 식물부유생물 종류에 따른 부화율의 유의적인 차이는 없었다. 9 종류의 농축먹이(유지효모, 빵효모, 두 종류의 해수산 농축 냉장 Chlorella, 해수산 냉동 Chlorella, 냉동 해수산 Chlorella ($70\%$)+ 빵효모($30\%$), 냉동 해수산 Chlorella ($30\%$)+ 빵효모($70\%$), 두 종류의 냉장 담수산 Chlorella)에서 내구란 생산이 가장 많은 먹이는 냉동 Chlorella($30\%$)+빵효모($70\%$)와 냉장 담수산 Chlorella에서 각각 283개/ml로 나타났다. Rotifer $10^4$개체와 건조 먹이 1 mg당 내구란 생산은 냉동 Chlorella ($30\%$)+빵효모($70\%$)에서 각각 5,566개와 2,131개로 가장 높게 나타났다. 농축 먹이에 따른 내구란의 부화율은 유지효모가 $67.4\%$로 가장 높았다. 본 연구의 결과, 경제적인 내구란 생산을 위하여 빵효모와 농축 냉동 Chlorella를 혼합하여 공급하는 것이 효과적인 것으로 판단된다.
절간고구마 주정폐액은 여과가 용이하고, 유기질 함량이 높으며 pH가 효모의 생육에 적합하여 미생물의 단세포 단백질(single cell protein) 생산을 위한 기질로 적합하였다. 본 실험에 사용한 Candida boidinii는 토양으로부터 분리된 고구마 주정폐액 자화성이 가장 우수한 균주로서, 72시간 배양하였을 때 배지 100ml당 1.02g의 건조균체량을 얻을 수 있었으며, 이 때의 조단백질 함량은 54.5%였다. 효모의 생육은 pH 5.0과 $30^{\circ}C$에서 72시간 배양하였을 때 최대에 달하였고 urea 0.2%와 무기염류를 첨가하면 생육이 촉진되었다.
재조합 효모를 이용한 hirudin 발효생산조건의 최적화 연구를 수행하였다. Hirudin 유전자는 GAL10 promoter와 MFal 분비신호, GAL7 terminator와 결합되어 있다. 재조합 효모의 성장속도와 hirudin 최종 농도를 증가시키기 위하여 최적의 배지조성과 배양조건을 결정하였다. 최적의 배지조성과 배양조건은 yeast extract 40g/$\ell$, casamino acid 5g/$\ell$, 포도당 20g/$\ell$, galactose 30g/$\ell$, DO 50%, 온도 $30^{\circ}C$였다. 이 조건으로 2.5$\ell$ 발효조에서 회분식배양을 수행한 결과 비성장속도는 $0.13hr^{-1}$, 최종 건조균체농도는 30g cell/$\ell$, 최종 hirudin 농도는 64mg/$\ell$로 나타났다.
Arthrobacter luteus로부터 분리(分離)한 zymolyase 조효소(粗酵素) 표품(標品)의 효모(酵母) 세포벽(細胞壁)에 대한 용해(溶解) 활성(活性)을 측정(測定)함에 있어서, 보다 적합(適合)한 조건(條件)을 찾기 위하여, 맥아즙(麥芽汁) 배지(培地)에서, 진탕 배양(培養)한 S. sake의 용해(溶解)에 관여(關與)하는 제(諸) 인자(因子)의 영향(影響)을 검사(檢射)하였다. 1. 본(本) 용해(溶解) 효소(酵素)에 대한 S. sake 생세포(生細胞)의 용해(溶解) 감수성(感受性)은 대수(對數) 증식기(增殖期)의 세포(細胞)는 높았고, 지체기 및 정상기(定常期)의 세포(細胞)는 낮았다. 그 중에서 특(特)히 18시간(時間) 배양(培養)된 세포(細胞)는 가장 높은 용해(溶解) 감수성(感受性)을 보였다. 2. 본(本) 용해(溶解) 효소(酵素)는 S. sake의 생세포(生細胞)에 대해서 아주 낮은 용해(溶解) 활성(活性)을 나타냈으나, 효모(酵母) 세포(細胞)를 아유산(亞硫酸) 소-다(0.05 M)로 전처리(前處理)하므로서 그 용해(溶解) 활성(活性)은 4배(倍) 이상(以上)으로 증가(增加)되었다. 3. 시중(市中)의 빵 효모(酵母)에 대해 본(本 ) 용해(溶解) 효소(酵素)의 활성(活性)은 지급히 미약(微弱)하였고 아유산(亞硫酸) 소다의 효과(效果)도 약하였다. 4. 동결(凍結) 건조(乾燥)시킨 빵 효모(酵母)의 세포(細胞)는 생세포(生細胞)의 경우 보다 높은 용해(溶解) 감수성(感受性)을 보였다. 그러나 동결(凍結) 건조(乾燥) 세포(細胞)의 경우, S. sake나 빵 효모(酵母)의 그 어느 세포(細胞)도 아유산(亞硫酸) 소-다에 의한 용해(溶解) 감수성(感受性)의 영향(影響)은 인정(認定)되지 않았다. 5. 효모(酵母) 세포벽(細胞壁) 용해(溶解)에 있어서, 그 반응(反應) 속도(速度)와 조효소(粗酵素)의 농도(濃度)와의 관계(關係)는 효소(酵素) 반응(反應) 속도론(速度論)에 준(準)하는 경향(傾向)을 보이는 것 같았으나, 반응(反應) 속도(速度)와 효모(酵母) 세포(細胞)의 농도(濃度)와의 관계(關係)는 효소(酵素) 반응(反應) 속도론(速度論)과는 다른 패턴을 보여주었다. 6. 0.05 M phoshate buffer (pH 7.5)에 용해(溶解)시킨 zymolyase 조세포(粗細胞) 표품(標品)을 $7^{\circ}C$에서 10일간(日間) 보존(保存) 시킨 결과(結果), 용해(溶解) 활성(活性)의 잔존(殘存)율은 약(約) 80 %였다.
복분자주 양조에 있어서 대표적인 활성 건조 효모 5종을 선정하여 효모 균주간의 특성 및 복분자 품종(RCM, RCB)간의 성분 차이를 알아보기 위한 연구 결과는 다음과 같다. 1. 고창 복분자(RCM)주의 에탄을 함량은 Lanvin Wl5 균주로 발효된 복분자주가 $15.3\%$로 가장 높았고, Prise de Mousse 균주로 발효된 복분자주가 $14.4\%$로 가장 낮았다. 2. RCM주의 pH는 $3.58\~3.63$으로 효모 균주에 따른 차이는 별로 없었고, RCB주의 pH는 3.98로 더 높았다. 3. RCM주의 총산은 Montrachet 균주로 발효된 복분자주가 1.46 g/100 mL로 제일 높았고, 휘발산은Pasteur champagne 균주로 발효된 것이 0.111 g/100 mL로 제일 높았다. 4. Nonflavonoid phenols는 RCM 주중의 Montrachet 균주로 발효된 것이 1,850 mg/L로 가장 높았고, flavonoid phenol과 total phenol은 Epernay II 균주로 발효된 RCM주가 2,820 mg/L, 4,600 mg/L로 가장 높았다. 5. RCM주의 유기산 함량은 구연산>수산>사과산 순으로 많았고, 주석산은 검출되지 않았다. 6. RCM주에 있어서 사과산의 평균 함량은 malo-lactic fermentation후에 거의 $65.5\%$ 감소하였으며, Prise de Mousse 균주로 발효된 RCM주의 ma-lolactic fermentation 후의 사과산의 감소율은 약 $73.3\%$로 가장 높았으며, Epernay II 균주로 발효된 RCM주의 malolactic fermentation 후의 사과산의 감소율은 $59.1\%$로 가장 낮았다.
우리나라에서 풍부하게 생산될 수 있으면서 흔히 과잉생산되어 문제가 되는 배추를 이용한 단세포단백 생산에 관한 연구를 하였다. Saccharomyces cerevisiae와 Candida utilis 공히 배추즙액에 잘 번식하였으며 $30^{\circ}C$에서 20시간 이내에 번식이 완결되었다. 이들 효모의 최종 건조균체량은 동결시킨 후 해동된 배추를 이용하거나 동결 되지 않은 배추의 즙액을 이용하거나 차이가 없었는데 S. cerevisiae와 C. utilis는 각각 4.3g/l 및 5.1g/l의 건조균체를 생산하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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