재래종 황색계자두 효소와 4종류의 polyphenol 화합물과 반응시켜 얻어진 효소적 갈변반응 생성물에 대하여 변이원성 및 변이원 억제작용에 관한 실험결과 B. subtilis H17과 M45 두 균주를 이용한 rec-assay에서 4종류의 갈변반응 생성물 모두 변이원성은 없었다. rec-assay에서 금속이온의 영향을 실험한 결과 pyrogallol의 갈변반응 생성물의 경우 $Fe^{3+},\;Mn^{2+},\;Zn^{2+},\;Ni^{2+}\;Al^{2+}$에서 약한 영향을 받았으며 hydroxyhydroquinone의 갈변반응 생성물에서는 $Cu^{2+},\;Pb^{2+}$, 그리고 catechol의 갈변반응 생성물에서는 $Mn^{2+}$ 공존하에서 약한 영향을 받았다. DNA절단실험 결과 갈변반응 생성물 자체에 의해서는 4종류의 시료 모두 DNA절단능력은 없었다. 금속이온의 영향에서는 $Fe^{2+}$의 경우 그 자체에 의해 절단되었으며 $Cu^{2+}$은 DNA 절단을 촉진하는 것으로 나타났다. S-9 mix를 첨가한 돌연변이 유발실험에서는 4종류의 갈변반응 생성물 모두 농도증가에도 변이원성은 없었으며 변이원 물질인 $benzo\;{\alpha}\;pyrene$에 대한 돌연변이원 억제반응에서는 4종류의 갈변반응 생성물 모두 농도증가에 따라 대조구에 비해 강한 억제작용을 나타냈다. 따라서 재래종 황색계 자두로부터 추출한 polyphenol oxidase와 4종류의 polyphenol 화합물과 반응시켜 얻어진 효소적 갈변반응 생성물의 들연변이원성 실험결과 갈변반응 생성물자체에 의한 돌연변이원성은 없었으며 금속이온의 영향도 받지 않는 것으로 나타났으나 강력한 발암물질인 $benzo\;{\alpha}\;pyrene$을 사용한 돌연변이 억제실험에서는 4종류의 갈변반응 생성물 모두 강한 돌연변이 억제작용이 있음을 알 수 있었다.
청국장 점질물인 PGA의 갈변 및 갈변 반응물질의 분획에 따른 갈변도와 전자 공여능에 따른 항산화력을 알아보았다. PGA의 갈변은 자체적으로는 갈변이 잘 일어나지 않고, 염기적 조건 하에서 glucose을 첨가하고 가열하면 갈변이 급격하게 일어나며 전자 공여능 또한 높게 나타났다. 염기적 조건 하에서 얻은 PGA 갈변 반응 물질(Glu-PGA, pH 8.2)을 Sephadex G-50을 이용하여 분획하고, 분획에 따른 갈변도 및 DPPH를 이용한 전자 공여능을 측정하였다. 분획된 갈변 반응 물질들은 비교적 광범위한 갈변도 및 전자 공여능을 보여 주었다. 이들 중 갈변도 및 전자 공여능이 상대적으로 높은 F-7과 F-20의 UV-VIS 흡수대에 있어서는 F-20은 멜라노이딘의 흡수대인 260-320nm에 걸쳐 완만한 흡수곡선을 나타내었고, F-7은 270nm 부근에서 특징적인 최대 흡수대를 나타내었다. 두 분획 물질의 분자량은 SDS-PAGE로 분석한 결과 F-7은 대략 35kDa 이상으로 나타났고, F-20은 SDS-PAGE상에서 뚜렷한 크기는 알 수 없었으나, F-7 보다는 비교적 저분자량을 갖는 물질이라는 것을 알 수 있었다.
재래종 적색 자두 (Prunus salicina)에서 효소를 추출하여 4종류의 polyphenol화합물과 반응시켜 얻어진 갈변반응 생성물에 대하여 Bacillus subtilis H17과 M45를 이용한 rec-assay와 Salmonella typhimurium TA98과 TA100 두 균주를 이용한 Ames test, 그리고 calfcthymus DNA를 이용하는 DNA절단시험을 이용하여 돌연변이원성과 돌연변이 억제작용을 조사하였다. 포자 rec-assay 에서는 pyrogallol, hydroxyhydroquinone, 3,4-dihydroxytoluene, chlorogenic acid 의 갈변반응 생성물은 모두 DNA손상능력이 없었으며 8가지 금속이온 중 ${Zn}^{2+}$과 ${Ni}^{2+}$의 첨가로 고초균 DNA손상에 약한 영향을 나타내었다. DNA절단시험 결과 4종류 갈변반응 생성물 모두 DNA절단작용이 없었으며 금속이온의 영향에 있어서는 pyrogallol 갈변반응 생성물이 ${Cu}^{2+}$의 영향을 받아 ${Cu}^{2+}$의 농도가 증가함에 따라 강한 절단작용을 나타내었으며 3,4-dihydroxytoluene 과 hydroxyhydroquinone갈변반응 생성물은 금속이온의 영향을 전혀 받지 않았다. 또한 chlorogenic acid갈변반응 생성물은 DNA 절단을 억제하는 효과를 나타내었다. Ames test에서는 4가지 갈변반응 생성물 모두 변이원성은 없었으며 benzo$[{\alpha}]$pyrene을 사용한 변이원성 억제작용 실험결과 benzo$[{\alpha}]$pyrene의 활성을 강하게 억제하는 것으로 나타났다.
pH7.0으로 조절한 2M의 AsA 용액을 $85^{\circ}C$에서 25시간 갈변반응시켜서 생성된 물질 중 항산화효과를 지닌 물질을 분리하고 성질을 조사하였다. 투석내액 및 투석외액 갈변반응물질 모두 항산화성이 존재하였고 투석외액 갈변반응물질의 항산화효과가 더 크게 나타났다. 투석외액 갈변반응물질을 gel 여과하여 분리된 3가지 획분(A, B, C)중 갈변도가 가장 높고 환원력이 가장 낮은 획분(C)의 항산화효과가 가장 크게 나타났다. 항산화성이 중간정도인 획분(B)은 환원력의 세기와 갈변도가 세획분중 중간정도에 속하였고 환원력은 가장 높고 갈변도가 가장 낮은 획분(A)은 항산화효과가 가장 낮았다. UV-Visible spectrum에서 A획분과 B획분은 각각 266.1 및 257.4nm에서 최대흡광 peak를 나타냈으나 C획분은 274.8nm에서 약한 peak를 나타내었다. IR-spectrum 조사결과 A, B 및 C획분 모두 hydroxy 및 carboxylic group이 존재하였고 항산화성이 큰 B와 C분획은 carboxylic ester이었다.
전통발효 식품인 간장으로부터 chitinase활성이 높으면서 갈변반응을 일으키는 균주인 CJ-3를 분리하여 갈변반응생성물이 면역기능, 항산화력 및 세포활성에 미치는 영향과 생화학적 특성을 규명하였다. 분리된 CJ-3 균주는 16S rDNA 염기서열분석에 의하여 Bacillus atrophaeus로 동정되었으며 분리된 균주의 분자량은 대략 31.0 kDa으로 colloidal chitin(0.5, 1.0, 2.0%)의 첨가에 의하여 chitinase 활성이 현저히 증가되었다 B. atrophaeus CJ-3에 의해서 유도되는 갈변반응물 200${\mu}\ell$ 첨가로 LPS에 의하여 유도되는 nitric oxide (NO) 활성을 45%까지 감소시켰다. MTT 분석을 통한 세포활성에서도 갈변반응물은 LPS에 의하여 세포활성을 정상수준으로 회복하였다. CJ-3. 균주의 DPPH 전자공여능법에 의한 항산화력은 갈변반응에 의하여 약 55% 증가하였다 . 이러한 결과들은 갈변반응생성물은 면역기능 및 세포활성을 증가시키는 것으로 추정된다. 분리된 균주의 최적 생육조건은 최적온도 37$^{\circ}C$, 최적 pH 7.0 및 염 농도는 9% NaCl농도까지는 잘 생육하는 것으로 나타났으며 분리된 균주의 주요 intracellular 유리아미노산은 glutamate로 나타났다.
농산물의 수확 후 취급이나 가공중에 일어나는 효소적갈변 현상은 외관의 변색에 의한 소비자의 기호성을 저하시킬 뿐만 아니라 상품의 가치를 하락시키며, 경제적인 손실을 초래함으로서 현재 식품에 종사하는 기술자나 가공업자에게 가장 관심이 있는 분야이다. 효소적갈변의 주역을 담당하고 있는 polyphenol oxidase(PPO)(EC1.14, 18.1)은 대부분의 식품에 존재하고 있으며 monophenol의 hydroxylation에 의한 o-diphenol화합물의 형성반응(cresolase)과 o-diphenol화합물의 o-quinone으로의 산화반응(catecholase)을 촉배한다. 그리고 여기서 일단 생성된 o-quinone은 다시 다른 o-quinone이나 그밖의 단백질, 아미노산, 환원당 등의 여러 성분들과 상호 반응하여 갈변식품의 특유의 색소인 melanine을 형성한다. 효소적갈변에 의한 품질의 저하는 식품가공산업에서 해결되어야 할 하나의 큰 과제이다. 현재까지 식품산업에서 가장 널리 쓰이고 있는 효소적갈변 저해제는 sylfite류 이다. 그들은 새우의melanosis(blackspot)를 억제하며, 감자, 버섯, 사과와 다른 과채류의 갈변을 방지할 뿐 아니라 쥬우스와 포도주의 off flavors를 일으키는 폴리페놀 플리머의 형성을 감소 시킨다. 그러나 최근 sulfite가 사람의 건강에 좋지않는 부작용을 일으키며, 특히 천식을(asthma)을 지니고 있는 사람이 sulfite가 함유된 식품을 먹었을 경우 사망을 초래할 수 있어 식품첨가물로서 그들의 사용이 미국 FDA에 의해 재평가되고 있다. 최근에 FDA는 셀러드바에서의 sulfite사용을 금지 시켰으며 점차 감자가공품에의 사용을 금지하는 방향으로 나아가고 있다. 따라서 현재 실질적이고 기능적인 sulfite의 대체 화합물의 개발이 절실히 필요한 실정이다. 이러한 배경으로 본 강연에서는 효소적갈변 저해제의 개발과 그들의 식품가공에의 적용 현환 및 화장품, 의약품으로의 응용에 대해 설명하고자 한다.
갈변표고버섯을 건강기능성 식품산업의 소재로 활용할 수 있는 가능성을 탐색하기 위하여 환원력과 세포 내 활성산소종에 대한 억제효과, 페놀화합물 및 피틴산의 함량, 대식세포의 NO 라디칼과 matrix metalloproteinase9(MMP9) 생성에 대한 제어작용 및 항변이원성을 생리활성의 지표로 갈변반응이 건강기능성에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, 에탄올추출물의 환원력이 열수추출물보다 전반적으로 우수하였으며 3.32 mg/ml 농도에서 갈변반응은 표고버섯의 환원력이 28%까지 증가시켰다. 갈변과정에서 페놀화합물의 함량은 생표고버섯에 비하여 73%정도 증가된 반면, 피틴산의 함량에 유의한 변화는 일어나지 않았다. 표고버섯 에탄올추출물의 처리는 $100\;{\mu}g/ml$의 시료농도에서 LPS 자극에 의한 대식세포의 NO 생성을 43% 이상 증진시킨 반면 열수추출물은 오히려 17%이상 억제시키는 것으로 나타났으나, 갈변반응이 용매별 추출분획의 NO 및 MMP9의 생성을 제어하는 경향에 변화를 일으키니 않았다. 또한 SOS chromotest를 이용한 항돌연변이 활성의 측정 결과도 mitomycin C가 유발한 돌변변이에 대한 표고버섯 추출물의 억제효과에 갈변반응이 큰 영향을 주지 않았다. 이상의 실험 결과는 상품성을 상실한 갈변표고버섯도 다양한 건강기능성 가공식품의 개발을 위한 원자재로 소비될 수 있음을 시사한다.
대두발효식품의 갈변현상을 확인하기 위하여 간장발효액에 포도당과 티로신을 따로 또는 함께 첨가하여 152일간 발효시키면서 이들이 갈변에 미치는 영향과 동시에 산소존재여부가 갈변에 미치는 영향과 동시에 산소존재여부가 갈변에 주는 영향을 연구하였다. 포도당은 그 자체만으로나 또는 티로신과 함께 첨가되었을때 pH를 낮추었음은 물론 갈변을 저해하는 것으로 밝혀졌고 티로신만을 첨가하였을 때는 pH에는 영향을 주지 않았으나 발효후기에 갈변을 촉진시켰다. 산소의 존재하에 발효시킨 간장액은 산소가 없는 상태에서 발효시킨 간장액의 갈변과 비교했을때 산소가 있는 상태에서 발효시킨 것이 현저히 높은 갈변을 나타내었다. 대두발효식품의 갈변에는 산소가 없이도 이루어지는 마이야르반응과 티로신과 산소가 첨가되었을 때의 갈변증가가 그렇지 않은 때보다 많은 것으로 보아 효소적갈변반응이 마이야르반응보다 더 중요함을 알 수 있다.
옥수수 전분에 의한 casein과 포도당간의 갈변반응 저지효과를 검토하기 위하여 반응물에 전분을 15% 첨가한 용액을 냉동 건조하여 전분 보호막을 설치하는 방법으로 casein만 보호한 경우, casein과 포도당을 동시에 보호한 경우, 동시보호시 자당을 첨가한 경우와 무보호 경우 등으로 구분하여 RH 67%, 저장온도 $37^{\circ}C,\;42^{\circ}C$ 및 $50^{\circ}C$에서 30일간 저장하여 갈변반응을 시킨 후 비갈변구를 대조구로 하여 갈색도를 측정 하였다. 전분 보초효과를 인정할 수 있는 유의차를 보인 $37^{\circ}C$ 저장 경우에 한하여 아미노산 함량변화, in vitro 아미노산 소화율, in vitro available lysine 함량 및 fructosy1-lysine생성량 등을 조사한 결과는 다음과 같다. 아미노산의 함량은 16g질소당 g으로 표시하였을 경우 Arg과 Cys을 제외하고는 전분 첨가에 관계없이 갈변에 의하여 증가하였고 전분 첨가효과는 없었다. In vitro 아미노산의 소화율은 총 필수 및 비필수아미노산에 있어서 전분첨가에 관계없이 갈변에 의하여 $6.0{\sim}11.7%$ 및 $3.7{\sim}5.9%$ 감소하였고 개별 아미노산의 경우 lysine이 $32.7{\sim}45.4%$ 감소하여 갈변에 의한 가장 격심한 소화율 감소를 나타내었다. 전분 첨가에 의한 보호효과를 보면 전분 및 자당을 동시 첨가한 자당첨가동시보호구가 무보호갈변 경우에 비하여 18.5%의 lysine 소화율 증가를 나타내었다. In vitro available lysine의 함량은 전분첨가에 관계없이 갈변에 의하여 $27.8{\sim}40.0%$ 감소하였고. 전분 첨가에 의한 보호효과를 보면 전분과 자당을 동시첨가한 자당첨가동시보호구가 무보호 갈변경우에 비하여 20.5%정도 증가하였다. Fructosyl-lysine의 함량은 전분 첨가에 관계없이 갈변에 의하여 10배 이상 증가하였고 전분 첨가에 의한 보호효과를 보면 보호 방법에 관계없이 보호구가 무보호 갈변구에 비하여 $12.6{\sim}15.8%$ 정도 감소하였다.
우육에 7.5%의 당을 첨가하고 $121^{\circ}C$에서 가열처리하여 단백질 추출량의 변화를 알아보았다. 갈변반응은 가열시간이 길어짐에 따라 심하게 발생하였으며 glucose 첨가에서 가상 심하게 발생하였다. 단백질의 추출량은 전체적으로 가열시간이 길어질수록 감소하였으며 갈변반응이 심하게 발생한 glucose 첨가구에서 크게 감소하였다. 시료에 peptidase를 작용시켰을 때 단백질 추출량은 거의 변화가 없었으며, chymotrypsin을 작용시켰을때 단백질 추출량이 많이 증가하였으나, glucose 첨가구에서는 약간의 증가만 나타내었고 trypsin을 작용시켰을 때 전체적으로 chymotrysin을 작용시켰을 때보다 단백질 추출량이 많이 증가하는 경향을 나타내었다. Peptidase, chymotrypsin 및 trypsin을 동시에 작용시켰을 때에는 단백질 추출량이 상당히 증가하였지만 갈변반응이 심하게 발생하였던 glucose 첨가구에서는 약간의 증가만 나타내었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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