커피 찌꺼기 오일을 이용한 medium-chain-length Polyhydroxylalkanoate생합성

Biosynthesis of Medium-chain-length Polyhydroxylalkanoate Using Extracted Oil from Spent Coffee Grounds

Abstract

본 연구에서는 medium-chain-length polyhydroxyalkanoate (mcl-PHA)의 생산비용을 줄이기 위해 커피 찌꺼기(spent coffee grounds, SCG)에서 추출한 오일을 탄소원으로 사용하여 mcl-PHA를 생합성하였다. 2시간의 추출 시간과 SCG/n-hexane 15 비율에서 최고 오일 수율을 달성하였으며, 추출된 오일(extracted oil from SCG, EOC)의 지방산 조성은 리놀레산(45.08%), 팔미트산(35.56%), 올레산(8.62%), 스테아르산(7.62%)으로 확인되었다. 토양에서 분리한 Pseudomonas sp. HY61 균주를 플라스크 배양 결과, EOC 5 g/l, 72 시간, NH₄Cl, pH 7, 25℃ 및 C/N 비율 15의 배양 조건에서 가장 높은 세포 성장과 mcl-PHA 축적을 보였다. 동일 조건으로 회분식 배양 결과 배양 72시간 후, 건조 세포 중량(dry cell weight, DCW) 0.92 g/l와 mcl-PHA 0.17 g/l를 확인하였다. EOC와 NH₄Cl을 각각 18, 30 및 42 시간에 추가 공급한 유가식 배양 결과 2.85 g/l의 DCW와 0.67 g/l의 mcl-PHA를 얻을 수 있었으며, 이는 회분식 발효에 비해 약 3배 더 높은 수치였다. 물리적 특성 분석 결과, 본 연구에서 합성된 mcl-PHA는 다른 mcl-PHA에 비해 더 높은 분자량과 열분해 온도를 보여 포장 및 생의학적 응용에서의 잠재적인 사용 가능성을 시사하였다.

This study aimed to produce medium-chain-length polyhydroxyalkanoates (mcl-PHA) using oil extracted from spent coffee grounds (SCG) as a carbon source. The highest oil yields, 14.40%(w/w) and 14.49%(w/w), were achieved with an extraction time of 2 hr and an SCG/n-hexane ratio of 15:1. The fatty acid composition of the extracted SCG oil (EOC) primarily consisted of linoleic acid (45.08%), palmitic acid (35.56%), oleic acid (8.62%), and stearic acid (7.62%). Pseudomonas sp. HY61, isolated from soil, was used to biosynthesize mcl-PHA composed of 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate using EOC. Under optimal flask conditions, the highest cell growth and mcl-PHA accumulation were observed with 5 g/l EOC, 72 hr, with NH₄Cl as the nitrogen source, at pH 7, 25℃, and a C/N ratio of 15:1. Batch fermentation resulted in a dry cell weight (DCW) of 0.92 g/l and mcl-PHA of 0.17 g/l after 72 hr. In contrast, fed-batch fermentation, with additional supplementation of EOC and NH₄Cl at 18, 30, and 42 hr, increased the DCW to 2.85 g/l and mcl-PHA accumulation to 0.67 g/l, approximately three times higher than batch fermentation. Gas chromatography confirmed that the mcl-PHA structure was consistent across both fermentation modes. The synthesized mcl-PHA had higher molecular weight and thermal decomposition temperatures compared to other mcl-PHA, suggesting its potential applications in packaging and biomedical fields. This study offers an economical approach for mcl-PHA production using waste EOC and Pseudomonas sp. HY61.

서론

석유화학 기반 플라스틱 생산량은 1950년 150만 톤에서 2019년 4억 6천만 톤으로 증가했다. 2019년 기준 플라스틱 재활용률은 9%로, 50%는 매립, 19%는 소각, 22%는 통제되지 않은 쓰레기장에 폐기되거나 환경에 누출된다. 현재 추세가 지속되면 2050년에는 120억 톤의 플라스틱 폐기물이 환경에 매립될 것으로 예상된다[9]. 플라스틱은 분해가 어려우며, 연소 시 환경오염을 유발한다[20]. 이에 따라 플라스틱 폐기물 오염을 해결하기 위해 생분해성 바이오 플라스틱 연구가 진행되고 있다.

Polyhydroxyalkanoates (PHAs)는 영양소가 부족한 조건에서 과잉 탄소원이 있을 때 미생물 세포 내에 축적되는 탄소 저장물질로, 생체적합성과 생분해성이 뛰어나 석유 화학 기반 플라스틱의 대체제로 주목받고 있다[12, 18]. PHAs는 3번 탄소의 키랄 탄소를 중심으로 hydroxyl group, carboxyl group, R group으로 구성되며, R group에 따라 다양한 단량체가 합성된다[22]. PHAs는 600‒35,000개의 (R)-hydroxy fatty acid 단량체가 중합체를 이루며 약 150종이 보고되었다[18]. PHAs는 단량체의 탄소 원자 수에 따라 short-chain-length PHA (scl-PHA; C₃-C₅)와 medium-chain-length PHA (mcl-PHA; C₆-C₁₄)로 분류되며[22], 높은 결정성과 녹는점을 갖는 scl-PHAs와 달리 탄성을 지닌 mcl-PHA는 의학 및 생의학 분야에 적합한 것으로 보고되고 있다[12, 23].

PHAs는 생체적합성과 생분해성을 지녔으나, 석유화학 기반 플라스틱보다 생산비용이 5‒10배 높아 경제적 생산이 어렵다[6, 18]. 일반적으로 포도당이나 자당을 사용하여생산하며, 탄소 기질 비용이 전체 생산비용의 50% 이상을 차지한다. 이를 해결하기 위해 식물 바이오매스(plant biomass) [3], 슬러지(sludge) [14]와 같은 저렴한 탄소원을 이용한 PHAs 생산 연구가 진행되었다. 식물 유래 오일은 지방산(fatty acid) 단위로 구성되어있어 PHAs 전구체로 사용될 수 있으며, β-산화 경로를 통해 mcl-PHA로 전환될 수 있다[8, 12].

커피는 석유 다음으로 큰 무역 상품으로, 2015년 전 세계 커피 소비량은 약 9백만 톤에 달한다[5]. 커피찌꺼기(spent coffee grounds, SCG)는 커피 공정 후 남은 잔여물로, 매년 6백만 톤이 발생한다[13]. 과거에는 SCG를 연소하거나 매립했으나, 최근에는 SCG의 부가가치가 재평가되고 있다[16]. SCG는 지방산, 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등 다양한 유기 화합물을 포함하고 있으며, SCG에 포함된 약 10‒15%(w/w)의 오일은 바이오디젤 생산 원료 또는 미생물 배양 기질로 이용될 수 있다[1, 5, 16].

본 연구에서는 버려지고 있는 커피 산업 부산물인 SCG로부터 추출한 오일을 단일 탄소원으로 이용하여 mcl-PHA를 생합성 하고자 한다. 이를 위한 최적 배양 조건을 확립했으며, 이를 바탕으로 회분식 및 유가식 배양을 진행한 뒤, 구조 및 물성 분석을 통해 생합성된 mcl-PHA의 특성을 확인하였다. 본 연구는 SCG 추출 오일(extracted oil from SCG, EOC)을 이용한 mcl-PHA 생산이 SCG 처리와 mcl-PHA의 경제적 생산 방안을 제시함을 보여준다.

재료 및 방법

균주 및 배양

EOC를 단일 탄소원으로 이용하여 mcl-PHA를 생합성하는 균주를 토양에서 분리하였다. 경상북도 안동시 송천동 신여골에서 채취한 토양 시료 5 g을 20 ml의 DW에 섞어 10 min 간 정치한 후, EOC 5 g/l와 90 ml의 mineral salt (MS) 배지가 들어있는 500 ml 삼각플라스크에 시료 10 ml를 접종하여 30℃, 200 rpm으로 7일간 증균 배양하였다. MS 배지 1 l의 조성은 다음과 같다: Na₂HPO₄·12H₂O 9.00 g, KH₂PO₄ 1.50 g, NH₄Cl 0.50 g, MgSO₄·7H₂O 0.20 g 및 microelement solution 1 ml. Microelement solution은 FeCl₃ 9.70 g, CaCl₂·2H₂O 10.33 g, CoCl₂·6H₂O 0.22 g, CuSO₄·5H₂O 0.16 g, NiCl₃·6H₂O 0.12 g 및 CrCl₃·6H₂O 0.11 g을 0.1 M HCl 1 l에 녹여 제조하였다. 증균 배양 후 평판도말과 획선 도말을 통해 단일 균주를 확보하였고, 균주를 nutrient broth (NB) 배지에 24 hr 배양한 후, 배양액 400 μl와 glycerol 600 μl를 섞어 –80℃에서 보관하였다.

분리 균주의 염색체 DNA를 primer 1 (5’-AGAGTTTGATCMTGG CTCAG-3’(8F))과 primer 2 (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(1492R))를 사용하여 polymerase chain reaction 방법으로 염기서열을 증폭하고, BLAST를 통하여 균주를 동정하였다.

EOC 제조 및 지방산 조성 분석

SCG (케냐AA, 예가체프, 과테말라 등)는 안동대학교 교내 카페테리아인 핸즈커피에서 제공받아 80℃의 dry oven에서 24 hr 건조한 뒤 건조된 SCG 15 g을 thimble 필터에 넣고, n-hexane을 용매로 사용하여 Soxhlet 추출기로 오일을 추출하였다. 추출 후 n-hexane을 fume hood에서 제거하고, EOC의 양을 계산하였다[17].

EOC에 포함된 지방산은 gas chromatography (GC)를 통해 분석하였다. EOC 20 mg을 conical tube에 넣고 100 mg의 pyrogallol, 내부표준용액 2 ml (Supelco^TM 37 Component FAME Mix 10 mg, CH₂Cl₂ 1 ml)와 8.3 M NaOH 10 ml를 첨가하여 70℃에서 40 min 동안 중탕하였다. 실온에서 냉각 후 7% boron trifluoridemethanol solution 2 ml와 N₂를 첨가하여 100℃에서 45 min 동안 가열하였다. 용액을 실온에서 재냉각하여 증류수(distilled water, DW) 5 ml, n-hexane 1 ml와 Na₂SO₄ 1 g을 첨가하여 진탕 후 분리된 상층액을 GC vial에 옮겨 분석하였다. 분석은 flame ionization detector (FID)가 장착된 Agilent 6890N GC (Agilent Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하였으며 SP-2560 column (100 m × 0.25 mm × 0.2 mm)을 사용하였다.

플라스크 배양을 통한 배양 조건 확립

균주의 최적 생장 및 mcl-PHA 생합성 조건을 확인하기 위해 분리균주를 NB 배지에서 24 hr 배양한 후 10%(v/v)로 MS 배지에 접종하였다. 기본 배양 조건은 EOC 5 g/l, 96 hr, NH₄Cl 0.5 g/l, pH 7, 30℃로 설정하고 각 실험은 3회 반복하였다. 최적 탄소원 농도를 확인하기 위해 1‒30 g/l 농도로 배양하였고, 최적 배양 시간은 24‒168 hr 동안 24 hr 간격으로 확인하였다. 질소원으로 NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NH₄H₂PO₄, beef extract, yeast extract, peptone을 각각 0.5 g/l 사용하였으며, pH 5‒9 범위와 20‒40℃의 배양온도에서 균주의 생장과 mcl-PHA 축적을 확인하였다. C/N 비율 최적화를 위해 C/N ratio 5‒30 (g/g) 범위에서 탄소원을 고정하고 질소 비율을 조정하였다.

Fermentation

플라스크 배양을 통해 확립한 조건을 토대로 분리균주를 3 l bioreactor (Biofors, Bucheon, Korea)에서 2 l 용량으로 배양하였다. 회분식 배양 조건은 EOC 5 g/l, NH₄Cl, pH 7, 25℃, C/N ratio 15 (g/g), 200 rpm 및 1 vvm이었다. 유가식 배양 조건은 회분식과 동일하며, 배양 18, 30, 42 hr에 각각 EOC 2.5 g/l와 NH₄Cl 0.166 g/l를 추가하였다. 회분식 배양에서는 12 hr 간격, 유가식 배양에서는 6 hr 간격으로 20 ml 시료를 채집하여 10,000 rpm에서 10 min 동안 원심분리하여 상등액과 균체를 분리하였다.

잔여 질소량 및 탄소량 측정

채집한 시료를 원심분리한 후 상등액은 잔여 질소량 측정에 사용하였다[11]. DW 2.95 ml, Nessler’s reagent (1:5 = Nessler’s solution:0.1 M KOH) 2 ml와 상등액 0.05 ml를 반응시켜 10 min 간 정치 시킨 후 OD 490 nm에서 측정하였다. NH₄Cl standard는 0.01‒1.0 g/l를 DW에 녹인 후 동일한 방법으로 측정하였다. 침전된 균체는 DW (DW:시료 = 5:1)와 n-hexane (n-hexane:시료 = 2:1)으로 세척 후 10,000 rpm에서 10 min 원심분리 후 n-hexane 층만 분리하여 conical tube에 옮기고 fume hood에서 n-hexane을 완전히 제거하여 잔여 탄소량을 측정하였다.

PHAs 조성 및 물성 분석

균주가 생합성한 PHAs의 조성은 GC로 확인하였다. Internal standard는 benzoic acid 2 mg/ml를 사용하였다. Vial에 20 mg의 건조세포를 담고, GC base solution (1 l당 methanol 850 ml, 95% H₂SO₄ 150 ml, benzoic acid 2 g) 538 μl와 CHCl₃ 538 μl를 첨가하여 90℃ water bath에서 4 hr 반응시켰다. 이후 GC water 200 μl를 첨가해 vortexing하고 24 hr 동안 층 분리 한 뒤 CHCl₃ 층을 0.2 μm Minisart SRP4 syringe filter (Sartorius Stedim Lab., Gӧttingen, Germany)로 여과한 후 GC vial에 옮겨 분석하였다. GC는 FID가 장착된 GC-2010 plus Capillary GC (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan)를 사용하였으며 HP1 column (25 m × 0.2 mm × 0.5 mm)을 사용하였다. GC/MS는 5977 Series GC/MSD system과 HP-5MS column을 사용하였다.

PHAs의 분자 질량(molecular weight)을 측정하기 위해 gel permeation chromatography를 이용하였다. 정제된 mcl-PHA 10 mg을 2 mg/ml 농도로 tetrahydrofuran에 녹여 전처리 한 뒤, refractive index detector alliance e2695 (Waters Inc., Milford, MA, USA)와 Wasters Styragel HR3, HR4 및 HR5 column을 사용하였다. Thermogravimetric analysis (TGA)로 mcl-PHA의 열안정성(thermal stability)을 분석하였으며 TG-DTA 8122 (Rigaku Inc., Tokyo, Japan)를 사용하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복 수행하였으며, 결과는 평균의 표준오차(standard error of the mean, SEM)로 통계 처리하였다.

결과 및 고찰

EOC 추출 및 조성 분석

EOC의 최적 추출 조건을 확인하기 위해 추출 시간과 SCG/n-hexane 비율에 따른 수율을 비교하였다. 추출 시간 2 hr 및 SCG/n-hexane 비율이 15일 때 최대 EOC 추출량(14.40 및 14.97%(w/w))을 확인하였다(Fig. 1). 이는 Bhatia 등의 연구 결과(13.2%(w/w))와 유사하며, 최대 수율은 1.77%(w/w) 더 높았다[4]. 본 연구에서 사용한 SCG의 EOC 함유량은 12.99‒14.97%(w/w)로 Bhatia 등의 연구 결과와 유사한 수치를 보였다.

Fig. 1. Oil extraction yield from dried SCG using n-hexane. (A) extraction time and (B) SCG/n-hexane ratio. The extraction of EOC was conducted using a Soxhlet extractor, with extraction times ranging from 1 to 4 hr and SCG/n-hexane ratios from 5:1 to 20:1.

EOC에 함유된 지방산 조성을 분석한 결과 linoleic acid가 45.08%로 가장 높았으며, palmitic acid 35.56%, oleic acid 8.62%, stearic acid 7.62%로 구성되었다(Table 1). 이는 Obruca 등의 연구 결과와 유사한 조성을 나타냈다[17]. 본 연구를 통해 EOC가 PHAs 생합성 미생물 배양의 기질로 이용될 수 있으며, mcl-PHA 생합성에 기질로서의 가능성을 확인하였다.

Table 1. Fatty acid composition in EOC

균주 분리 및 동정

경상북도 안동시 송천동 신여골에서 토양 시료를 채취하여 mcl-PHA 생합성 균주를 분리하였다. EOC 5 g/l 포함된 MS 배지에서 30℃, 200 rpm 조건으로 7일간 증균 배양 후 18종의 균주를 분리하였다. 분리한 균주들의 세포건조중량(dry cell weight, DCW) 및 mcl-PHA 생합성을 확인하기 위해 100/500 ml MS 배지에 EOC 5 g/l 첨가하여 30℃, 200 rpm에서 96 hr 동안 배양한 결과, HY61 균주만이 mcl-PHA를 생합성하는 것으로 확인되었다. 16S rDNA 염기서열 분석 후 BLAST를 통해 HY61 균주를 동정한 결과 분리된 균주는 Pseudomonas 속의 균주들과 96%의 유사성을 보였으며, 새로운 종으로 판단되어 Pseudomonas sp. HY61로 명명하였다. Pseudomonas sp. HY61의 계통수는 Fig. 2에 나타내었다.

Fig. 2. Phylogenetic tree of Pseudomonas sp. HY61. A bootstrap neighboring phylogenetic tree was constructed using MEGA 6.06 with 1,500 replicates. The number on each interior branch indicates the bootstrap percentage.

Pseudomonas sp. HY61의 mcl-PHA 생합성

토양 분리 균주 Pseudomonas sp. HY61에 의해 생합성된 mcl-PHA의 조성은 GC와 GC/MS로 확인하였다(Fig. 3). GC 분석 결과 benzoic acid (retention time, RT; 11.466 min), 3HHx (RT; 10.551 min), 3HO (RT; 14.408 min), 3HD (RT; 17.652 min), 3HDd (RT; 20.615 min)의 피크가 확인되었고(Fig. 3A), Fig. 3B에서 볼 수 있듯이 GC/MS 분석에서도 동일한 단량체의 피크가 나타났다(RT; 6.073 min benzoic acid, RT; 5.201 min 3HHx, RT; 9.028 min 3HO, RT; 12.023 min 3HD, RT; 14.481 min 3HDd). 이를 통해 EOC를 단일 탄소원으로 사용하여 Pseudomonas sp. HY61이 생합성한 mcl-PHA는 3HHx, 3HO, 3HD, 3HDd 단량체로 구성된 것을 확인하였다.

Fig. 3. GC and GC/MS analysis of mcl-PHA biosynthesized by Pseudomonas sp. HY61. (A) GC, (B) GC/MS. Bacteria were cultivated in MS medium with 5 g/l of EOC. The PHAs were extracted from dry cells with chloroform.

Cruz 등은 Pseudomonas citronellolis NRRL B-2504와 Pseudomonas resinovorans NRRL B-2649가 olive oil distillate와 used cooking oil을 이용하여 3HO와 3HD를 주 단량체로 하는 mcl-PHA를 생합성함을 보고하였다[8]. 이는 식물 유래 오일의 지방산이 β-oxidation 경로를 통해 2-trans-enoyl-CoA와 (S)-3-hydroxyacyl-CoA가 각각 Enoyl-CoA hydratase (PhaJ)와 3-hydroxyacyl-CoA epimerase에 의해 mcl-PHA의 전구체인 (R)-3-hydroxyacyl-CoA를 형성하고, PHA synthase (PhaC)에 의해 mcl-PHA가 생합성된다고 설명하였다[12]. 본 연구에서 분리한 Pseudomonas sp. HY61도 β-oxidation 경로를 통해 mcl-PHA를 생합성하는 것으로 사료된다.

플라스크 배양을 통한 최적 배양 조건 확립

Pseudomonas sp. HY61의 최적 배양 조건을 확립하기 위해, 특정 배양 조건을 제외하고 EOC 5 g/l, 96 hr, NH₄Cl, pH 7, 30℃ 및 C/N ratio 10 (g/g)의 동일한 조건에서 진행하였다(Fig. 4). 탄소원인 EOC 농도를 달리하여 배양한 결과 EOC 5 g/l에서 DCW 0.91 g/l, mcl-PHA 0.24 g/l로 가장 높은 생장을 보였으며, EOC 농도가 증가할수록 생장이 감소하였다(Fig. 4A). 최적 배양 시간은 72 hr으로, 이때 가장 높은 세포 생장(0.95 g/l)과 mcl-PHA 축적(0.26 g/l)을 확인하였다(Fig. 4B). Pseudomonas sp. HY61의 생장과 mcl-PHA 생합성에 미치는 질소원의 영향을 평가한 결과, 무기질소원인 NH₄Cl를 사용했을 때 DCW 0.89 g/l, mcl-PHA 0.18 g/l로 가장 높은 생장을 보였으며(Fig. 4C), 산성 및 알칼리 조건에서는 균주의 생장 및 mcl-PHA 축적이 감소하였고 pH 7에서 DCW 0.75 g/l, mcl-PHA 0.1 g/l로 최대 생장과 mcl-PHA 생합성이 확인되었다(Fig. 4D). Pseudomonas sp. HY61은 20℃와 40℃에서는 생장이 저조했으나, 25℃에서 가장 높은 세포생장 및 mcl-PHA 축적을 보여 중저온성 미생물로 사료된다(Fig. 4E). 최적 C/N ratio (g/g)는 15로, 이 조건에서 DCW 1.10 g/l, mcl-PHA 0.29 g/l를 기록하였다(Fig. 4F). C/N ratio 5(g/g)의 조건에서 가장 높은 균주 생장을 보였으나 최소 mcl-PHA 축적량을 확인하였다. Raza 등에 따르면 C/N ratio는 균주의 생장과 PHAs 축적에 영향을 미치며 질소의 제한이 PHAs 축적을 증가시켰다고 보고하였다[18]. 본 연구에서 C/N ratio 5(g/g) 조건은 균주 생장에는 긍정적인 영향을 주었으나 mcl-PHA를 생합성에 필요한 질소가 충분히 제한되지 않은 영양 조건으로 사료된다. 따라서, 최적의 탄소원과 질소 비율은 C/N 15(g/g)로 선정하였다.

Fig. 4. Growth and mcl-PHA accumulation of Pseudomonas sp. HY61 strain under various cultivation conditions. The basic cultivation conditions included 5 g/l EOC and 0.5 g/l NH₄Cl as the carbon source and nitrogen source, respectively, with a C/N ratio of 10, at pH 7, 30℃, and cultivated for 96 hr. (A) EOC concentration, (B) culture time, (C) nitrogen source, (D) pH, (E) temperature, and (F) C/N ratio (g/g).

Fermentation

앞서 확립한 최적 배양 조건을 토대로 회분식 배양을 진행하였으며 동일 배양 시간 대비 균주의 생장과 mcl-PHA 생합성량을 증가시키기 위해 유가식 배양을 진행하였다.

회분식 배양 결과, Pseudomonas sp. HY61은 지체기(leg phase)를 지나 배양 12‒36 hr 동안 DCW가 0.33 g/l에서 1.03 g/l로 증가하였다(Fig. 5A). 배양 12 hr부터 축적이 시작된 mcl-PHA는 배양 36 hr에 DCW의 25.12% (0.26 g/l)임을 확인하였다. 또한 배양 36 hr에 EOC와 NH₄Cl는 각각 78%와 97%가 소비되었다. 따라서 12‒36 hr 동안 탄소원과 질소원의 급격한 소비와 함께 균주의 생장과 mcl-PHA 생합성이 증가하였으며 이 기간을 대수기(log phase)로 판단하였다. 배양 36‒48 hr 동안 Pseudomonas sp. HY61은 완만한 정체기(stationary phage)를 보였으며, 배양 48 hr 후 DCW와 mcl-PHA 생합성량은 각각 0.97 g/l와 0.22 g/l로 감소했다. 배양 60 hr 후에는 DCW 0.90 g/l, mcl-PHA 0.17 g/l까지 감소했고, 배양 72 hr 후 DCW 0.92 g/l, mcl-PHA 0.17 g/l로 DCW 대비 18.49%의 축적률을 보였다. 배양 72 hr 동안 EOC와 NH₄Cl은 각각 99%와 97%가 소비되었으며, NH₄Cl은 배양 36 hr부터 고갈되어 균주 생장과 mcl-PHA 생합성에 영향을 영향을 준 것으로 사료된다.

Fig. 5. Time course of DCW and mcl-PHA concentration during fermentation. (A) batch fermentation, and (B) fed-batch fermentation. Bacteria were cultivated in 3 l jar fermenter containing 2 l of MS medium with 5 g/l EOC, pH 7, 25℃, 200 rpm, 1 vvm and 0.33 g/l NH₄Cl. In fed-batch fermentation, 2.5 g/l EOC and 0.166 g/l NH₄Cl were added at 18, 30, and 42 hr.

유가식 배양은 회분식 배양과 동일한 조건에서 시작하여 18, 30, 42 hr에 EOC 2.5 g/l와 NH₄Cl 0.166 g/l를 각각 3회 추가 공급하였다(Fig. 5B). 배양 초기 18 hr 동안 지체기를 보였고, 18‒42 hr 동안 급격히 생장하여 배양 48 hr에 최대 세포 생장(3.15 g/l)을 기록하였다. EOC와 NH₄Cl을 추가 공급한 유가식 배양에서, 배양 18 hr에 탄소원 87%, 질소원 92%가 소비되었으며, 30 hr에 탄소원 77%, 질소원 84%, 42 hr에 탄소원 39%, 질소원 84%가 소비되었다. 이러한 탄소원 및 질소원의 급격한 소비는 균주의 생장과 mcl-PHA 생합성에 기여한 것으로 사료된다. 배양 48‒54 hr 동안 완만한 정체기를 보였으며, 54 hr에 탄소원 71%, 질소원 94%가 소비되었다. 이후 질소원 고갈로 균주 생장이 감소하였다. 배양 72 hr 후 DCW는 2.85 g/l, 그리고 mcl-PHA 생합성량은 0.67 g/l로 약 24%(w/w)의 mcl-PHA 축적률을 보였다. 유가식 배양은 회분식 배양보다 DCW 3.09배, mcl-PHA 생합성량 3.94배 증가하였다. 탄소원 공급량 대비 DCW 수율은 회분식에서 18.4%, 유가식에서 22.8%로 나타났으며, mcl-PHA 수율은 회분식에서 1.7%, 유가식에서 2.7%로 확인되었다. 유가식 배양은 회분식 배양에 비해 각각 1.23배, 1.58배 증가하여 유가식 배양이 세포 생장과 mcl-PHA 생합성 효율이 높음을 확인할 수 있었다.

본 연구 결과와 식물 유래 오일을 이용한 Pseudomonas 속 균주의 mcl-PHA 생합성 연구를 비교하였다(Table 2). Kang 등은 sludge palm oil을 이용해 P. fluorescens, P. chlororaphis, P. putida 등의 균주로 mcl-PHA 생합성을 확인했으며, P. putida는 48 hr 배양 후 DCW 1.41 g/l, mcl-PHA 축적률 15.73%(w/w)를, P. putida S12는 DCW 1.01 g/l, mcl-PHA 축적률 24.87%(w/w)를 나타냈다고 보고하였다[10]. Song 등은 waste vegetable oil을 이용하여 Pseudomonas sp. strain DR2의 mcl-PHA 생합성을 확인하였다[21]. Corn oil을 탄소원으로 사용했을 때 DCW 0.96 g/l, mcl-PHA 축적률 37.34%(w/w)를 나타냈으며, fried oil을 사용했을 때는 DCW 0.54 g/l, mcl-PHA 축적률 23.52%(w/w)를 보였다[21]. 이는 본 연구에서 Pseudomonas sp. HY61에 의해 mcl-PHA 축적률이 18.49‒23.51%(w/w)로 나타난 결과와 유사하며, EOC가 mcl-PHA 생합성을 위한 탄소원으로 충분히 활용될 가능성이 있음을 시사한다.

Table 2. Comparison of DCW and mcl-PHA biosynthesis by Pseudomonas sp. HY61

*EOC, extracted oil from SCG; SPO, sludge palm oil

PHAs 조성 및 물성 분석

GC 분석을 통해 회분식 배양과 유가식 배양을 통해 생합성된 mcl-PHA의 조성을 분석한 결과, 두 배양 방식에서 생합성된 mcl-PHA는 동일한 조성을 가지며, mcl-PHA 단위체의 비율에서도 유의미한 차이가 없음을 확인하였다(Fig. 6). 따라서 EOC를 단일 탄소원으로 이용할 경우, 배양 방법에 관계없이 Pseudomonas sp. HY61로부터 동일한 조성과 비율을 가진 mcl-PHA를 생합성할 수 있음을 시사한다.

Fig. 6. GC analysis of purified mcl-PHA from Pseudomonas sp. HY61. A) Batch fermentation and B) fed-batch fermentation.

회분식 및 유가식 배양으로 Pseudomonas sp. HY61이 합성한 mcl-PHA의 분자량 및 열적성질을 분석하였으며 이를 다른 연구결과와 비교하여 Table 3에 나타내었다. 회분식 배양으로 합성된 mcl-PHA의 수평균몰질량(number average molecular weight, M_n)은 1.2×10⁵ Da, 질량평균몰질량(average molecular weight, M_w)은 2.4×10⁵ Da, 다분산지수(polydispersity index, PDI)는 1.9로 확인되었다. 유가식 배양으로 합성된 mcl-PHA의 경우 M_n은 0.7×10⁵ Da, M_w는 1.8×10⁵ Da, PDI는 2.4로 나타났다. TGA를 사용하여 합성된 mcl-PHA의 분해온도(decomposition temperature, T_d)를 확인한 결과, 회분식과 유가식 배양으로 합성된 mcl-PHA의 T_d는 각각 292.6℃ 및 289.5℃로 확인되었다. EOC를 단일 탄소원으로 이용하여 Pseudomonas sp. HY61이 합성한 mcl-PHA의 물성을 이전 연구와 비교한 본 연구에서 생합성 된 mcl-PHA는 지방산을 탄소원으로 이용한 이전 연구보다 높은 M_w를 나타냈으며[2, 7, 8] 특히 회분식배양으로 합성된 mcl-PHA의 M_w가 유가식 배양의 M_w보다 높았다. M_w는 생산 조건, 특히 기질의 구성, 배양 방법, 생장 단계에 따라 달라질 수 있다[19]. Reboch 등은 PHAs 축적 속도가 생합성된 mcl-PHA의 M_w에 영향을 미치며, 축적 속도가 낮을수록 배양 시간이 길어져 고분자의 M_w가 분해된다고 보고하였다[15, 19]. 따라서 회분식 배양의 M_w가 유가식 배양보다 높은 것은 균주의 생장과 mcl-PHA 축적 속도가 회분식 배양에서 더 높기 때문으로 사료된다. 또한 분자량의 차이로 유가식 배양으로 합성한 고분자에 비해 회분식 배양으로 합성된 mcl-PHA가 상대적으로 높은 T_d를 보였을 것으로 사료된다.

Table 3. Characterization of biosynthesized mcl-PHA by Pseudomonas sp. HY61

*n.d., not detected; n.a., data not available.

*EOC, extracted oil from SCG; OOD, olive oil distillate; FFA, free fatty acids; TFA, tallow fatty acids; UCO, used cooking oil; VO, vegetable oil.

또한 Rebocho 등은 높은 M_w와 T_d를 갖는 mcl-PHA가 코팅, 의료 분야 및 약물 전달체로 이용 가능한 고분자 물질이라고 보고하였다[19]. 본 연구에서 생합성된 mcl-PHA는 기존 보고된 mcl-PHA에 비해 상대적으로 높은 M_w와 T_d를 보였으며, 이는 Rebocho 등의 연구 결과와 유사하여 코팅 및 의료 분야 응용에 적합한 고분자로 판단된다. 따라서 Pseudomonas sp. HY61은 EOC를 단일 탄소원으로 이용하여 배양 방법에 관계없이 동일한 구조의 mcl-PHA를 생합성할 수 있으며, 이렇게 생합성된 mcl-PHA는 코팅 및 의료 분야에 응용될 수 있음을 시사한다.

감사의 글

이 논문은 안동대학교 기본연구지원사업에 의하여 연구되었습니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.