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The Preventive Effect of Angelica gigas Nakai Extract and Green Coffee BeanExtract on Bone Marrow Toxicity Induced by Benzene

Benzene으로 유도한 골수독성에 대한 참당귀 추출물과 커피 생두 추출물의 예방효과 연구

  • Received : 2024.06.26
  • Accepted : 2024.08.28
  • Published : 2024.09.30
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Abstract

Bone marrow toxicity is a side effect of chemotherapy with anticancer drugs or the exposure to chemicals, such as benzene. When myelotoxicity occurs, the number of white blood cells decreases, which reduces immune functioning and increases the risk of infection or the development of tumors. Angelica gigas Nakai extract (AGNEX) and green coffee bean extract (GCBE) have many effects, such as anti-cancer and antioxidant effects, as well as effects on the immune functioning. In this experiment, the preventive effect of AGNEX and GCBE against benzene-induced bone marrow toxicity was confirmed in Sprague Dawley rats (SD rats) in vivo. Benzene (1 ml/kg mixed with corn oil 1:1) was intraperitoneally administered to SD rats (six weeks, N = 9/group) once a day, and AGNEX (12 mg/kg) and GCBE (6, 12, and 24 mg/kg) were administered orally daily for five weeks. To determine the preventive effect, AGNEX (12 mg/kg) and GCBE (6, 12, and 24 mg/kg) were administered orally before the administration of benzene. Consequently, AGNEX 12 mg/kg and GCBE 12 mg/kg were effective at reducing leukocytes and lymphocytes, specifically granulocyte. Additionally, the treatment also showed protective effects specifically on spleen and liver weight changes and spleen damage. Through this protective effect, AGNEX and GCBE were confirmed to prevent bone marrow toxicity by enhancing the functioning of the immune system.

골수독성은 항암제에 의한 화학요법이나 벤젠 등의 화학물질에 노출되어 발생하는 부작용이다. 골수독성이 발생하면 백혈구 수가 감소하여 면역기능이 저하되고 감염이나 종양발생 위험이 높아진다. 당귀 추출물(Angelica gigas Nakail extract, AGNEX)과 커피 생두 추출물(green coffee bean, GCBE)은 면역기능에 대한 효과뿐만 아니라 항암, 항산화 등의 많은 효과가 있다. 본 실험에서는 벤젠으로 유도된 골수독성에 대해 AGNEX와 GCBE의 예방 효과를 Sprague Dawley rats (SD rat) in vivo실험에서 확인하였다. SD rat (6주, N=9/group)에 2일 1회 benzene (1 ml/kg에 corn oil 1:1 혼합)을 복강 내 투여 하였으며 AGNEX (12 mg/kg)와 GCBE (6, 12, 24 mg/kg)는 35일 동안 매일 경구 투여 하였다. 예방 효과를 보기 위해 AGNEX (12 mg/kg)와 GCBE (6, 12, 24 mg/kg)를 benzen 투여 전에 경구 투여 하였으며 그 결과, AGNEX 12 mg/kg과 GCBE 12 mg/kg은 백혈구, 림프구 및 과립구 감소에 대한 예방 효과를 입증했다. 또한, 비장, 간 체중 변화와 비장 손상에서도 특이적으로 보호되었다. 이러한 보호 효과를 통해 AGNEX와 GCBE는 면역 기능을 향상시켜 골수 독성을 예방할 수 있는 것으로 확인되었다.

Keywords

서론

골수는 주요 조혈기관으로서 적혈구, 백혈구, 혈소판과 같은 각종 혈구를 생산하는 조혈작용뿐만 아니라 조혈줄기세포로부터 적혈구계, 과립구계 및 림프구계의 다양한 단계 혈구세포들의 증식과 분화, 저장, 방출을 조절한다. 골수의 이러한 기능은 인체의 항상성 및 면역기능과 생명 유지에 중요하다[16]. 골수독성은 약물 및 항환경 화학물질, 치료 약물 및 항암제와 같은 항암 화학요법에 의하여 골수의 독성이 나타나게 된다[4]. 골수독성이 나타나게 되면 골수의 조혈기능이 억제되고 골수세포와 조혈줄기세포가 손상되어 그로 인해 말초혈액의 수가 감소한다. 그 중 호중구, 림프구와 같은 백혈구 수치가 줄어들고 상황이 지속되면 면역 기능이 감소하여 발열, 감염, 종양 생성 및 발생 등이 증가하게 된다[14].

골수독성으로 인한 백혈구 수치 감소가 지속될 경우 감소한 백혈구를 증진시키기 위하여 백혈구 촉진제를 사용하는데 이는 과립구 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor)인 filgrastim 성분이다. 이를 사용하여 치료를 지속할 때 뼈 통증, 요통, 피부발진, 생식기능 감소와 같은 부작용이 나타난다[6, 25]. Filgrastim과 같은 의약품으로 인한 부작용을 줄이기 위하여 천연물 소재의 백혈구 증가물질에 대한 연구가 필요한 상황이다. 본 연구실에서는 백혈구 수치와 면역 기능을 증가시켜 골수독성을 예방할 수 있는 새로운 천연물 소재를 찾고자 하였다.

참당귀(Angelica gigas Nakai)는 미나리과에 속하는 다년생 초본으로, 다양한 질병의 치료와 예방을 위하여 사용되고 있는 약용식물이다. 참당귀는 항산화, 항암, 보혈작용, 면역기능 및 조혈 작용 개선 등의 효과를 가지고 있다[20]. 참당귀는 지용성 물질인 coumarin과 수용성 물질인 polysaccharide가 함유되어 있으며 coumarin에는 decursin, decursinol angelate와 decursinol이 있다[13]. 본 연구실 결과에 따르면 참당귀에 decursin, decursinol angelate, decursinol의 비율은 각각 54%, 44%, 2%로 구성되어 있다. 그 중 decursin, decursinol angelate를 70% 이상 함유한 추출물(AGNEX)을 제조하였다[12].

볶지 않은 커피를 커피 생두(green coffee bean)라고 하며 커피 생두에는 caffeine, polyphenol, chlorogenic acid (CGA) 등의 성분이 함유되어 있다[2]. Caffeine과 CGA는 추출온도, 시간, 물의 부피에 따라 함량이 달라지는데 커피를 볶을 경우 CGA가 감소되는 반면 커피 생두 상태에서는 CGA가 6‒12%로 가장 풍부하게 함유되어 있다[11, 19, 21]. CGA는 caffeic acid와 quinic acid의 에스테르 결합으로 구성된 천연 화합물이다. CGA의 주요 하위 그룹으로 3-O-caffeoylquinic acid (n-chlorogenic acid), 5-O-caffeoylquinic acid (neo-chlorogenic acid) 및 4-O-caffeoylquinic acid (crypto-chlorogenic acid)가 있다. 커피 생두는 항산화, 항암, 항염증, 항지질혈증 및 항고혈압과 같은 효과를 나타내며 면역체계에 효과를 나타낼 수 있다[2, 17, 23].

특히 참당귀의 경우 본 실험실에서 진행한 연구 결과에서 혈소판 증가와 호중구 감소증 예방 효과를 나타냈으며 이에 따른 골수독성 개선에도 효능이 있을 것으로 사료된다[8, 9]. 또한 호중구 감소증 보호효과 및 골수독성 개선 효과를 예상하며 참당귀보다 낮은 가격을 가지는 커피 생두를 이용하여 골수독성에 대한 효과를 보고자 한다. 본 연구에서 참당귀 추출물과 커피 생두 추출물이 가지는 골수독성 개선 효과 및 예방 효과를 benzene으로 유도된 골수독성 in vivo 모델에서 확인하고자 한다.

재료 및 방법

실험 재료

골수 독성 유도를 위해 Benzene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 corn oil (Sigma-Aldrich)을 사용하였으며 실험에 사용한 AGNEX는 본 연구실에서 가지고 있는 특허 방법으로 추출하여 사용하였다[7]. GCBE는 커피 생두를 부산커피협동조합에서 제공받아 사용하였으며 95% ethanol을 이용한 추출방법으로 제조하였다. 혈액을 분석하는 기기로는 automatic blood cell analyzer (BC-2800VET, Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co., Shenzhen, China)를 사용하였으며 소재 추출 및 qRT-PCR 실험 진행에 사용한 원심분리 기기는 Centrifuge 5804 R (Eppendorf, Hamburg, Germany)을 사용하여 진행하였다.

소재 추출물 및 경구 투여제 제조

참당귀를 건조시키고 분쇄한 후 분쇄한 분말 30 kg에 95% ethanol 5배를 첨가하여 2‒3번 추출하였다. 추출 후 회전식증발농축기(Rotavapor® R-210, BUCHI, Flawil, Switzerland)로 농축하였다. 그 후 95% ethanol 1 l로 녹인 후 16시간 동안 방치하였다. 60% ethanol 50 l를 첨가한 후 원심분리하여 상등액만을 농축하였다. 농축 후 80℃ dry oven에서 건조시켜 참당귀 정제 추출물을 얻었다(Fig. 1). 커피 생두 추출물은 커피 생두를 세척한 후 60℃에서 16시간 이상 건조시켜 커피 생두 속의 수분을 제거한 후 사용하였다. 건조한 커피 생두 기준 2배의 80% ethanol을 첨가하여 12–24시간 동안 추출 후 분쇄하였다. 분쇄 후 80% ethanol을 추가로 첨가하여 80℃ 에서 4시간 추출하였으며 회전식증발농축기로 농축하였다. 그 후 추출물의 여과를 위하여 Whatman no.2 여과지(Advantec, Tokyo, Japan)로 통과시켜 여과 후 감압 농축기로 농축하였으며 수분을 증발시켜 한번 더 농축하여 커피 생두 정제 추출물을 얻었다(Fig. 6). 경구 투여제는 참당귀 추출물과 커피 생두 추출물 각각에 10% ethanol을 넣어 vortex mixing하여 잘 녹인 후 lysine 1.5% (L-lysine pure powder, NOW Food, Bloomingdale, IL, USA)를 첨가해 vortex mixing 하였다. 이 후 증류수로 1 l로 맞추어 사용하였다(Fig. 2).

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Fig. 1. The structure of decursin, decursinol angelate and decursinol.

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Fig. 2. The structure of caffeine and chlorogenic acid.

동물 실험

본 연구에서 사용한 동물은 경성대학교 동물윤리위원회에 의해 윤리성과 과학성에 대한 검토를 받아 적합한 것으로 승인(동물윤리승인번호: 연구-21-022A)을 획득하여 수행하였다. 실험 동물은 4주령(60–100 g) SD rat (효창사이언스, Daegu, Korea)을 사용했다. Institutional animal care and use committee에 따라 2주일간 적응기간을 거쳐 최종적으로 6주령(150–200 g)을 실험에 사용하였다. 방의 온도는 22±2℃, 습도는 60±5%를 유지하였으며 물과 사료는 자율 급이 하였다. 실험은 5주간 진행하였으며 총 45마리를 각각 5마리씩 9개의 그룹으로 나누었다. 골수독성을 유발 시키기 위해 benzene에 corn oil과 1:1로 혼합하여 최종 농도 1 ml/kg으로 제조하였으며 6주령 SD rat에 2일 1회 복강 투여(Intraperitoneal, I.P.)하였다. 골수독성을 유발하는 동시에 AGNEX 12 mg/kg, GCBE는 용량에 대한 효과 확인을 위해 6, 12, 24 mg/kg 농도로 경구 투여(Oral administration, P.O.)하였다(Table 1). 또한 GCBE와 AGNEX의 장단점을 고려하여 16:00에 GCBE, 17:00에 AGNEX, 18:00에 benzene을 투여하였다.

Table 1. Study group for Angelica gigas Nakai extract (AGNEX), green coffee bean extract (GCBE) with 1 ml/kg benzene (mixed with corn oil 1:1)

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CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

혈액 채취 및 장기 적출

실험 하루 전 절식을 시킨 후 당일 대퇴, 간, 비장을 적출하였으며 혈액은 automatic blood cell analyzer을 이용해 혈액을 분석하였다. 또한 채취한 혈액은 1,650× g, 15분 원심 분리하여 분리된 상등액을 -70℃에 보관하였다.

비장 기능 변화 확인을 위한 H&E staining

면역세포의 기능을 돕고 노화된 적혈구를 제거하는 역할을 하는 비장을 H&E staining 방법을 이용하여 조직 염색을 진행한 후 현미경(EVOS XL Core, Invitrogen™, Waltham, MA, USA)으로 관찰하였다.

골수에서의 호중구 세포수 측정

뼈 안쪽에 존재하는 골수액에는 적혈구, 백혈구, 혈소판과 같은 혈액세포를 생성하기에 분리한 SD rat 대퇴골을 절단한 후 spin-down 하여 골수액을 얻었다. 골수액은 trypan blue (Trypan blue solution 0.4%, Gibco, Grand Island, NY, USA) 시약과 1:1,000의 비율로 희석하였다. 세포 카운팅 슬라이드(EVE™, NanoEntek, Seoul, Korea)에 희석한 골수액을 주입하였고 자동세포계수기(EVE™, NanoEntek)를 사용하여 호중구 세포 수를 측정하였다. 계수 범위는 호중구 세포 크기인 10‒15 µm 로 설정하였다.

간에서의 CYP450 발현양 측정을 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR)

간은 간동맥과 간문맥으로부터 혈액을 공급받기 때문에 혈액세포가 존재하므로 적출하였으며 -70℃에서 보관 중이던 간 조직 50‒100 mg에 trizol (TRIzol Reagent, Invitrogen™) 1 ml를 넣고 homogenizer (Homogenizer-Bioprep-6, Hangzhou Allsheng Instruments Co., Ltd., Hangzhou, China)를 이용하여 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직에 200 μl의 chloroform (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 넣은 후 vortexing 하였으며 4℃에서 13,200 rpm, 15분간 원심 분리한 후 상등액을 얻었다. 상등액에 500 μl의 isopropanol (2-propanol, Thermo Fisher Scientific Inc.)을 첨가한 후 4℃에서 13,200 rpm, 10 분간 원심분리 한 후 상등액을 제거하였다. 70% ethanol (Ethyl alcohol, 삼전순약공업(주), Pyeongtaek, Korea)로 세척한 후 ethanol을 제거하고 실온에서 5‒10분 동안 건조하였다. ethanol이 완전히 제거되면 Rnase free (Ambition DEPC, Invitrogen™)를 첨가하여 이후 -70℃에서 동결 보관하였다. mRNA의 발현은 quantitative real-time PCR 방법으로 측정하였다. cDNA는 cDNA Synthesis kit (Compact cDNA Synthesis kit, SmartGene, Daejeon, Korea)를 사용하여 RNA를 42℃에서 30분 85℃에서 10분, 4℃에서 반응시켜 합성하였다(SC300G-R2, Kyratec, Brisbane, Queensland Australia). 합성된 cDNA에 SYBR™ Select Master Mix (Smart Gene) 시약을 혼합하여 qRT-PCR (Quant studio™ Design&Analysis software)을 진행하였다.

통계처리

실험 결과는 평균 ±표준편차로 나타냈으며, 통계적 유의성은 student’s t-test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각 실험 그룹 간의 유의성은 p값이 0.05 이하인 경우 채택하고 그래프상 ‘*’와 ‘#’로 표기하였다.

결과

혈구세포 보호효과를 확인하기 위한 백혈구 수 측정

백혈구는 정상 그룹(6.1±0.6×103/µl)에 비해 benzene 투여 그룹(3.2±0.3×103/µl)이 약 47% 가량 감소하였다. 시험물질을 투여한 그룹 가운데 AGNEX(5.0±0.9×103/µl)가 benzene 투여 그룹에 비하여 57% 정도 상승하였고, GCBE 단독 투여 그룹에서는 GCBE 6 mg/kg (4.7±0.7×103/µl), GCBE 12 mg/kg (5.6±0.4×103/µl), GCBE 24 mg/kg (5.0±1.0×103/µl)이 46%, 75%, 56% 증가하였다. 병용 투여그룹의 경우에는 AGNEX & GCBE 6 mg/kg 투여 그룹은 백혈구 증가에 대한 효과가 나타나지 않았지만 AGNEX & GCBE 12 mg/kg, AGNEX & GCBE 24 mg/kg 그룹은 5.1±2.1×103/µl, 4.3±0.7×103/µl) 59%, 34% 증가한 것으로 나타났다(Fig. 3).

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Fig. 3. Cells were measured in blood to determine the effects of 12 mg/kg Angelica gigas extract (AGNEX), 6, 12, and 24 mg/kg green coffee bean extract (GCEB), AGNEX, and GCBE on white blood cells induced to 1 ml/kg of benzene. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

혈구세포 보호효과를 확인하기 위한 림프구 수 측정

림프구는 정상 그룹(4.7±0.8×103/µl)에 비해 benzene투여 그룹(2.5±0.6×103/µl)이 약 46% 가량 감소하였다. 시험물질 투여 그룹 가운데 AGNEX 6 mg/kg (3.5±1.0×103/µl)이 benzene 투여 그룹에 비하여 40% 정도 상승하였고, GCBE 단독투여 그룹에서 GCBE 6 mg/kg (3.1±0.6×103/µl), GCBE 12 mg/kg (4.1±0.6×103/µl), GCBE 24 mg/kg (3.9±0.8×103/µl)이 24%, 64%, 56% 정도 증가하였다. 병용 투여그룹의 경우에는 AGNEX & GCBE 6 mg/kg에서 림프구 증가에 효과가 나타나지 않았지만 AGNEX & GCBE 12 mg/kg, AGNEX & GCBE 24 mg/kg은 3.5±1.4×103/µl, 3.2±0.5×103/µl로 40%, 28% 증가하였다(Fig. 4).

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Fig. 4. Cells were measured in blood to determine the effects of 12 mg/kg Angelica gigas extract (AGNEX), 6, 12, and 24 mg/kg green coffee bean extract (GCEB), AGNEX, and GCBE on lymphocytes induced to 1 ml/kg of benzene. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

혈구세포 보호효과를 확인하기 위한 과립백혈구 수 측정

과립백혈구의 경우 정상 그룹(1.0±0.1×103/µl)에 비해 benzene 투여 그룹(0.8±0.2×103/µl)이 약 20% 가량 감소하였다. 시험물질을 투여한 그룹에서는 AGNEX 투여 그룹(1.3±0.1×103/µl)이 benzene 투여 그룹에 비하여 63%, GCBE 단독투여 그룹에서는 GCBE 6 mg/kg (1.2±0.1×103/µl), GCBE 12 mg/kg (1.1±0.2×103/µl), GCBE 24 mg/kg (1.0±0.1×103/µl)에서 50%, 37.5%, 25% 증가하였다. 병용 투여 그룹의 경우 AGNEX & GCBE 6 mg/kg에서 증가하지 않았지만 AGNEX & GCBE 12 mg/kg과 AGNEX & GCBE 24 mg/kg에서는 25%, 10% 정도 증가하였으며 benzene 투여그룹과 유의한 차이는 없었다(Fig. 5).

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Fig. 5. Cells were measured in blood to determine the effects of 12 mg/kg Angelica gigas extract (AGNEX), 6, 12, and 24 mg/kg green coffee bean extract (GCEB), AGNEX, and GCBE on granulocyte induced to 1 ml/kg of benzene. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

골수에서의 보호효과를 확인하기 위한 호중구 수 측정

정상 그룹(3.2±0.1×103/µl) 대비 benzene 투여 그룹(0.8±0.2×103/µl)에서 호중구 세포수가 75% 감소한 것을 확인할 수 있다(Fig. 6). benzene 투여 그룹(0.8±0.2×103/µl) 대비 AGNEX 6 mg/kg (2.5±0.2×103/µl), GCBE 6 mg/kg (2.0±0.2×103/µl), GCBE 12 mg/kg (1.2±0.2×103/µl), GCBE 24 mg/kg(1.0±0.2×103/µl)이 각각 213%, 150%, 50%, 25% 증가하였다. 또한, 병용 투여 그룹인 AGNEX & GCBE 6 mg/kg (5.5±0.2×103/µl)과 AGNEX & GCBE 12 mg/kg (2.2±0.2×103/µl), AGNEX & GCBE 24 mg/kg (4.5±0.2×103/µl)에서 는 각각 585%, 175%, 463% 증가한 것으로 나타났다.

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Fig. 6. Cells were measured in bone marrow to determine the effects of 12 mg/kg Angelica gigas extract (AGNEX), 6, 12, and 24 mg/kg green coffee bean extract (GCEB), AGNEX, and GCBE on neutrophils induced to 1 ml/kg of benzene. Values are expressed as the mean ± SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

장기 무게 변화에 대한 AGNEX와 GCBE의 영향

비장의 경우 정상 그룹(0.20±0.01 g) 대비 benzene 투여 그룹(0.15±0.04 g)이 25% 감소하였다. GCBE 6, 12, 24 mg/kg 그룹에서는 benzene 투여 그룹에 비하여 증가된 경향을 보였지만 유의한 차이는 보이지 않았다(Fig. 7). 간의 경우 정상 그룹(3.08±0.2 g)에 비해 benzene 투여 그룹(3.35±0.23 g)이 8.8% 증가하였으며 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. GCBE 12 mg/kg (3.07±0.12 g)과 GCBE 24 mg/kg (2.96±0.17 g) 그룹에서는 정상 그룹과 비슷한 수치로 감소된 경향을 나타냈지만 다른 그룹의 경우 유의한 차이는 나타나지 않았다(Fig. 8).

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Fig. 7. Effects of 12 mg/kg Angelica gigas Nakai extract (AGNEX), 6, 12, 24 mg/kg green coffee bean extract (GCBE), AGNEX and GCBE on spleen value with 1 ml/kg benzene. Values are expressed as the mean ± SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

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Fig. 8. Effects of 12 mg/kg Angelica gigas Nakai extract (AGNEX), 6, 12, 24 mg/kg green coffee bean extract (GCBE), AGNEX and GCBE on liver value with 1 ml/kg benzene. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test at *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

비장 기능 변화에 대한 AGNEX와 GCBE의 영향

정상 그룹의 경우 림프절(lymph node, LN)이 가장자리 구역(marginal zone, MZ)에 둘러싸여 있고, 적색수질(red pulp, RP)과 경계가 명확하게 구분된 것으로 관찰되었다. 반면, benzene 투여 그룹의 경우 경계가 명확하지 않고 비장에 손상된 부분도 확인할 수 있었다. AGNEX 12 mg/kg 그룹의 경우 적색수질의 경계가 명확하게 구분되고 손상된 부분도 보이지 않았다. 또한, GCBE 6, 12, 24 mg/kg 투여 그룹 모두 적색수질의 경계가 뚜렷하게 구분이 되면서 손상된 부분이 보이지 않았으며 A&G 6, 12, 24 mg/kg 병용 투여 그룹의 경우에도 유사한 모습을 나타내었다(Fig. 9).

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Fig. 9. Effects of 12 mg/kg Angelica gigas Nakai extract (AGNEX), 6, 12, 24 mg/kg green coffee bean extract (GCBE), AGNEX and GCBE on histological feature of spleen with 1 ml/kg benzene (100×). RP (Red Pulp), LN (Lymph nodule), MZ (Marginal zone). (A) Control, (B) BZ (C) AGNEX (D) GCBE6 (E) GCBE12 (F) GCBE24 (G) A&G6 (H) A&G12 (I) A&G24. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

간에서의 CYP450(Cytochrome P450) 발현 변화

Cytochrome P450 1A2 (CYP1A2)와 Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)의 경우 benzene 투여 그룹에서 발현되지 않았으며 AGNEX 12 mg/kg, GCBE 6, 12, 24 mg/kg 단독 투여 그룹과 소재 병용 그룹인 A&G 6, 12, 24 mg/kg 에서도 유의한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 10, 11). Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)의 경우 benzene 투여 그룹과 소재 단독 투여 그룹인 AGNEX 12 mg/kg, GCBE 6, 12, 24 mg/kg에서는 유의한 차이가 없었으며 A&G 6, 12, 24 mg/kg 병용 투여 그룹에서는 약간 증가한 것으로 나타났다(Fig. 12).

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Fig. 10. Comparison of CYP1A2 mRNA expression. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

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Fig. 11. Comparison of CY2E1 mRNA expression. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

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Fig. 12. Comparison of CYP3A4 mRNA expression. Values are expressed as the mean±SD. Statistical analysis was performed by student’s t-test. *p<0.05 compared to control. #p<0.05 compared to benzene. CON, control; BZ, benzene; AGNEX, Angelica gigas Nakai extract 12 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; GCBE 12, green coffee bean extract 12 mg/kg; GCBE 24, green coffee bean extract 24 mg/kg; GCBE 6, green coffee bean extract 6 mg/kg; A&G6, AGNEX&GCBE 6 mg/kg; A&G12, AGNEX&GCBE 12 mg/kg; A&G24, AGNEX&GCBE 24 mg/kg.

고찰

골수독성은 항암치료에 의한 항암제의 부작용이나 화학물질에 노출될 경우 발생하며 골수 내의 조혈기능이 억제되고 조혈전구세포와 줄기세포 손상에 따라 생성되는 백혈구가 감소된다 [1, 27]. 이에 따라 항암치료에 의해 백혈구 감소증이 일어나게 되며 면역기능을 저하시킨다[15]. 항암치료에 의한 백혈구 감소증 초기 관리 방법은 약물의 용량 감소 또는 중단이며 백혈구 증가를 위하여 쓰이는 약물은 과립구 생산을 자극하여 호중구 수를 증진시키는 granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)을 사용한다[5, 24]. G-CSF는 filgrastim, pegfilgrastim 등의 성분을 이용하여 백혈구 수를 신속하게 회복할 수 있게 도와 준다[5, 18]. 이러한 백혈구 촉진제를 사용하여 치료를 진행하였을 때 cytokine으로 인한 인체 항상성 파괴, 뼈 통증, 알레르기와 같은 부작용이 있으므로 부작용이 없는 천연물 소재의 백혈구 증가물질에 대한 연구가 필요한 상황이다[3]. 본 연구는 벤젠으로 유도된 골수독성 모델에서 AGNEX와 GCBE가 백혈구 증가로 인한 면역기능을 향상시켜 골수독성 예방에 대한 효과를 확인하였다. 실험 결과, 추출물 농도에 따른 효과를 확인할 수 있었으며 특히 AGNEX 12 mg/kg과 GCBE 12 mg/kg은 benzene으로 인해 감소된 백혈구, 림프구, 과립백혈구, 호중구 감소에 대한 예방효과가 나타났으며 이는 골수에서의 세포 보호효과가 나타난 것으로 확인할 수 있었다. 또한, 간과 면역기관인 비장의 중량을 측정한 결과, benzene 투여 그룹의 경우 비장의 무게가 감소하였으며 AGNEX 12 mg/kg와 GCBE 12 mg/kg 그룹에서 비장 무게 감소를 예방하였다. 간의 경우 benzene 투여 그룹이 정상 그룹에 비하여 증가하였지만 유의한 차이는 없었으며 커피 생두 추출물 단독 투여 그룹에서는 정상 그룹과 유사한 수치를 나타내었다. 비장의 경우 기능저하에 대한 영향을 측정하기 위하여 비장 조직의 형태적 변화를 확인하였다. 정상 그룹에서는 림프소절이 가장자리 구역에 둘러싸여 있고 적색수질과의 경계가 명확하게 구분되는 것을 확인하였다. 하지만 benzene 투여 그룹에서는 그 경계가 명확하지 않고 손상된 부분도 확인할 수 있었다. AGNEX 12 mg/kg와 GCBE 6, 12, 24 mg/kg 투여 그룹에서는 경계가 명확하고 손상된 부분도 나타나지 않았기에 추출물의 비장 손상 보호효과를 확인하였다. 또한, 체내에서 가장 중요한 약물 대사 효소인 CYP450의 발현 수준을 측정하였을 때 CYP1A2와 CYP2E1, CYP3A4 모두 AGNEX 12 mg/kg, GCBE 6, 12, 24 mg/kg 그룹에서 유의한 차이가 나타나지 않았으며 병용 투여 그룹의 경우 약간 증가됨을 확인할 수 있었다[26]. 이는 AGNEX와 GCBE의 상호작용으로 인한 결과이거나 CYP450효소 활성화 유도로 분해 속도가 높아졌음을 추측할 수 있다. CYP450효소의 발현은 개체 간의 대사나 흡수의 차이가 커 일정하지 않을 수 있으므로 이에 대한 부분은 추가적인 확인이 필요하다.

Table 2. Sequence of oligonucleotide primers for quantitative PCR

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CYP1A2, cytochrome P450 1A2; CYP2E1, cytochrome P450 2E1; CYP3A4, cytochrome P450 3A4.

참당귀 추출물인 AGNEX는 골수 억제 모델에서 백혈구의 수를 증가시키고 적혈구와 혈소판의 수를 정상 범위로 회복시키며 cytokines을 억제하는 효과가 나타난것으로 확인되었으며 커피 생두 추출물의 주성분인 chlorogenic acid은 인체 혈액학적 표지에서 독성이 나타나지 않고 혈구 세포수가 정상으로 유지된다는 것으로 알려져 있다[10, 22]. 결론적으로 본 연구에서는 참당귀 추출물과 커피 생두 추출물의 혈액에서의 혈구세포 보호효과와 골수에서의 세포 보호효과의 가능성을 확인하였으며, 비장손상에 대한 보호효과와 커피 생두 추출물의 간과 비장의 무게 변화에 대한 보호효과를 확인하였다. 용량의 경우 커피 생두 추출물 단독투여 그룹에서는 20 mg/kg을 투여하였을 때 가장 좋은 효과를 나타내었지만, 두 물질을 병용투여 하였을 때 모든 그룹에서 시너지 효과는 관찰되지 않았다. 시너지 효과에 대한 확인은 투여 방법의 변경을통하여 추가적인 확인이 필요하며 혈액과 골수에서의 조혈자극인자의 발현이 확인되지 않아 추가적인 혈구 분화나 면역 관련 cytokines의 확인을 통하여 결과를 보충하면 추후 골수독성 예방에 대한 제품이나 의약품 개발이 가능할 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 보건복지부의 재원으로 한국보건산업진흥원의 보건의료기술 연구개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임(과제고유번호: HR20C0026)

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.

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