Characterization and Purification of Subtilosin A Produced by Bacillus vallismortis MCBL 1012 Isolated from Seasoned Dried Radish

Abstract

본 연구에서는 항균활성을 나타내는 미생물을 선별하기 위해 발효식품에서 다양한 세균을 분리하였다. 박테리오신을 생산하는 한 분리주를 최종적으로 선별하여 16S rRNA 유전자 서열 분석을 통해 Bacillus vallismortis로 동정하고 B. vallismortis MCBL 1012로 명명하였다. B. vallismortis MCBL 1012의 배양 상등액은 주로 그람 양성균에 대해 항균활성을 나타내었다. SEM 사진에 의하면 지시균에 박테리오신을 처리하면 Listeria monocytogenes KCCM 40307, Enterococcus faecium KCCM 12118 및 Streptococcus mutans KCTC 3065의 세포 내용물이 누출되는 것으로 확인되었다. PCR 분석 결과 B. vallismortis MCBL 1012에는 subtilosin A 유전자(sbo A)가 포함되어 있는 것으로 나타났다. 항균 활성은 proteinase K, subtilisin A 및 α-chymotrypsin에 의해 감소되었다. 박테리오신 활성은 40℃와 60℃에서 120분 동안, 80℃에서는 60분 동안 유지했으나 100℃에서는 급격하게 감소하였다. 항균활성은 pH 4.0-8.0 범위에서 온전히 유지되었다. 항균활성은 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란과 같은 유기용매 100%까지는 영향을 받지 않았으나, 이소프로판올 40%, 아세톤 80% 이상에서는 감소하였다. 시험한 대부분의 무기염 및 세제는 시험 농도의 CuSO₄ 및 NiSO₄를 제외하고 항균 활성에 영향을 미치지 않았다. 박테리오신은 L. monocytogenes KCCM 40307에 대한 살균작용을 통해 항균활성을 나타내었다. 박테리오신은 황산암모늄 농축, DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 및 RP-HPLC등을 통해 정제하였다. 정제 결과 최종 수율은 0.03%, 비활성은 283.7배 증가하였다. MALDI-TOF MS 분석을 통해 정제된 박테리오신의 정확한 분자량은 3,326.1 Da로 측정되었다.

In this study, diverse bacterial strains were isolated from fermented foods to screen those with antibacterial activity. Among them, one strain, identified as Bacillus vallismortis MCBL 1012 through 16S rRNA gene sequence analysis, was selected for its bacteriocin production. The culture supernatant of B. vallismortis MCBL 1012 showed antibacterial activity, mainly against Gram-positive bacteria. Scanning electron microscopy (SEM) revealed that bacteriocin treatment led to cellular content leakages in Listeria monocytogenes KCCM 40307, Enterococcus faecium KCCM 12118, and Streptococcus mutans KCTC 3065. PCR analysis confirmed B. vallismortis MCBL 1012 harbored subtilosin A gene (sbo A). Antibacterial activity was decreased by proteolytic enzymes like proteinase K, subtilisin A, and α-chymotrypsin. The bacteriocin demonstrated stability at 40℃ and 60℃ for 120 min, and up to 80℃ for 60 min, with rapid activity loss at 100℃. It retained full antibacterial activity within a pH range of 4.0 to 8.0 and was not affected by up to 100% organic solvents like ethanol, methanol, acetonitrile, and tetrahydrofuran. Nevertheless, activity decreased with more than 40% isopropanol and 80% acetone. Most tested inorganic salts and detergents had no effect on antibacterial activity except, CuSO₄ and NiSO₄ at specified concentrations. The bacteriocin exerted its antibacterial effect through bactericidal action against L. monocytogenes KCCM 40307. The bacteriocin was purified by ammonium sulfate precipitation, DEAE anion exchange chromatography, and RP-HPLC. The purification resulted in a final yield of 0.03% and a 283.7-fold increase in specific activity. MALDI-TOF MS analysis determined the exact molecular weight of purified bacteriocin to be 3,326.1 Da.

서론

식중독을 유발하는 식품 관련 병원성 미생물로부터 식품을 안전하게 장기간 보존하기 위해 다양한 방법이 사용되고 있다. 가열, 초고압, 방사선과 같은 물리적 방법과 알코올, 염소, 과산화수소 등을 이용하는 화학적 방법이 사용되어 왔다. 이외에도 다양한 보존방법이 개발되었으며 nitrates, sulfites, benzoates, formaldehyde, sorbates 등과 같은 합성 방부제가 비용과 편의성 측면에서 주로 사용되고 있다. 그러나 합성 방부제는 물질의 사용량과 종류에 따른 알레르기 반응이나 체내 축적성과 같은 건강상의 안전 문제를 유발할 수 있어 현대의 소비자들은 합성 방부제를 기피하는 경향을 보인다. 따라서 천연 식품 보존제에 대한 관심과 수요 증가를 충족시키기 위해 식물 추출물, 유기산, 미생물이 생산하는 항균 펩타이드 및 단백질 등이 주목받고 있다[8, 9, 11, 18, 27].

박테리오신은 미생물이 생산하는 천연의 항균 펩타이드 또는 단백질성 물질로 다른 미생물의 생육을 저해하기 위해 리보솜에서 합성되며, 다양한 박테리아 및 진균류에 대해 살균 또는 정균 효과를 나타내어 광범위한 저해 스펙트럼을 나타내는 것으로 알려져 있다[12-14]. 박테리오신은 식품의 맛, 냄새 등 관능적 측면에 영향을 주지 않으면서 섭취 시 위장관에서 단백질 가수분해효소에 의해 쉽게 분해되어 잔류성이 없고 인체에 무해하다는 점에서 안전한 생물 보존제로서 활용 가치가 증대되고 있다[7, 17].

최초로 보고된 박테리오신은 Escherichia coli가 생성하는 colicin이다[6]. 일반적으로 Generally Recognized As Safe (GRAS)로 인정된 유산균이 생산하는 박테리오신이 가장 많이 연구되고 있으며, 대표적으로 Lactococcus lactis가 생산하는 nisin이 산업적으로 이용되고 있다[25]. Nisin은 1988년 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받아 식품 보존제로 다양한 국가에서 사용되고 있으며, 국내에서는 가공 치즈와 두류 가공품의 보존제로 허가되어 사용되고 있다. 하지만 낮은 pH 범위에서 활성을 나타내기 때문에 일반적인 적용이 제한되며, 일부 미생물은 세포벽 변형, 생물막 형성 또는 저항성 단백질 발현과 같은 다양한 메커니즘을 통해 선천적으로 nisin에 저항성을 나타내는 것으로 보고되었다[10]. 따라서 신규 박테리오신을 발견하기 위한 연구가 지속적으로 필요하며, Bacillus 속은 성장률이 빠르고 높은 세포 외 단백질 분비 능력 등 다양한 측면에서 산업적으로 중요한 미생물이다[28].

Bacillus 속이 생산하는 박테리오신은 비교적 넓은 항균 활성범위를 보이며, 구조적으로 다양한 항균 펩타이드를 생산한다[31, 33]. Bacillus subtilis가 생산하는 박테리오신이 단백질 구조와 유전적 측면에서 광범위하게 연구되었으며, 대표적으로 subtilin, ericin S와 ericin A, sublancin 168, mersacidin, subtilosin A 등이 있다. 이 외에도 Bacillus halodurans가 생산하는 haloduracin, Bacillus licheniformis가 생산하는 lichenicidin, lichenin, Bacillus coagulans가 생산하는 coagulin, Bacillus thuringiensis가 생산하는 thuricin 17, thurincin H, thuricin S, bacthuricin F4, thuricin 439, Bacillus cereus가 생산하는 cerein MRX1, cerein 7A 및 7B, Bacillus megaterium이 생산하는 megacin 등 다양한 박테리오신이 보고되었다[1, 31]. 이와 같이 Bacillus 속이 생성하는 항균물질은 종류가 다양하고 일반적으로 pH와 열에 대한 안정성이 높은 것으로 알려져 다양한 산업분야에서의 효용성이 기대되고 있다[16].

의약적 관점에서 박테리오신은 기존 항생제에 대한 박테리아 내성이 증가함에 따라 인간의 감염치료를 위한 대체 항균제로서 관심이 커지고 있다[20]. 박테리오신과 기존의 항생제는 서로 다른 세포 표적에 작용하기 때문에 교차 내성은 거의 보고되지 않았으며, Bacillus 속이 생산하는 일부 박테리오신은 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 및 vancomycin-resistant enterococci (VRE)와 같은 항생제 내성 균주에 대해 항균 활성을 나타낸다. 대표적인 예로 pumilicin 4 또는 lantibiotics인 lichenicidin, haloduracin, mersacidin 등이 있다[1]. 축산산업 측면에서 Stern 등[32]은 박테리오신 제제의 식이 투여를 통해 가금류에서 Campylobacter jejuni의 증식을 감소시켜 캄필로박터균 감염증의 위험을 감소시킨다고 보고하였다. 또한, 포도상구균에 대해 강력한 억제활성을 가진 Bacillus 속 유래 박테리오신은 젖소 유방염 제어에 효과가 있는 것으로 알려졌다[4]. 식품산업 측면에서 식품가공 중 발생하는 열 및 pH 조건에서 안정적인 박테리오신을 통해 우유와 치즈 같은 유제품과 다양한 식품의 부패 및 병원성 박테리아의 성장을 억제하는 보존제로서 응용이 가능하다[29].

본 연구에서는 조미 무말랭이 무침에서 분리한 B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 박테리오신의 특성을 규명하고 정제함으로써 박테리오신을 다양한 목적으로 활용하기 위한 기초 연구를 수행하고자 한다.

재료 및 방법

박테리오신 생산주의 분리 및 선별

다양한 식품으로부터 박테리오신 생산주를 분리하기 위해 김치, 된장, 젓갈, 장아찌 등의 시료를 수집하였다. 시료를 균질화하고 멸균 증류수로 10^-1‒10^-6까지 연속 희석한 후 Lactobacilli de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 고체배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 형태학적 특성에 근거하여 단일 집락을 분리하고 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 12시간 이상 배양하여 상등액을 회수하였다. Agar well diffusion method를 이용하여 Listeria monocytogenes KCCM 40307 외 9종의 지시균에 대한 항균 스펙트럼이 상대적으로 넓은 분리주를 1차 선정하였으며, proteinase K 처리 후 투명환이 사라지는 분리주를 박테리오신 생산주로 최종 선정하였다[5, 16].

박테리오신 생산주 동정

최종 선정된 박테리오신 생산주의 genomic DNA를 분리하고 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) primer를 사용한 PCR을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석한 결과를 GenBank Database와 상동성을 비교하여 동정하였다. 동정 결과를 바탕으로 MEGA 11 프로그램을 이용하여 MUSCLE alignment 알고리즘으로 염기서열을 정렬하였으며, neighbor-joining (NJ)법으로 100회의 bootstrap replication을 수행하여 phylogenetic tree를 작성하였다.

주사전자현미경을 이용한 세포 형태 관찰

세포 표면과 형태를 관찰하기 위해 분리주를 LB 액체배지에 접종하여 37℃, 180 rpm으로 12시간 배양하였다. 원심분리를 통해 세포를 회수하고 PBS buffer로 세척하였다. 세척한 세포를 2.5% glutaraldehyde solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 4℃에서 2시간 동안 1차 고정한 후 OsO₄ (Sigma-Aldrich Co.)로 4℃에서 1시간 2차 고정하였다. 고정이 끝난 세포는 PBS buffer로 세척한 후 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ethanol로 순차적으로 탈수하고 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane (Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Korea)을 처리하여 24시간 이상 건조하였다. 또한, 지시균 세포에 대한 박테리오신의 영향을 확인하고자 L. monocytogenes KCCM 40307, E. faecium KCCM12118과 S. mutans KCTC 3065를 12시간 배양하고 박테리오신 용액을 5%로 첨가하여 2시간 추가 배양하였으며, 원심분리를 통해 세포를 회수한 후 위와 동일한 고정과 탈수 과정을 진행하였다. 건조된 세포는 고분해능 전계방사 주사전자 현미경(JSM-7900F, JEOL, Akishima, Japan)을 이용하여 세포 표면과 형태를 관찰하였다[35].

항균 스펙트럼 조사

지시균을 각각의 배지와 온도에서 12시간 진탕 배양한 후, 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)가 포함된 0.8% soft agar에 1% 지시균 배양액을 접종하여 test plate를 제조하였다. Test plate에 6 mm 직경의 well을 만들고 상등액 50 μl를 분주하여 배양한 후 well 주위에 나타나는 투명환의 직경을 측정하였다[3, 21].

박테리오신 유전자 확인

DNeasy^® Blood & Tissue Kit (Quiagen, Hilden, Germany)로 B. vallismortis MCBL 1012의 genomic DNA를 분리한 후, Maxim^TM PCR PreMix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 Table 1과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 1.6% Agarose gel 전기영동을 통해 PCR product를 확인하였다.

Table 1. Primer sequences and PCR conditions for amplification of bacteriocin genes

물리화학적 특성 조사

박테리오신에 대한 가수분해효소의 영향을 확인하기 위해 Sigma-Aldrich Co.에서 구입한 proteinase K (30 U/mg), subtilisin A (10 U/mg), carboxypeptidase A (73 U/mg), trypsin (13,500 U/mg), lipase (4,307 U/mg), α-chymotrypsin (83.9 U/mg), α-amylase (760 U/mg)를 각각의 50 mM Tris 완충액(pH 7.5)에 20 mg/ml 농도로 녹인 후 농축된 시료에 최종농도가 2 mg/ml가 되도록 혼합하였다. 반응액은 각 효소에 따른 최적 온도에서 3시간 반응시켜 잔존 활성을 확인하였다.

박테리오신의 열 안정성을 확인하기 위해 농축액을 40℃, 60℃, 80℃ 및 100℃에서 2시간 처리하면서 30분 간격으로 시료를 회수하여 잔존 항균활성을 측정하였다. 또한, Speed Vac concentrator (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 농축된 시료를 증발시킨 후 동일한 부피의 glycine-HCl buffer (pH 2.0), phosphate-citrate buffer (pH 4.0, 6.0), Tris-HCl buffer (pH 8.0), glycine-NaOH buffer (pH 10.0, 12.0)를 첨가하여 3시간 후 남아 있는 항균활성을 측정하여 pH에 대한 안정성을 확인하였으며, 같은 부피의 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 농도의 ethanol, methanol, acetonitrile, acetone, isopropanol 및 tetrahydrofuran에 녹이고 3시간 후 잔존 항균활성을 측정하여 유기용매에 대한 안정성을 확인하였다. 계면활성제 및 염에 대한 안정성을 확인하기 위해 동일한 부피로 Tween-20, Tween-80, Triton X-100, Triton X-114, sodium dodecyl sulfate (SDS), ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), sodium chloride (NaCl), magnesium chloride (MgCl₂), zinc chloride (ZnCl₂), copper (Ⅱ) sulfate (CuSO₄), nickel sulfate (NiSO₄)을 첨가하여 상온에서 3시간 반응시킨 후 잔존 항균활성을 확인하였다.

정량적인 항균활성은 시료용액을 멸균수로 2배씩 연속 희석하여 투명환을 생성하는 최대 희석률의 역수를 arbitrary unit (AU)으로 정의하고, 시료 1 ml로 환산하는 계수(20)를 곱하여 AU/ml로 나타내었다.

박테리오신 작용기작

B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 박테리오신이 지시균의 성장과 증식을 정지시키는 정균제(bacteriostatic)와 세균을 완전히 사멸시키는 살균제(bactericidal) 중 어떤 기작으로 작용하는지 확인하기 위해 대표적인 식품 병원성 미생물인 L. monocytogenes KCCM 40307을 BHI 액체 배지에 1% 접종한 후 배양하였다. 4시간 배양 후 1,280 AU/ml 박테리오신 용액을 5%로 첨가하여 12시간 진탕 배양하면서 2시간 마다 배양액을 회수하여 600 nm에서 흡광도를 측정하고 배양액을 멸균수로 10배씩 연속 희석한 후 BHI 고체배지에 평판도말하여 나타난 집락 수를 계수하여 배양액 1 ml 당 집락형성단위(CFU/ml)로 나타내었다.

황산암모늄 농축 및 투석

B. vallismortis MCBL 1012의 배양 상등액 1 l를 교반하면서 황산암모늄을 최종 포화농도 80%가 되도록 첨가하였다. 4℃에서 3시간 교반 후 원심분리(8,000 rpm, 40 min, 4℃) 하여 침전물을 멸균수 25 ml에 녹여 농축액과 상등액의 L. monocytogenes KCCM 40307에 대한 항균활성을 확인하였다. 침전된 단백질에 포함된 염을 제거하기 위해 MWCO가 1,000인 투석막(Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)을 이용하여 4℃에서 4 l 증류수로 3시간 4회 투석하였다[21, 26].

음이온 교환 크로마토그래피

황산암모늄 침전법으로 농축 후 투석한 시료를 ÄKTA FPLC system을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하여 박테리오신을 1차 정제하였다. HiPrep^TM DEAE FF 16/10 column (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 이용하였으며, 이동상으로 20 mM MOPS, pH 7.0 완충액(start buffer, A)과 1 M NaCl (elution buffer, B) 용액을 사용하였다. 100% buffer A로 컬럼을 평형화시킨 후 시료 1 ml를 주입하였으며, 컬럼부피의 10배에 해당되는 부피의 0‒100% buffer B로 농도구배를 걸어주어 고정상에 결합된 단백질을 용리하였다. 5 ml/min 유속으로 용리액을 2 ml씩 분획한 후 L. monocytogenes KCCM 40307에 대한 항균활성을 보이는 분획을 모아 증류수에서 투석한 후 동결 건조하였다.

역상 HPLC

동결건조된 시료를 1 ml의 멸균 증류수에 녹여 0.2 μm syringe filter로 여과하였다. Agilent Technologies사의 1260 Infinity HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 장비를 사용하였으며, 바탕선이 안정화될 때까지 100% methanol로 ZORBAX eclipse XDB-C₁₈ column (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 세척하고 buffer A (0.1% TFA in H₂O)로 평형화시켰다. 시료 1 ml를 주입한 후 buffer A로 10분 동안 세척한 후 0‒100% buffer B (100% tetrahydrofuran/0.1% TFA)로 농도구배를 걸어주었다. 0‒10분까지 100% buffer A, 11‒40분까지 buffer B (0‒100% gradient), 41‒60분까지 100% buffer B로 용리하였으며 1 ml/min으로 유속으로 1 ml씩 분획을 회수하여 L. monocytogenes KCCM 40307에 대한 항균활성을 확인하였다.

SDS-PAGE 및 gel overlay assay

FPLC와 RP-HPLC의 활성분획을 농축하여 Novex^TM WedgeWell^TM 4‒20% tris-glycine gel (Novex, Carlsbad, CA, USA)을 사용한 전기영동 분석을 하였다. 전기영동이 끝난 gel을 Coomassie brilliant blue R-250 염색용액(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 염색한 후 탈색용액(10% methanol and 10% acetic acid in H₂O)으로 탈색하였다. 탈색된 gel의 밴드를 확인한 후 정제된 밴드가 박테리오신인 것을 증명하기 위해 gel을 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer로 30분간 3회 반복하여 renaturation 하였다. Gel에 15분간 자외선을 조사시킨 후 1% L. monocytogenes KCCM 40307이 접종된 BHI soft agar로 중층하여 37℃에서 배양한 뒤 투명환이 나타나는 band를 확인하였다.

MALDI-TOF mass spectrometry 분석

정제된 박테리오신의 정확한 분자량을 확인하기 위해 역상 HPLC 활성 분획을 Speed Vac을 통해 용매를 증발시킨 후 ㈜Genomine (Pohang, Korea)에 MALDI-TOF MS 분석을 의뢰하였다. Autoflex Speed LRF (Bruker, Billerica, MA, USA) 장비를 이용하여 분석되었으며, 스펙트럼은 5,000‒8,000 m/z 범위에 걸쳐 스펙트럼 당 5,000 shot에서 수집되었다.

결과 및 고찰

박테리오신 생산주의 선별 및 동정

다양한 식품으로부터 집락의 형태학적 특성에 근거하여 350주를 분리하였으며, 분리주의 배양 상등액을 회수하여 agar well diffusion 법으로 항균활성을 나타내는 50주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 분리주 중 상대적으로 항균활성이 넓으며 proteinase K에 의해 투명환이 소실되는 항균물질을 생산하는 분리주를 최종적으로 선정하였다. 최종 선정된 분리주의 16S rRNA gene sequencing 분석 결과 B. vallismortis (Gen bank accession no.: NR_113994.1)와 99%의 상동성을 보여 B. vallismortis MCBL 1012로 명명하였다. 동정 결과를 바탕으로 MEGA 11 프로그램을 이용하여 Fig. 1과 같이 phylogenetic tree를 작성하였다.

Fig. 1. Phylogenetic tree of B. vallismortis MCBL 1012 based on 16s rRNA gene sequence analysis.

주사전자현미경을 이용한 세포 형태 관찰

B. vallismortis MCBL 1012의 세포형태를 고분해능 전계방사 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 Fig. 2와 같이 전형적인 Bacillus 속의 특징인 간균 형태임을 확인하였다. 지시균에 대한 박테리오신의 사멸효과를 세포수준에서 관찰하기 위해 지시균의 배양액에 박테리오신 농축액을 처리한 후 고분해능 전계방사 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 박테리오신 용액을 처리하지 않은 대조구 세포는 온전한 세포구조를 유지하였으나 박테리오신을 처리한 세포에서는 세포막과 세포벽이 구멍을 형성하거나 파괴되어 세포질 속 내용물이 유출됨을 확인하였다. 이 결과는 Class I lantibiotic 박테리오신의 일반적인 특성과 같이 pore 형성을 통해 세포 사멸을 초래한다는 내용과 일치한다[23]. 따라서 B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 박테리오신은 세포막과 세포벽에 영향을 주어 지시균 세포를 사멸시키는 것으로 판단된다.

Fig. 2. High-resolution field emission scanning electron micrograph (×10.00 k) of B. vallismortis MCBL 1012.

Fig. 3. Scanning electron micrograph of indicator bacterial strains treated with bacteriocin. (A, B: ×20.00 k, C: ×30.00 k).

항균 스펙트럼

B. vallismortis MCBL 1012의 배양 상등액 농축액을 사용하여 9가지 지시균에 대한 항균 스펙트럼을 확인하였다. Table 2와 같이 L. monocytogenes KCCM 40307, S. enteritidis KCCM 12021, E. faecium KCCM 12118, S. aureus subsp. aureus KCCM 40050, B. cereus KCCM 11204, S. mutans KCTC 3065 및 M. lueteus IAM 1056등 주로 그람 양성균에 대해 항균 활성을 나타내었으며, 특히 Listeria에 대한 항균활성이 상대적으로 높게 나타났다. 따라서 투명환이 비교적 크고 선명한 L. monocytogenes KCCM 40307을 본 연구의 주요 지시균으로 사용하였다. B. vallismortis MCBL 1012 농축액과 동일한 농도로 제조한 nisin 용액의 항균활성을 비교한 결과 S. aureus와 M. luteus에 대한 항균활성은 nisin이 더 높았으나 농축액에 대한 L. monocytogenes KCCM 40307, S. enteritidis KCCM 12021 및 S. mutans KCTC 3065의 감수성이 nisin보다 더 높게 나타났다.

Table 2. Comparison of antibacterial activity between concentrated supernatant and nisin (diameter : mm)

박테리오신 유전자 확인

PCR product를 1.6% agarose gel 전기영동을 실시한 결과 증폭된 subtilosin A 유전자인 362 bp에 해당되는 band를 확인하였다(data not shown). B. vallismortis MCBL 1012는 amylocyclicin과 subtilin 유전자는 검출되지 않았다. 증폭된 subtilosin A 유전자의 염기서열을 분석한 후, NCBI의 BLAST를 사용하여 subtilosin A 유전자인 sbo A 유전자(Gene ID: 938512) 와 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 염기서열의 유사성을 나타내기 위해 동일한 서열은 별표(*)로, 염기서열을 정렬하기 위해 도입된 gap은 음의 기호(-)로 나타내었다. B. vallismortis MCBL 1012의 박테리오신 유전자 open reading frame은 sbo A의 염기서열과 완전히 일치하였다.

Fig. 4. Comparison of nucleotide sequences (A) and deduced amino acid sequences (B) between the PCR product (lane 5) and sbo A gene (GenBank Gene ID: 938512). Open reading frames are indicated in bracket.

물리화학적 특성 조사

B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 박테리오신에 가수분해효소를 처리하여 민감도를 확인한 결과를 Table 3에 나타내었다. Subtilisin A, α-chymotrypsin을 처리하였을 때 활성이 완전히 소실되었으며 proteinase K에 대해서도 높은 민감도를 가진 것으로 확인되어 단백질성 또는 펩타이드성 물질임을 확인하였다. α-Amylase에 대해서는 활성의 일부가 감소하여 탄수화물 부분이 항균활성에 관여하는 것으로 추정되며, carboxypeptidase A, trypsin, lipase를 처리하였을 때는 활성 변화가 전혀 나타나지 않아 항균활성에 지질 결합이 영향을 미치지 않는 것으로 추정된다. 여러 단백질 분해효소에 대한 감수성이 다르게 나타나는 것은 아미노산 조성에 특이적인 절단부위의 수가 다르거나 없거나 효소의 반응 조건 및 농도에 따라 영향을 받는 것으로 생각된다.

Table 3. Susceptibility of bactriocin activity to hydrolytic enzymes

(-: no activity; +: 8‒11 mm; ++: 12‒16 mm; +++: 16 mm < inhibition zone)

열에 대한 안정성은 Fig. 5에 나타난 바와 같이 40℃와 60℃에서 120분까지 활성이 온전하게 유지되었으며, 80℃에서는 90분이 지난 후 최대 활성의 50%로 감소하여 120분까지 유지되었다. 100℃에서는 활성이 급격히 감소하여 120분 처리 시 완전히 소실되었다.

Fig. 5. Effect of heat treatment on bacteriocin activity of B. vallismortis MCBL 1012. Bacteriocin solution (1,280 AU/ml) was incubated at indicated temperatures for 120 min and samples were taken at 30 min intervals. The residual antibacterial activity (AU/ml) was measured and expressed as relative activity (%). The symbol: -■-, 40℃; -◆-, 60℃; -●-, 80℃; -▲-, 100℃.

Fig. 6에 나타난 바와 같이 pH에 따른 안정성을 확인한 결과 pH 4.0‒8.0의 범위에서는 온전한 활성을 유지하였으나 pH 2.0과 10.0에서는 활성이 50%로 감소하였다. pH 12.0에서는 활성이 거의 나타나지 않았으며, Liu 등[22]에 따르면 높은 pH 조건에서 hydroxides ions, deprotonated amines, deprotonated hydroxyl group 등이 박테리오과 반응하여 3차 구조를 변화시킴으로써 활성을 감소시킨다고 보고하였다.

Fig. 6. Effect of pH on bacteriocin activity of B. vallismortis MCBL 1012. Bacteriocin solution (1,280 AU/ml) was evaporated and dissolved in equal volume of pH 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 and 12.0 of each pH buffer and then the mixture was incubated at room temperature for 3 hr. The residual antibacterial activity (AU/ml) was measured and expressed as relative activity (%).

여러 유기용매가 박테리오신의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 Fig. 7에 나타내었다. Ethanol, methanol, acetonitrile 및 tetrahydrofuran에서 100% 농도까지 활성의 변화 없이 안정하였다. Isopropanol의 경우 40% 농도에서 활성이 50%로 감소하였으며 100% 농도까지 그 활성이 유지되었다. Acetone의 경우 60% 농도부터 활성이 감소하여 80%와 100%에서는 절반을 유지하였다. 따라서 RP-HPLC를 이용한 정제 시 acetone과 isopropanol을 제외한 용매가 적합한 것으로 확인되었으며 각 용매의 극성을 고려하여 tetrahydrofuran을 선택하였다.

Fig. 7. Effect of organic solvents on bacteriocin activity of B. vallismortis MCBL 1012. Bacteriocin solution (1,280 AU/ml) was evaporated and dissolved in equal volume of 20%, 40%, 60%, 80% and 100% of each organic solvents and then the mixture was incubated at room temperature for 3 hr. The residual antibacterial activity (AU/ml) was measured and expressed as relative activity (%). The symbol: -●-, Ethanol; -▲-, Methanol; -◆-, Acetonitrile; -■-, Acetone; -*-, Isopropanol; -+-, Tetrahydrofuran.

계면활성제 및 염에 대한 안정성을 확인한 결과를 Table 4에 나타내었다. CuSO₄와 NiSO₄를 제외한 계면활성제 및 염에 대해서는 활성이 변하지 않았으나 CuSO₄와 NiSO₄를 처리하였을 때는 활성이 50%로 감소하였다.

Table 4. Effect of detergents and inorganic salts on bacteriocin activity

박테리오신의 작용기작

지시균 L. monocytogenes KCCM 40307을 4시간 배양 후 박테리오신 용액을 첨가였을 때 Fig. 8에 나타난 바와 같이 흡광도 값이 감소하였으며 박테리오신을 첨가하지 않은 대조구는 4‒8 hr 사이에 흡광도 값이 급격하게 증가하는 것을 확인하였다. 생균수 또한 박테리오신 용액을 첨가였을 때 감소하였으며 대조구의 생균수는 증가하였다. 따라서 B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 subtilosin A는 세균을 사멸시키는 살세균성(bactericidal) 작용을 하는 것으로 확인하였다.

Fig. 8. Mode of action of subtilosin A against L. monocytogenes KCCM 40307. The symbol: -●-, absorbance at 600 nm (control); -○-, Log10 CFU/ml (control); -▲-, absorbance at 600 nm (sample); -△-, Log10 CFU/ml (sample).

박테리오신 정제

B. vallismortis MCBL 1012를 1.0 L LB 액체배지에서 37℃, 24시간 배양한 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 배양 상등액을 황산암모늄 침전법을 이용하여 농축한 박테리오신 활성은 2,560 AU/ml로 나타났다. 농축액을 DEAE 음이온교환 크로마토그래피와 역상 HPLC 등을 통해 순차적으로 정제한 결과는 Table 5와 같으며 각 정제 단계마다 BCA assay를 통해 단백질을 정량하였다.

Table 5. Purification table of subtilosin A produced by B. vallismortis MCBL 1012

박테리오신을 일차적으로 정제하기 위해 FPLC를 이용하여 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다. 용출된 분획들을 L. monocytogenes KCCM 40307에 대한 항균활성을 확인한 결과 50‒60번 분획에서 항균활성이 나타났다(Fig. 9).

Fig. 9. DEAE anion exchange chromatogram of subtilosin A. The concentrated culture supernatant was loaded onto a HiPrep^TM DEAE FF 16/10 column and eluted with 0‒1.0 M NaCl gradient in a 20 mM MOPS (pH 7.0) buffer.

음이온교환 크로마토그래피에서 얻은 활성분획들을 투석 및 동결건조 하여 3차 증류수에 용해시킨 후 역상 HPLC를 실시하였다. 용리된 분획 60개의 L. monocytogenes KCCM 40307에 대한 항균활성을 확인한 결과 38번 째 분획에서 항균활성이 나타났다. Fig. 10의 크로마토그램을 확인하였을 때 단일 peak로 나타났고 최종적으로 정제된 박테리오신의 항균활성은 5,120 AU/ml이었다.

Fig. 10. Chromatogram of RP-HPLC. The active fractions from FPLC were loaded onto a ZORBAX eclipse XDB-C₁₈ column and eluted with a gradient of 0‒100% tetrahydrofuran containing 0.1% trifluoroacetic acid. The flow rate was 1 ml/min and elution was monitored by a UV detector at 280 nm.

SDS-PAGE 및 gel overlay assay

음이온 교환 크로마토그래피와 역상 HPLC를 통해 정제된 박테리오신의 순도와 분자량을 추정하기위해 SDS-PAGE를 실시한 결과는 Fig. 11과 같다. 최종적으로 정제된 박테리오신은 단일 밴드가 관찰되어 순수하게 정제되었음을 확인하였다. 분자량이 알려진 표준 단백질과 비교함으로써 B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 박테리오신의 분자량은 약 3.0‒4.0 kDa로 추정하였다. 또한 gel overlay assay를 통해 역상 HPLC로 정제된 단일 밴드가 박테리오신임을 확인하였다.

Fig. 11. SDS-PAGE and detection of antibacterial activity of subtilosin A. (A) Gel stained with Coomassie brilliant blue. (B) Gel overlaid with BHI soft agar containing 1% of L. monocytogenes KCCM 40307. Lane 1: SeeBlue^Ⓡ Plus2 pre-stained protein standard, 2: active fraction from FPLC, 3: active fraction from RP-HPLC.

MALDI-TOF mass spectrometry 분석

역상 HPLC로 최종 정제된 박테리오신을 MALDI-TOF MS 질량분석기로 분석한 결과 Fig. 12에 나타난 바와 같이 B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 subtilosin A의 정확한 분자량은 3,326.1 Da으로 확인되었다.

Fig. 12. MALDI-TOF mass spectrometric analysis of purified subtilosin A.

기존에 보고된 subtilosin A는 B. subtilis ATCC 6633 및 기타 B. subtilis 균주뿐만 아니라 B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus 등의 균주가 생산하는 번역 후 수정(post-translational modification) 과정을 거치는 고리형 펩타이드로 알려져 있다[1]. 그러나 B. vallismortis가 생산하는 subtilosin A에 대한 연구는 아직 이루어진 바가 없다. Babasaki 등[2]이 subtilosin A의 분자량이 3,398.9 Da으로 최초 보고한 것처럼, 본 연구에서 정제한 subtilosin A도 거의 동일한 분자량을 보였다. 또한, L. monocytogenes에 대해 강한 항균활성을 보이며, 세포막과의 특정 상호작용을 통해 기공을 형성함으로써 항균 작용을 한다는 기존에 보고된 subtilosin A의 특성과 일치한다[24, 30, 34]. 조미 무말랭이 무침에서 분리한 B. vallismortis MCBL 1012가 생산하는 subtilosin A는 다양한 식품 관련 병원성 미생물에 대한 항균범위가 넓어 천연 식품보존제로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구에서 크로마토그래피와 역상 HPLC를 이용하여 subtilosin A를 정제하였으나 산업적으로 대량 생산에 적용하기 위해서는 더욱 저렴한 비용으로 효율적으로 정제할 수 있는 다양한 방법의 개발이 요구된다. 또한, 향후 실험으로 항균 스펙트럼을 더욱 극대화하기 위해 다른 물질과의 상승효과에 대한 연구와, 아미노 말단 아미노산 서열분석 및 항균물질의 정확한 구조 분석 등의 추가 연구가 요구된다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.