Inhibitory Effects of Rubus crataegifolius Leaf Water Extract on Adipocyte Differentiation and Adipogenesis in 3T3-L1 Preadipocytes

Abstract

본 연구에서는 산딸기 잎의 항비만 기능성 소재로서의 가능성을 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포에 산딸기 잎 추출물을 처리한 후 중성지방 함량을 측정하고 지방생성과 관련된 여러 단백질의 발현 양상을 측정하였다. 산딸기 잎은 열수로 추출·농축하여 시료로 사용하였으며 추출물의 수율은 4.76%였다. 산딸기 잎 추출물에 의한 3T3-L1 세포 생존율을 측정한 결과, 1,000 ㎍/mL 농도에서 13%의 성장 저해를 확인할 수 있었다. 이에 본 연구에서 시료 처리 농도를 500 ㎍/mL까지 처리하여 실험을 진행하였다. 세포 내 중성지방의 생성은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 감소율은 대조군에 비하여 농도 100, 300, 500 ㎍/mL에서 각각 28.7, 40.8, 51.6%를 나타내었다. 또한 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP-1c, FAS 및 ACC의 발현 억제, p-AMPK 발현 증가로 지방합성이 억제되는 것을 확인하였다. 이상의 결과, 산딸기 잎 추출물이 지방세포 분화 및 지방생성 관련 인자들을 조절함으로서 비만 개선 소재로서의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

In this study, we examined the effects of Rubus crataegifolius leaf on the inhibition of differentiation and adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes to confirm their potential for use as an anti-obesity functional material. Rubus crataegifolius leaves water extracted using hot water were then concentrated for use, with an extract yield of 4.76%. The result of measuring the rate of 3T3-L1 cell survival of Rubus crataegifolius leaf extract (RCLE) showed growth inhibition of 13% at a concentration of 1,000 ㎍/mL. Thus, in this study, experiments were performed using RCLE treatment concentrations up to 500 ㎍/mL. Production of triglycedie in 3T3-L1 cells showed a dose-dependent decrease, and the rate of reduction was 28.7, 40.8, and 51.6% at concentrations of 100, 300, and 500 ㎍/mL, respectively, compared to the control group. In addition, the results confirmed that suppression of lipogenesis was achieved by suppressing the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR γ), CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBP α), sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c), fatty acid synthase (FAS), acetyl-CoA carboxylase (ACC), and increasing the expression of p-activated protein kinase (p-AMPK). Based on these results, it is believed that Rubus crataegifolius leaf extract can be used in the effort to manage obesity by regulating factors related to adipocyte differentiation and adipogenesis.

I. Introduction

서구화된 식습관과 영영소의 과다 섭취로 인해 에너지 불균형이 생겨 비만 인구가 꾸준히 증가하고 있다. 비만은 신체 활동과 성장에 필요한 에너지 요구량을 초과하는 칼로리 섭취로 인해 과도한 지방이 체내에 축적되는 상태로서[1] 단순히 체중만 증가시키는 것이 아니라 심혈관계 질환, 당뇨병, 동맥경화증, 지방간 등의 2차적인 질환을 유발시키는 원인이 되기 때문에 전세계적으로 건강상 문제로 대두되고 있다[2-5]. 비만 발생은 지방전구세포가 지방세포로 분화(adipogenesis)되는 과정에서 생성되는 지방세포의 과잉분화와 비대에 의한 지방의 과잉축적으로 지방세포의 수나 크기의 증가에 의한 것으로 알려져 있다[6-8]. 지방세포의 과잉분화는 세포 증식 및 분화에 의한 것이고 지방세포의 비대는 지방의 축적에 의한 것이다. 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자는 Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), peroxisome dine-adenosine-adenosine-thymidine (CCAAT) /enhancer-binding protein family (C/EBPα, C/EBPβ 및 C/EBPPδ) 및 sterol controlled element-binding protein-1c (SREBP-1c)이다[9], 이들은 생성 관련 유전자의 발현을 유도하고 fatty acid synthase (FAS) 및 acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 같은 지방산 생성 효소의 활성을 촉진한다. 활성화된 FAS 및 ACC는 malonyl CoA를 생산하여 지방산 합성을 촉진하고 이로 인해 중성지방의 축적을 초래하며 이 모든 과정은 전지방세포를 지방세포로 분화하는데 기여한다[10]. 따라서 비만 예방 및 치료를 위해서는 지방전구세포 분화 관련 전사인자, 지방생성 및 분해 관련 효소들의 활성을 조절하는 것이 중요하다고 할 수 있다.

현대인은 비만 치료를 위해 운동이나 식이조절을 하기 보다는 음식물 흡수 억제제, 식용 억제제와 같은 비만치료제를 주로 이용하고 있다. 그러나 비만치료제의 경우 복통, 불안, 변비, 두통 등의 부작용이 발생되므로 안전성이 입증된 치료제 개발이 필요한 실정이다[11]. 이에 천연물 소재를 이용한 안전한 비만 예방 및 치료를 위한 약물 연구가 활발히 진행되고 있다[12-15].

산딸기(Rubus crataegifolius)는 한국, 중국 북동부, 일본 및 러시아 지역에서 널리 자라는 나무딸기의 일종이며 수년 동안 류마티스 관절염, 간염의 치료에 사용되었다[16]. 열매의 경우는 전통적으로 발기 부전, 야뇨증, 정자 변증 및 천식의 치료제로 사용되었고[17], 뿌리의 경우는 항산화, 항암, 항염증, 항균과 같은 다양한 약리적 효과가 있어 만성 간염 및 류마티스 관절염 치료에 사용되었다[18], 산딸기에는 phenolic acids, triterpenoids, flavonoids, ellagitannin 등 다양한 생리활성 화합물과 anthocyanins, epicatechin, ellagic acid, ferulic acid 등의 항산화제가 주된 성분으로 함유되어 있다[19]. 최근 보고된 바에 의하면 산딸기에서 추출한 ellagic acid는 helicobacter pylori에 의한 위염 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다[20].

따라서 본 연구에서는 식용되지 않고 있는 산딸기 잎의 항비만 기능성 소재로서의 가능성을 확인하기 위하여 3T3-L1 전구지방세포를 이용하여 지방세포 분화 억제 및 분화 관련 전사인자 발현 억제, 지방생성 및 분해 관련 효소 발현 조절에 관한 연구를 수행하였다.

II. Methods

1. Sample preparation

본 실험에 사용한 산딸기 잎은 경북 포항에서 구입하여 저온(4℃)에 보관하면서 사용하였다. 산딸기 잎 추출물은 시료 중량에 증류수를 10배(w/v)가 되게 첨가하여 100℃에서 3시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액을 여과하였으며, 동일 조작을 3회 반복하여 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 여과한 후 그 여액을 감압 농축기(Rotary Vacuum Evaporator, N-100, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하여 동결건조하였다. 이를 산딸기 잎 열수 추출물(RCLE, Rubus crataegifolius leaf water extract)로 명명하고, 냉동실(-20℃)에서 보관하면서 실험에 사용하였고 시료의 수율은 4.76%였다.

2. 3T3-L1 cell culture and differentiation induction

3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast cellline)는 지방전구세포는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 분양 받아서 사용하였다. 세포 배양은 100 U/mL penicillin/streptomycin (P/S, Thermo, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone, USA)을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL, USA) 배지를 배양액으로 하여 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 분화를 유도하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 6-well에 1×10⁵ cells/well 분주한 후 confluent 될 때까지 배양한 후, MDI solution (0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin)과 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 시료 RCLE를 농도별로 함께 처리하여 2일간 배양하였다. 분화 유도 2일 후에 RCLE, 10 μg/mL insulin과 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교체하여 3일간 배양하였으며 그 후에는 RCLE, 1% P/S과 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2일마다 교체해주어 세포를 분화시켜 총 8일간 배양하였다[21].

3. Cell toxicity

세포 독성은 CellTiter 96Ⓡ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Medison, WI)를 사용하여 측정하였다. 96-well plate에 3T3-L1 지방전구 세포를 5×10⁴ cells/well로 분주한 후 5% CO₂, 37℃ 조건 하에서 24시간 배양한 다음 RCLE를 농도별(5, 10, 50, 100, 300, 500, 1000 μg/mL)로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 CellTiter 96Ⓡ AQueous One Solution 용액을 20 μL를 각 well에 분주하여 1시간 반응시켜 490nm에서 흡광도를 측정하였다[22].

4. Measurement of fat content

3T3-L1 지방전구세포를 8일 동안 분화시킨 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 10% formaldehyde를 사용하여 실온에서 60분간 고정한 후 60% isopropanol를 이용하여 세척한 다음 Oil Red O 용액을 처리하여 실온에서 염색하였다. 염색 후에 100% isopropanol을 사용하여 세포를 용해시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다[23].

5. Measurement of adipogenesis-related protein expression

RCLE의 처리에 따른 지방세포 분화 관련 분자인 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c, FAS 및 ACC (Cell signaling, USA)의 단백질 발현과 AMPK, MAPKs, NF-κB (Cell signaling, USA)의 인산화를 확인하기 위하여 western blot analysis를 실시하였다. RCLE를 처리하여 8일간 분화한 3T3-L1 지방전구세포는 배지를 제거한 뒤 PBS로 세척하여 lysis buffer (10 mM pH 7.4 Tris-HCl, 5 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질 정량은 bovine serum albumin (BSA)를 표준화한 Bio-Rad protein assay kit를 사용하였다. 단백질을 정량한 뒤 10% SDS-PAGE에서 전기영동하여, membrane으로 transfer하여 1시간 동안 5% skim milk에 blocking 하였다. Blocking 후에 1차 항체를 1시간 반응시키고 HRP가 결합된 2차 항체로 반응시킨 다음, chemiluminescence substrate kit (Amershrm, UK)로 결과를 확인하였다[24].

6. Data Analysis

본 실험의 모든 통계분석은 GraphPad Prism5 (GraphPad Sortware, USA)를 이용하여 시행하였다.실험별 평균±표준편차(Mean±SD)를 표시하고, 각 실험군 내에 차이를 비교하기 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 시행하였다. 사후분석은 Tukey 법을 사용하였으며, 통계적 유의성 검증은 신뢰수준 P<0.05로 설정하였다.

III. Research Results

1. Confirmation of cell cytotoxicity

세포 독성 평가는 일반적으로 세포의 증식과 생존율을 알아보는 것으로서 MTT tetrazolium이 탈수소 효소 작용에 의해 formazan으로 환원되는 정도를 측정하는 MTT 분석법으로 주로 사용한다[25]. 이에 본 연구에서도 산딸기 잎 추출물(RCLE)의 농도별 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포에 미치는 세포 독성 여부를 알아보기 위해 MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과는 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 RCLE을 5∼1,000 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 1,000 μg/mL 농도에서 13%의 성장 저해를 확인할 수 있었다. 이에 본 연구에서 시료 처리 농도를 500 μg/mL까지 처리하여 실험을 진행하였다.

Fig. 1. Effect of RCLE on 3T3-L1 cell viability. Cell viability was determined using the proliferation kit. Cell was treated with RCLE at various concentrations (5, 10, 50, 100, 300, 500, 1000 μg/mL) for 24 h. Values are expressed as a mean ± standard error of three independent experiments. ***p<0.001 as compared with differentiated control.

2. Inhibitory effect on triglyceride production

지방세포 내 중성지방(triglyceride)의 저장은 혈장지질단백질(chylomicron), 초저밀도 지질단백질(very low density lipoprotein, VLDL) 등에 의해 유발되고[26], 중성지방의 축적으로 인해 지방세포내 과포화 지방구가 형성되어 비만이 유발된다[27]. 3T3-L1 지방전구세포는 여러 호르몬과 전사인자들에 의해 지방세포로 분화되면서 세포 내 지방을 축적한다. 그리고 지방전구세포를 Oil red O로 염색할 경우 중성지질, cholesterol ester만이 염색되므로 세포 내 축적된 중성지방을 확인할 수 있다. 지방 전구세포에 축적된 중성지방 염색이 가능하다[28].

3T3-L1 지방전구세포 내 중성지방 생성에 미치는 RCLE의 영향을 알아보기 위해 Oil Red O로 염색된 지방구를 isopropanol로 처리하여 염색액을 추출하여 중성지방의 함량을 측정하였다. 그 결과는 Fig. 2에 나타난 바와 같이 RCLE를 100, 300, 500 μg/mL의 농도를 처리하였을 때 지방세포에 중성지방 축적은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 감소율은 대조군에 비하여 각각 28.7, 40.8, 51.6 %이였다. 또한 지방세포 내에 중성지방의 함량이 대조군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과는 산딸기 에탄올 추출물을 처리한 3T3-L1 지방전구세포와 투여한 동물 실험에서 중성지방의 함량이 대조군에 비해 유의적인 감소를 나타낸 결과[17]와 일치하는 결과를 나타내었다. 이는 딸기류의 주요 성분인 안토시아닌과 엘라지탄닌에 의해 지방 분해가 유도되어 지방 생성 억제에 효과가 있는 것으로 알려져 있다[29-31]. 따라서 RCLE가 농도 의존적으로 세포 내 중성지방의 축적을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 2. Effect of RCLE on the lipid accumulation in 3T3-L1 cell. Intracellular lipid content was stained with Oil Red O dye, and the stained oil droplets were dissolved with isopropanol and quantified by spectrophotometer analysis at 490nm. The values are expressed the same as in Fig. 1. ***p < 0.001 as compared with MDI-treated control.

3. Expression of transcription factors

지방세포 분화는 지방전구세포가 증식과 분화를 거쳐 성숙한 지방세포로 되는 과정이고 CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs) family, peroxidome proliferator-activitated receptor (PPAR)γ, sterol response element binding protein (SREBP)-1c 등의 발현에 의해 지방분화가 진행되어 세포내 중성지방을 축적한다[27],[32]. 이들 중에 C/EBPα와 PPARγ는 지방세포 분화를 조절하는 핵심 전사인자이며 terminal marker의 발현을 유도하는 것으로 보고되어 있다[33]. 또한 SREBP-1c는 지방세포 분화 촉진과 지방대사 관련 유전자의 발현을 증가시켜 지방 대사를 촉진하는 인자로서 AMPK의 인산화를 통해 조절되며 지방산 합성에 관여하는 acetyl CoA carboxylas (ACC), 지방산 합성효소(FAS) 등의 발현을 조절한다[34],[35].

따라서 본 연구에서는 RCLE가 지방전구세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 C/EBPα, PPARγ 및 SREBP-1c의 단백질 발현을 western blot을 이용하여 확인하였다. 그 결과 Fig. 3에 나타난 바와 같이 분화 유도인자인 MDI만 처리한 경우에서는 C/EBPα, PPARγ 및 SREBP-1c의 단백질 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, RCLE을 농도별(100, 300, 500 μg/mL)로 처리한 경우에서는 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 특히, 농도 1000 μg/mL에서 C/EBPα, PPARγ 및 SREBP-1c의 단백질 발현은 분화처리군 대비하여 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 이는 중성지방 생성 억제 효과와 유사한 경향을 보였고, Jung et al. [17]의 산딸기 에탄올 추출물 처리시 C/EBPα와 PPARγ의 단백질 발현이 감소되었다는 결과와 일치함을 알 수 있었다. 이 외에도 김다혜 외 [36] 및 최혜영과 김건희[32]이 지방세포 분화와 관련한 전사인자의 발현이 억제되면 지방세포 분화가 억제된다는 연구보고와 일치하였다. 이상의 결과에 의하면 RCLE는 지방전구세포의 분화를 조절하는 주된 전사인자인 C/EBPα, PPARγ 및 SREBP-1c의 단백질 발현을 감소시켜 지방세포 내 지방생성이 감소되는 것으로 판단된다.

Fig. 3. Effect of RCLE on the expression of transcription factors related to adipocyte differentiation. 3T3-L1 cells were stimulated to differentiate in the presence of RCLE (100, 300 and 500 μg/mL). Cell lysates were prepared and subjected to western blotting to detect PPARγ, C/EBPα, and SREBP-1c. The β-actin probe served as protein-loading control.

4. Inhibitory effect on enzymes related to lipogenesis

아세틸-CoA 카르복실라제(acetyl CoA carboxylase, ACC)와 지방산 합성효소(fatty acid synthase, FAS)는 지방합성에 관여하는 효소로서 지방세포 분화 관련 전사인자들에 의해 조절된다[7],[37],[38]. ACC는 지방합성과 콜레스테롤 합성에 관여하는 효소로서 ACC의 인산화 증가로 불활성화될 경우 지방합성을 억제한다[39]. FAS는 acetyl-coenzyme A와 maloyl-coenzyme A로부터 지방을 합성하고 세포 내에 지방 저장을 촉진하는 효소이다[40]. 따라서 본 연구에서는 RCLE가 지방합성 관련 효소의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시료를 농도별로 처리한 뒤 Western bolt analysis를 통해 ACC와 FAS의 발현을 확인하였다. 그 결과 Fig. 4에서 나타난 바와 같이 ACC와 FAS의 발현 양상은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이상의 결과는 RCLE가 지방세포 분화를 유도하는 전사인자들의 발현을 억제시켜 분화된 지방세포가 감소되므로 인해 지방합성에 관여하는 ACC와 FAS가 효과적으로 억제된 것으로 사료된다.

Fig. 4. Effect of RCLE on FAS and ACC expression in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 cells were stimulated to differentiate in the presence of RCLE (100, 300 and 500 μg/mL). Cell lysates were prepared and subjected to western blotting to detect FAS and ACC.

5. AMPK regulation related to lipogenesis and decompose

AMPK(AMP-activated protein kinase)는 신장, 폐 및 지방조직에 분포되어있는 효소로서 당과 지방의 대사에 관여하고 있다. 특히 지방세포에서는 지방분화 및 생성 전사인자들, 지방합성 관련 효소들을 제어하여 체내 지방생성과 지방분해를 조절함으로서 비만 억제와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다[41-43]. AMPK는 인산화를 통해 활성화되어 SREBP-1c, PPARγ 및 FAS 등의 발현을 억제하여 지방합성을 억제하고, ACC의 비활성화와 carnitine palmitoyltransferase (CPT)-1의 활성화를 통해 지방산화를 촉진한다[44-46].

RCLE를 농도별로 처리한 후 3T3-L1 지방세포의 AMPK 인산화를 살펴본 결과 Fig. 5에서 나타난 바와 같이 AMPK는 모든 처리구에서 거의 동일하게 발현하였으나 p-AMPK는 농도의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 RCLE이 AMPK의 인산화를 촉진하여 지방 세포 분화, 지방생성 및 분해 관련된 전사인자들과 지방생성 효소들을 조절함으로서 지방의 축적을 억제하는 것으로 판단된다.

Fig. 5. Effect of RCLE on phosphorylation of AMPK in 3T3-L1 cell. 3T3-L1 cells were stimulated to differentiate in the presence of RCLE (100, 300 and 500 μg/mL). Cell lysates were prepared and subjected to western blotting to detect AMPK and p-AMPK.

IV. Conclusions

본 연구에서는 산딸기 잎의 항비만 기능성 소재로서의 가능성을 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포에 산딸기 잎 추출물을 처리한 후 중성지방 함량을 측정하고 지방 생성과 관련된 여러 단백질의 발현 양상을 측정하였다. 산딸기 잎은 열수로 추출ㆍ농축하여 시료로 사용하였으며 추출물의 수율은 4.76%였다. 산딸기 잎 추출물에 의한 3T3-L1 세포 생존율을 측정한 결과, 1,000 μg/mL 농도에서 13%의 성장 저해를 확인할 수 있었다. 이에 본 연구에서 시료 처리 농도를 500 μg/mL까지 처리하여 실험을 진행하였다. 세포 내 중성지방의 생성은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 감소율은 대조군에 비하여 농도 100, 300, 500 μg/mL에서 각각 28.7, 40.8, 51.6 %를 나타내었다. 또한 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP-1c, FAS 및 ACC의 발현 억제, p-AMPK 발현 증가로 지방합성이 억제되는 것을 확인하였다. 이상의 결과, 산딸기 잎 추출물이 지방세포 분화 및 지방생성 관련 인자들을 조절함으로서 비만 개선 소재로서의 활용이 가능할 것으로 판단된다. 산딸기 잎의 산업적 활용 가치를 향상시키기 위해서는 향후 산딸기 잎의 생리활성 성분에 대한 분리 및 메카니즘에 대한 규명이 필요할 것으로 생각된다.