한국 근해 태평양난바다곤쟁이(Euphausia pacifica)의 유전적 개체군 구조

Genetic Population Structure of Euphausia pacifica in Korean Waters

Abstract

We investigated Euphausia pacifica population in Korean waters in 2016 By samplings for genetic structur at five stations. Three sampling stations were located in the middle of the water masses which were clustered by temperature and salinity whereas the other stations were at the boundaries of the water masses. We amplified a 566 bp region and compared it with sequences of E. pacifica distributed in other waters. Sequences were classified two clades, and a clade was formed in the station E. Genetic distance of station E was close to E. pacifica present in Bering Sea, while it was distant to E. pacifica present in Yellow Sea near China. In genetic analysis, seven haplotypes were formed. Hap-1 and Hap-2 were shared in all five stations, while Hap-3 was shared in station W and WS. Four independent haplotypes were present in station E. Haplotype and nucleotide diversity were the highest in station E and the lowest in station S. The F_ST distances between station E and other stations were the highest, but distances among other stations were low. As a result, we concluded that E. pacifica, which is distributed in Korean waters, has a genetic population differentiation in the East Sea (station E).

서론

난바다곤쟁이류는 북태평양, 북대서양, 지중해 그리고 극지역에 이르기까지 다양한 해역에 86종이 보고되었으며, 한국 근해에서는 12종이 분포한다고 알려져 있다(Bucklin et al., 2007; Suh, 2012). 난바다곤쟁이류는 생활사 전체를 부유생활 하며, 이들의 분포 및 현존량은 해류나 수괴등 다양한 해양환경에 의해 영향을 받는다(Vallet et al., 2011). 난바다곤쟁이류의 성체는 유영력을 가지고 있어 수평 및 수직적 분포를 결정할 수 있고, 유전자 흐름을 통해 유전학적 개체군 구조에 영향을 미칠 수 있다(Papetti et al., 2005). 성체는 유영력을 가지고 해류에 의해 분산이 발생하지만 유생은 유영 능력이 없어 여러 단계의 발달을 거친 후 분산이 발생하기 때문에 유생의 분산의 범위는 크지 않은 것으로 알려져 있다(Kirkwood 1996; Brierley and Brandon, 1999; Papetti et al., 2005). 태평양난바다곤쟁이, Euphausia pacifca는 한국, 중국 그리고 일본을 포함한 북태평양에 우점적으로 출현하며(Mauchline and Fisher, 1969; Brinton, 1976), 한국의 서해, 동해, 남해 및 동중국해를 포함한 모든 해역에서 우점한다(Lee et al., 2021). 이들의 성체는 한국 근해에 넓게 분포하나, 유생시기에 제한적으로 분산이 이루어지기 때문에 유전적으로 차이를 보이는 개체군 구조가 형성될 가능성이 있다. 난바다곤쟁이류는 해류 및 수괴의 영향을 많이 받기 때문에 이들이 서식하는 해역의 수괴나 해류를 파악하면 이들의 유전적 개체군 사이의 차이를 파악하는데 도움이 된다(Patarnello et al., 2010). mtDNA는 모계유전으로 돌연변이 속도가 빠르기 때문에 다양한 해양생물의 유전적 개체군 분석에 널리 사용되고 있다(Papetti et al., 2005). mtDNA 분석을 이용한 국외 난바다곤쟁이류의 유전학적 연구에는 남극크릴 중 한 종인 E. crystallorophias의 집단 유전적 차이에 대한 연구(Jarman et al., 2002), 북서대서양과 노르웨이에 서식하는 Meganyctiphanes norvegica의 개체군의 유전적 차이 연구(Papetti et al., 2005)가 있다. 국내의 경우 대하의 계군분석(Hwang et al., 1997; Sung et al., 2007)과 같이 일부 갑각류의 연구만이 실시되었으며 난바다곤쟁이류의 유전적 개체군의 연구는 전무한 실정이다. 따라서 이 연구는 한국근해에 서식하는 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)의 mtDNA의 cytochrome oxidase subunit I (COI) 영역을 분석하여 해역별 유전학적 개체군의 차이를 파악하고자 한다.

재료 및 방법

시료 채집

태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)는 2016년 2월, 3월, 6월, 9월 10월 그리고 11월에 국립수산과학원 탐구 21호(999 ton)를 이용하여 우리나라 동, 서, 남해 그리고 제주주변해역에서 채집되었으며 채집된 시료는 조사선에서 즉시 99% 에탄올에 고정하였다. 시료는 봉고네트(망구 80 cm, 망목 330 μm)를 이용하여 2 knots의속도로 경사 채집하였으며 수온과 염분은 CTD (conductivity, temperature, and depth sensor; Sea Bird Electronics 9 plus; Sea-Bird Electronics, Bellevue, WA, USA)를 이용하여 관측하였다. 유전자 분석을 위한 정점은 Lee et al. (2021)을 참고하여 수온과 염분을 기준으로 station W, station S, station E와 station WS (station W과 station S의 경계 해역), station SE(station S와 station E의 경계 해역)로 각 수괴의 해양환경에 따라 나누어 대표 정점을 선정하였다(Fig. 1). 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca) (Fig. 2)는 Baker et al. (1990) 문헌을 따라 동정하였으며, 집단구조를 파악하기위해 5개의 정점에서 30개체씩 총 150개체를 분석하였다.

Fig. 1. Euphausia pacifica sampling locations for genetic analysis in Korea waters.

Fig. 2. Stereomicroscope photograph of Euphausia pacifica.

유전자 분석

난바다곤쟁이류는 두흉부에 위를 가지고 있기 때문에 유전자 분석 시 먹이생물의 DNA를 배제하기 위해 근육조직으로 이루어진 복부(Harkins, 2006)만 분석에 사용하였으며, ExgeneTM Clinic SV DNA extraction kit (Geneall, Seoul, Korea)의 매뉴얼을 이용하여 total DNA를 추출하였다.

태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)의 primer를 제작하여(Table 1), mtDNA의 COI 영역을 증폭시키기 위해 중합효소연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. AccuPower® PCR Premix에 genomic DNA 4 μL를 첨가한 후 총 양이 20 μL가 될 때까지 3차 증류수를 넣고 thermal cycler (C1000TM; Bio-Rad, Kidlington, Oxford, UK)를 이용하여 다음과 PCR을 수행하였다[Initial denaturation 94°C 2분; PCR reaction 37cycle (denaturation 94°C 30초, annealing 57°C 30초, extension 72°C 1분); final extension 72°C 5분]. PCR 완료 후 PCR product를 1.5 % Agarose gel에 주입한 후 Submarine electrophoresis system (Mupid-2plus)의 100 voltage에서 25분 동안 전기영동 후 밴드 유무를 확인하였다. 이후 gel은 Gel documentation system (Nippon genetics) 상에서 최종 산물을 확인 하였다.

Table 1. Primer sequence used for amplification

COI, Cytochrome oxidase subunit I.

자료 분석

염기서열의 정렬은 BioEdit version 7 (Hall, 1999)의 Clustal W (Thompson et al., 1994)를 사용하여 multiple alignment를 실시하였으며 phylogenic tree는 Neighbor-Joining (NJ) 방법을 이용하였다. Genbank에 등록된 자료를 통해 근연종간의 유전적 거리를 분석하였으며 염기서열간의 유전거리는 Mega X의 Kimura-2-parameter (Kimura, 1980)을 이용하였다. NJ tree의 신뢰도를 높이기 위해 bootstrap 1,000회를 실시하였다. 유전자형 다양도(haplotype diversity, h)와 염기 다양도(nucleotide diversity, π) 분석을 실시하여 개체군의 유전적 다양성을 파악하였다. 유전적 차이는 pairwise F_ST (Arlequinversion3.5.1.2) 수치를 이용하였으며, minimum spanning network를 이용하여 haplotype network를 시각화 하였다(Popart version 1.7). 개체군의 유전적 다양성 패턴의 선택적 중립성과 개체군 평형성을 확인하기 위해 Tajima’s D 값과 Fu’s fs 값을 사용하였으며(Arlequin version 3.5.1.2), demographic history는 mismatch distribution 분석을 실시하였다.

결과

집단간 유전적 거리

mtDNA의 COI은 5개의 해역에서 각각 10개체의 염기서열을 566 bp로 증폭하여 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)의 유전적 거리를 분석하였다. Neighbor-Joining (NJ) Tree 결과 다른 속에 속한 종과 유전적 차이를 보이며 Genbank에 등록된 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)와 일치하였으며 유전자는 2개의 clade로 구분 지어졌다(Fig. 3). Clade A는 station W, station S, station WS 그리고 station SE였고 clade B는 station E가 포함되었다. Clade A와 B의 유전적 거리는 0.17–0.68%로 나타났으며, 각각의 clade 별 유전적 거리는 clade A, B 둘다 0.0–0.51%로 나타났다.

Fig. 3. Phylogenetic relationship of Euphausia pacifica based on mitochondrial genes. The trees were constructed by Neighbor-joining. Bootstrap values for 1000 replications are shown.

유전적 다양성

태평양난바다곤쟁이(E. pacifca) mtDNA의 COI은 각각의 정점 별로 30개의 개체에서 602 base pair를 얻었다. 염기서열을 분석한 결과 station W에서 3개, station S에서 3개, station E에서 6개, station WS에서 2개 그리고 station SE에서 2개의 유전자형(haplotype)이 형성되어 150개 개체에서 총 7개의 유전자형이 형성되었다(Table 2). 5개의 정점의 개체들은 Hap-1, Hap-2의 유전자형을 공유하였으며, 150개 개체에서 86개가 Hap-1의 유전자형을 가지며, Hap-2는 34개체에서 유전자형을 가졌다. Hap-3은 station W와 station WS에서 유전자를 공유하고 있었으며 Hap-4, Hap-5, Hap-6, Hap-7은 station E에서만 나타나는 유전자형이었다. 모든 정점의 h는 station E에서 0.6989로 가장 높았고, station S에서 0.2460으로 가장 낮았다. 염기 다양도(Nucleotide diversity, π)는 station S에서 0.0004으로 가장 낮았고 station E에서 0.0016로 가장 높았다(Table 3). 정점 간 유전적 차이는 station E와 다른 정점에서 유의한 차이가 있었으며(P<0.001), 나머지 정점간에서는 유의한 차이를 확인할 수 없었다(Table 4).

Table 2. Distribution of mtDNA COI haplotypes of Euphausia pacifica

COI, Cytochrome oxidase subunit I.

Table 3. Diversity of nucleotide and haplotypes based on the mtDNA COI of Euphausia pacifica

COI, Cytochrome oxidase subunit I; N, Sample size; N, Number of haplotype; h, Haplotype diversity; π, Nucleotide diversity.

Table 4. Pairwise F_ST values for the mtDNA COI among five stations of Euphausia pacifica

COI, Cytochrome oxidase subunit I; +, P<0.001.

유전구조

mtDNA COI을 이용하여 분석한 유전자형은총 7개의 유전자형을 갖는 것으로 나타났으며, 많은 개체가 가지고 있는 2개의 유전자형을 기준으로 5개의 유전자형이 퍼지는 형태였다(Fig. 4). Station W와 station WS의 유전자형의 개체수가 유사하였다. Station S와 station SE에서는 2개의 유전자형이 존재하였으며, station S는 Hap-1과 Hap-2 유전자형의 비율은 비슷하였으나 station SE는 Hap-1의 유전자형의 개체수가 많았다. Station E는 총 6개의 유전자형을 가지는 것으로 나타났으며, 공통으로 가지는 유전자 형인 Hap-1과 Hap-2의 개체수는 적었고 4개의 단독 유전자형을 가지고 있었다(Fig. 5).

Fig. 4. A single minimum spanning tree of the mtDNA COI haplotype of Euphausia pacifica. Circle size reflects haplotype abundance. COI, Cytochrome oxidase subunit I.

Fig. 5. Haplotype distribution Euphausia pacifica.

집단통계학적 분석

COI을 이용한 τ값은 station W와 station WS에서 3.00으로 가장 높았고, 그 다음으로는 station E가 1.10였다. θ₀값은 모든 정점에서 모두 0이었지만, θ₁은 station S, station E, station SE에서 99999.0으로 높게 나타났다. Tajima’s D는 station S와 station SE를 제외하고 다른 정점에서 음의 값을 나타내었으나 유의하지 않았다. Fu's의 Fs 값 역시 station S와 station SE를 제외하고 다른 정점에서 음의 값이었으나 유의하지 않았다(Table 5).

Table 5. Molecular diversity by sampling stations of Euphausia pacifica

N, Sample size; N, Number of haplotype. Tajima’s D and Fu’s Fs, corresponding P value, and mismatch distribution parameter estimates for each lineage were indicated

고찰

개체군에 대한 이해는 생태학적 특성 연구를 통한 생활사, 형태학적, 표지방류 그리고 유전적 연구방법이 있다(Kim et al., 2013). 유전적 연구를 통한 유전학적 개체군은 제한된 공간 내에서 분포하는 개체들이 생식을 통해 유전자를 교환함으로써 일정한 유전자 조성을 가지는 개체들의 집단이다(Hart and Clark, 1997). 다양한 해양 생물의 유전적 개체군을 연구하는데 mtDNA는 많은 연구에서 사용되고있으며, mtDNA는 모계유전으로 돌연변이 속도가 빠르기 때문에 유전적 다양성을 비교하기에 적합하다(Papetti et al., 2005). 특히 COI은 염기서열상의 결실과 삽입이 거의 없기 때문에 유전적 특성을 연구하는데 많이 이용되고 있으며(Nopriawansyah et al., 2019), mtDNA를 이용한 난바다곤쟁이류의 유전적 개체군 연구를 통해 발견되지 않았던 유전적 분화를 입증하였다(Bucklin et al., 1997).

유전적 개체군은 해류와 지류에 영향을 받고 성체의 이동에 의해 유전자가 흐름에 영향을 미친다(Aksnes and Blindheim, 1996; Bucklin et al., 2000). 한국 근해에서 서식하는 태평양 난바다곤쟁이(E. pacifca)는 20°C이하의 저수온을 선호하며, 해류에 따라 분포에 차이가 있다고 알려져 있다(Lee et al., 2021). 서해는 저수온으로 알려진 Western Korea Coastal Water (2–18°C)가 연안을 따라 흐르고, 서해의 남쪽에는 저층에서는 5–13°C의 Yellow Sea bottom cold water가 존재한다(Chen, 2009). 동해는 1–7°C의 North Korean cold water가 북쪽에서 남쪽으로 흐르고 있다(Oh and Suh, 2006). 따라서 저수온을 선호하는 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)는 해류의 영향을 받아 고수온의 쿠로시오 난류를 경계로 동해(clade B)와 서해, 남해, 남해-서해 경계해역 그리고 남해-동해 경계해역(clade A)로 나뉘어 분포하는 것으로 판단된다.

h와 염기 다양도 분석을 통해 개체군의 진화를 추정할 수 있다. 염기 다양도가 높고 유전자형이 낮은 경우 병목현상 이후 급격한 팽창이 발생하였으며, h와 염기 다양도가 낮은 경우 병목 현상이 발생한것으로 추정할 수 있다(Grant and Bowen, 1998). 북서대서양의 M. norvegica는 h와 염기 다양도가 각각 0.445와 0.005로 낮아(Papetti et al., 2005) 병목현상이 발생한것으로 추정할 수 있다. 또한 이 연구에서도 station E를 제외하고 h가 0.517 이하였으며 염기 다양도도 0.00859로 h와 염기 다양도가 낮아 최근에 개체군내에서 병목 현상이 발생된 것으로 판단된다.

Pairwise F_ST 값은 개체군의 분화 정도를 나타내며 집단 분화의 정도에 따라 3가지로 나눌 수 있다. F_ST value가 <0.05이면 little differentiation, F_ST value가 0.05–0.25이면 moderate differentiation, F_ST value가 >0.25이면 very great differentiation로 구분된다(Wright, 1965). 이 연구에서 station E는 다른 4개의 정점들과 유의한 차이가 있으며, very great differentiation로 판단된다. 해양 갑각류의 mtDNA COI의 돌연변이 비율은 100만년 당 1.4%이다(Guerao et al., 1994). 이를 기준으로 갑각류에 속하는 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)의 팽창 연대를 추정한 결과 65,000년 전에 팽창이 발생한 것으로 추정된다. 베링해 및 태평양에서 유입된 E. pacifiaca가 마지막 빙하기를 거치면서 해수면 하강으로 인해 동해와 남해가 분리되어(Myoung et al., 2016) station E (동해) 분포하는 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)는 서해와 남해 그리고 동중국해에 분포하는 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)와 유전적 개체군 분화가 발생되었을 것으로 판단된다. 난바다곤쟁이류는 상업어종의 주요 먹이원으로서 다양한 연구가 수행되고 있으며, 남극 및 일본에서 조업이 이루어지고 있다. 특히 남극 크릴(E. superba)은 조업의 증가와 환경변화로 인해 국제 위원회에 의해 관리되고 있다(Nicol and Foster, 2016; Kim, 2009). 따라서 본 연구는 상업어종의 주요 먹이원인 태평양난바다곤쟁이(E. pacifca)의 수괴에 따른 유전학적 개체군 구조를 파악하여 난바다곤쟁이 보전에 기초자료를 제공할 수 있으며 나아가 상업 어종의 자원관리에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.