Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Evaluation of Dietary Supplementation with Hydrolyzed Blood Meal for Olive Flounder Paralichthys olivaceus, in Low Water Temperature Conditions

저수온기 넙치(Paralichthys olivaceus) 사료 내 가수분해 혈분(Hydrolyzed Blood Meal)의 이용성 평가

  • Jongho Lim (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Daehyun Ko (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Whajung Cho (AminoLab Co., Ltd.) ;
  • Kyeong-Jun Lee (Marine Science Institute, Jeju National University)
  • 임종호 (제주대학교 해양생명과학과) ;
  • 고대현 (제주대학교 해양생명과학과) ;
  • 조화정 ((주)아미노랩) ;
  • 이경준 (제주대학교 해양과학연구소)
  • Received : 2023.05.11
  • Accepted : 2023.06.29
  • Published : 2023.08.31
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Abstract

This study aimed to evaluate the effects of dietary supplementation with two different types of hydrolyzed blood meal (HBM) on the growth performance, feed utilization, digestibility and innate immunity of olive flounder Paralichthys olivaceus. A control diet (Con) consisting of 60% fish meal was formulated and four diets containing two different types of HBM at varying concentrations were prepared 2.5 and 5.0% liquid HBM (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powdered HBM (P0.5 and P1.0). A total of 450 olive flounder (average body weight: 50±0.07 g) were distributed in 15 tanks (240 L), with three replicate groups per diet. The fish were fed the diets to apparent satiation for 9 weeks and subsequently exposed to Edwardsiella tarda. The results showed that fish fed L2.5, L5.0 and P0.5 diets exhibited significantly higher lysozyme activity compared to those fed the Con and P1.0 diets. During the challenge test against E. tarda, the L5.0 and P0.5 fish groups exhibited higher disease resistance than that of the Con group. These findings indicate that dietary supplementation with HBM could positively effect the innate immunity and disease resistance of olive flounder.

Keywords

서론

혈분(blood meal, BM)은 주로 돼지나 소의 피를 열처리 건조시켜 생산한 것으로 친환경적인 동물성 단백질원료로 알려져 있다(Twahirwa et al., 2021). 사료 내 BM의 첨가는 틸라피아(Oreochromis niloticus; Aladetohun and Sogbesan, 2013), gilthead sea bream Sparus aurata (Gisbert et al., 2015), African catfish Clarias gariepinus (Ogunji and Iheanacho, 2021)의 성장을 증진시키는 효과가 있다고 보고되었다. BM은 Vibrio anguillarum과 Pseudomonas anguilliseptica에 대한 gilthead sea bream의 질병저항성을 향상시키는 것으로 보고되었다(Gisbert et al., 2021). 그러나, 사료에 BM을 다량 사용할 경우 단백질 소화율의 저하와 아미노산의 불균형으로 인해 어류의 성장, 비특이적 면역력, 항산화 및 소화효소 활성의 감소와 같은 부작용이 발생할 수 있다(Twahirwa et al., 2021). 최근 들어, 이러한 부작용을 줄이기 위한 방안으로 BM을 발효하거나 가수분해 시켜 이용효율을 높이는 방법이 주목받고 있다. BM 가수분해물(hydrolyzed blood meal, HBM)은 BM을 가수분해한 형태를 말하며, 어류 사료에 첨가할 경우 사료효율과 면역력을 향상시켜주는 것으로 알려져 있다(Gisbert et al., 2021). 일반적으로 가수분해물은 체내 이용률이 높은 저분자 펩타이드를 다량 함유하고 있으며, 어류의 항균, 항산화, 비특이적 면역력을 향상시키는 생리활성펩타이드(bioactive peptide)를 함유하고 있다(Kim and Wijesekara, 2010). 어류단백질 가수분해물(Siddik et al., 2021), 크릴 가수분해물과 참치 가수분해물(Khosravi et al., 2015), 틸라피아 가수분해물(Gunathilaka et al., 2020) 등의 가수분해한 단백질원료는 넙치(Paralichthys olivaceus)의 소화율을 증진시켜 성장, 비특이적 면역력, 질병저항성을 향상시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 넙치 사료 내 HBM의 첨가에 따른 이용성 평가는 미흡한 실정이다.

넙치는 우리나라의 대표적인 양식어종으로, 2021년 국내 양식생산량은 41,777톤으로 전체 어류양식생산량의 약 46%를 차지한다(KOSIS, 2023). 국내 넙치 양어장에서는 병원균에 의한 질병을 통제하기 위해 항생제를 자주 사용하며 이러한 항생제의 광범위한 사용은 내성균의 발생, 어체 내 항생제의 잔류 및 환경오염과 같은 많은 문제를 초래한다(Kim et al., 2022). 양식산업에서 항생제의 사용을 줄일 수 있는 방안으로 배합사료 내 기능성 첨가제에 관한 연구가 최근 수행되고 있다(Gunathilaka et al., 2020; Siddik et al., 2021). 양식산업에서 주요 세균성 질병인 Edwardsiellosis는 Edwardsiella tarda가 원인균이다. E. tarda는 수온이 15°C 이상이면 감염이 일어날 수 있고, 25–30°C 사이에서 높은 발병을 일으킨다(Jin et al., 2022). 또한 체색흑화, 출혈, 복부팽만, 탈장, 간, 장 복부 궤양 등의 증상을 나타내며 잉어(Cyprinus carpio; Sae-Dui et al., 1984), 틸라피아(Clavijo et al., 2002)와 같은 담수어는 물론 해수어인 넙치(Kim et al., 2022)를 감염시켜 막대한 경제적 손실을 일으키고 있다(Li et al., 2020).

따라서, 본 연구는 넙치 사료 내 HBM의 첨가량과 첨가 형태(액상, 분말)에 따른 넙치의 성장, 비특이적 면역력, 항산화능력, 소화율 및 장 조직 변화에 미치는 영향 뿐만 아니라 E. tarda에 대한 질병저항성에 효과를 조사하고자 수행되었다.

재료 및 방법

실험사료

실험에 사용된 액상과 분말형태의 HBM은 ㈜아미노랩(Sejong, Korea)에서 제공받아 실험에 사용되었다. 액상 HBM은 조단백질이 85%, 조지질이 0.38%, 수분이 80%였으며, 분말 HBM은 조단백질이 92.0%, 조지질이 0.74%이었다. 대조사료(control)는 어분과 대두박을 기초로 조성되었고, 조단백질이 55.8%, 조질이 11.9%로 분석되었다(Table 1). 대조사료에 액상 HBM을 각각 2.5%, 5% 첨가한 실험구(L2.5, L5.0), 분말 HBM를 각각 0.5, 1.0% 첨가한 실험구(P0.5, P1.0)로 총 5개의 실험사료를 제작하였다. 분말형태의 HBM는 함량에 따라 각 사료원에 혼합되었고, 액상 HBM은 증류수와 혼합한 후 사료원과 혼합되었다. 사료원을 혼합한 후, 어유와 증류수(15%)를 첨가하여 펠렛성형기(SP-50; Kumkang ENG, Daegu, Korea)를 이용하여 5 mm 크기로 성형되었다. 실험사료는 건조(24°C, 8 h)시켜 사료 공급 전까지 냉동보관(-20°C)하여 사용하였다.

Table 1. Dietary formulation and proximate composition of experimental diets for olive flounder Paralichthys olivaceus (%, dry matter)

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1Orizon S.A, CO., Ltd., Chile. 2HBM, Porcine blood meal hydrolysate; Aminolab Co., Ltd., Seoul, Korea. 3E-wha oil Co., Ltd., Busan, Korea. 4Lysoforte™ Dry, Kemin Korea Co. Ltd., Seongnam, Korea. 5Mineral mixture contained the following ingredients (g/kg, mixture): MgSO4∙7H2O, 80.0; NaH2PO4∙2H2O, 370.0; KCl, 130.0; Ferric citrate, 40.0; ZnSO4∙7H2O, 20.0; Ca- lactate, 356.5; CuCl, 0.2; AlCl3∙6H2O, 0.15; Na2Se2O3, 0.01; MnSO4∙H2O, 2.0; CoCl2∙6H2O, 1.0. 6Vitamin mixture contained the following amount which were diluted in cellulose (g/ kg, mixture): L-ascorbic acid, 121.2; DL-α tocopheryl acetate, 18.8; thiamin hy- drochloride, 2.7; riboflavin, 9.1; pyridoxine hydrochloride, 1.8; nia- cin, 36.4; Ca-D-pantothenate, 12.7; myo-inositol, 181.8; D-biotin, 0.27; folic acid, 0.68; p-aminobezoic acid, 18.2; menadione, 1.8; retinyl acetate, 0.73; cholecalficerol, 0.003; cyanocobalamin, 0.003.

실험어와 사육관리

사육실험에 사용된 넙치는 제주특별자치도 소재의 양식장에서 구입하여 제주대학교 해양과학연구소로 이송되었다. 실험어는 실험환경 적응을 위해 2주간 순치되었다. 예비사육 후 넙치(50±0.07 g)는 총 15개(5개 실험구, 3반복)의 polypropylene 수조(240 L)에 각 수조 당 30마리씩 무작위로 선택하여 배치되었다. 사육수는 모래여과해수를 사용하여 3 L/min의 유수량이 되도록 조절하였고, 모든 실험수조의 충분한 용존산소 유지를 위해 공기발생기(aeration)가 설치되었다. 사육기간 동안 수온은 11.2–18.4°C로 자연수온에 의존하였다. 광주기는 형광등을 이용하여 12L:12D로 유지되었다. 실험사료는 1일 2회(08:00, 17:30 h)에 걸쳐 만복공급되었고, 사육실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 윤리규정(2022-0009)를 준수하며 총 9주간 진행되었다.

Sampling과 분석

사육실험 종료 시 실험어의 증체율(weight, WG), 일간성장률(specific growth rate, SGR)과 생존율(survival)을 측정하기 위해 무게 측정 16시간전부터 실험사료의 공급을 중단하였다 사료공급량을 조사하여 사료섭취량(feed intake, FI), 사료전환효율(feed conversion ratio; FCR)과 단백질이용효율(protein efficiency ratio, PER)을 계산하였다. 무게측정 후, 수조당 3마리의 실험어를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(100 ppm)으로 마취시킨 후, 내장중량지수(viscerosomatic index, VSI), 간중량지수(hepatosomatic indexes, HSI), 위중량지수(stomachsomatic indexes, SSI), 장중량지수(intestinesomatic indexes, ISI)와 비만도(condition factor, CF)를 측정하기 위해 실험어를 해부하여 간, 위, 장과 내장의 무게를 측정하였다. 위와 장은 액체질소를 이용하여 급속 냉동한 다음 냉동보관(-80°C) 하였다. 전장(foregut) 조직은 70% formalin으로 24시간 동안 고정되었으며, 이후 분석 시까지 70% ethyl alcohol에 보관되었다. 전어체는 일반성분 분석을 위해 수조당 3마리의 실험어를 무작위로 선별하여 냉동보관 하였다(-20°C). 혈액은 마취된 실험어의 미부동맥에서 채혈하였다. 전혈은 헤파린을 처리하여 hematocrit, hemoglobin, nitro-blue tetrazolium (NBT)을 측정하는데 사용되었다. 남은 혈액은 원심분리(5,000 g, 10 min, 4°C)후 혈장(plasma)을 이용하여 aspertate aminotransferase (AST), alanine aminotransferse (ALT)와 total protein 분석에 사용되었다. 나머지 혈액은 상온에서 30분동안 응고시켜 원심분리(5000 g, 15 min, 4°C)후 혈청(serum)을 이용하여 비특이적 면역력과 항산화 활성 분석에 사용되었다.

Hematocrit은 혈액진단원심분리기(Micro Hematocrit VS-12000; Vision Scientific, Daejeon, Korea) (12,000 rpm, 10 min)를 이용하여 측정하였고, hemoglobin, AST, ALT, total protein은 혈액생화학분석기(CH 100plus; RADIM company, Firenze, Italy)를 이용하여 분석되었다. NBT 활성은 Kumari and Sahoo (2006)의 방법을, immunoglobulin (Ig) 수치는 Siwicki and Anderson (1993)의 방법을, anti-protease 활성은 Ellis (1990)의 방법을, lysozyme 활성은 Mohammed et al. (2018)의 방법으로 분석하였다. Superoxide dismutase (SOD) 활성은 SOD assay kit (DoGenBio, Seoul, Korea)를, glutathione peroxidase (GPx) 활성은 GPx kit (Biovision, Milpitas, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

실험사료, 전어체 및 분(feces)의 일반성분은 AOAC (2005) 방법으로 분석되었다. 수분은 상압가열건조법(125°C, 3 h), 회분은 직접회화법(550°C, 4 h), 조단백질은 자동조단백질분석기(Kejltec system 2300; FOSS Analytical, Hillerød, Denmark)로 분석되었고, 조지방은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 분석되었다.

조직은 단계별 알코올(70–100%)에서 탈수과정과 xylene에서 투명화 과정을 거쳐 paraffin으로 포매한 후 microtome을 이용하여 7 µm 두께의 조직 절편을 제작하였다. 조직절편은 hematoxylin & eosin (H&E) 염색 및 봉입 후 광학현미경(DM750; Leica, Bensheim, Germany)으로 관찰되었다.

위는 pepsin 활성을, 장은 amylase, trypsin, lipase와 chymotrypsin 활성 분석에 사용되었다. 적출된 장기는 증류수와 혼합 후, 조직균질기(tissure grinder)를 이용하여 분쇄되었다. 분쇄된 장기는 원심분리(10,000 g, 15 min) 후 상층액을 분리하여 분석에 사용되었다. 단백질 총량(total protein)은 Bradford. (1976)의 방법을 기초로 분석되었으며, pepsin과 amylase 활성은 Worthington (1991)의 방법을, trypsin과 chymotrypsin 활성은 Erlanger et al. (1961)의 방법을, lipase 활성은 Borlongan (1990)의 방법으로 분석되었다.

소화율 평가

평균무게 117 g 내외의 넙치를 이용하여 외관상 소화율을 조사하였다. 소화율사료는 실험사료에 chromium oxide (Cr2O3; DaeJung Chemicals&Metals Co. Ltd., Siheung, Korea)를 1% 첨가하여 제조하였다. 실험어의 분은 소화율 전용 분수집수조(Guelph system)를 이용하여 수집되었다. 넙치는 수조 당 20마리씩 배치되었고, 실험사료는 분수집 8시간 전에 만복 공급되었다. 사료공급 30분 후, 환수를 통해 수조에 남아있는 사료찌꺼기와 이물질을 제거하였다. 수집된 분은 동결 건조 후 분석에 사용하였다. 실험사료와 분의 산화크롬의 함량은 Divakaran et al. (2002)의 방법으로 분석되었다. 실험사료에 대한 소화율은 아래의 식에 따라 계산되었다.

Apparent digestibility coefficient of protein (%) =100-100×(% of Cr2O3 in diet/% of Cr2O3 in feces)×(% of protein in feces/% of protein in diet)

Apparent digestibility coefficient of lipid (%) =100-100×(% of Cr2O3 in diet/% of Cr2O3 in feces)×(% of lipid in feces/% of lipid in diet)

Apparent digestibility coefficient of dry matter (%) = 100-100×(% of Cr2O3 in diet / % of Cr2O3 in feces)

인위감염 실험

사육실험 종료 후, 120 L 수조에 각 15마리(사료구 당 45미)의 실험어를 배치하였다(3반복). E. tarda는 Tryptic Soy Broth (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany)를 사용하여 28°C에서 24시간동안 배양되었다. E. tarda 현탁액(1×106 CFU/mL)은 넙치의 복강 내에 100 µL씩 주입되었다. 공격실험 6일차까지 폐사가 관찰되지 않아 E. tarda 접종농도를 높힌 현탁액(8.4×108 CFU/mL) 100 µL를 재 주사하였다. 인위감염 실험 기간 내 수온은 20°C로 유지되었으며, 총 16일간 진행되었다.

통계학적 분석

실험사료의 배치는 완전확률계획법(completely randomized design)으로 실시하였다. 모든 분석결과들은 SPSS (version 24.0; International Business Machines Co., New York, NY, USA) 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA로 통계 분석하였다. Tukey’s HSD로 데이터 평균 간의 유의성(P<0.05)을 비교하였다. 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 모든 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석하였다.

결과

넙치의 최종평균무게와 WG는 L5.0구가 P0.5구에 비해 유의적으로 높았다(Table 2). FI는 대조구와 실험구 사이에 유의적인 차이는 없었다. FCR, PER, SGR과 생존율은 모든 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다. CF, VSI, HSI, SSI와 ISI는 모든 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 3). 전어체의 조단백질, 조지질과 회분 함량은 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 4). 혈액 내 hematocrit, hamoglobin, AST, ALT, total protein의 농도는 모든 실험구 사이에 유의적인 차이가 없었다(Table 5). Lysozyme 활성은 L2.5구와 P0.5구가 대조구와 P1.0구에 비해 유의적으로 높았다(Table 6). Anti-protease 활성은 L2.5구가 P1.0구에 비해 유의적으로 높았다. SOD 활성은 L2.5구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. NBT, Ig, GPx 활성은 모든 실험구간에 유의적인 차이가 없었다. Pepsin, trypsin, chymotrypsin, amylase, lipase의 활성은 모든 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 7). 건물, 단백질, 지질소화율은 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 8). 장 내 융모의 길이와 배상 세포의 분포는 모든 실험구에서 유의적인 차이가 발견되지 않았다(Table 9, Fig. 1). E. tarda에 대한 넙치의 생존율은 L5.0구(42.2%)와 P0.5구(51.1%)가 대조구(4.44%)에 비해 유의적으로 높았다(Fig. 2).

Table 2. Growth performance, feed utilization and survival of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus (initial body weight, 50.0±0.07 g; average BW, 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks

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1Final body weight (g). 2Weight gain (%)=[(final body weight - initial body weight)/ initial body weight]×100. 3Feed intake (g/fish)=dry feed consumed (g)/fish. 4Feed conversion ratio=dry feed fed/wet weight gain. 5Protein efficiency ratio=fish weight gain (g)/total protein given (g). 6Specific growth ratio (%)=[(loge final body weight - loge initial body weight)/days]×100. Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. Values with different superscripts in the same row are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 3. Morphological assessment of digestive organs and condition factor of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 9 weeks

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1Condition factor=(fish body weight/fish body length3)×100. 2Viscerasomatic index=(viscera weight×100)/fish body weight (g). 3Hepatosomatic index=(liver weight×100)/fish body weight (g). 4Stomachsomatic index=(stomach weight×100)/fish body weight (g). 5Intestinesomatic index=(intestine weight×100)/fish body weight (g). Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 4. Whole body proximate composition of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 9 weeks (% of wet basis)

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Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 5. Hematological parameters of olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW, 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks

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1Aspartate aminotransferase (U/L). 2Alanine aminotransferase (U/L). 3Total protein (g/dL). Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 6. Non-specific immune responses and anti-oxidant enzyme activity of olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW: 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks

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1Nitro-blue tetrazolium activity (absorbance). 2Lysozyme activity (μg/mL). 3Immunoglobulin level (mg/mL). 4Anti-protease activity (% inhibition). 5Superoxide dismutase activity (% inhibition). 6Glutathione peroxidase activity (mU/mL). Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 7. Digestive enzyme activities of olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW, 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks

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1Pepsin activity (U/mg protein). 2Trypsin activity (BAPNA units/mg protein). 3Chymotrypsin (SAPNA units/mg protein). 4Amylase activity (U/mg enzyme). 5Lipase (units/mg protein). Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 8. Apparent digestibility coefficients (ADC) of protein, lipid, dry matter in the experimental diets for olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW, 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks (% of ADC)

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1Apparent digestibility coefficient of protein (%)=100-100×(% of Cr2 O3 in diet/% of Cr2 O3 in feces)×(% of protein in feces/% of protein in diet). 2Apparent digestibility coefficient of lipid (%)=100-100×(% of Cr2 O3 in diet/% of Cr2 O3 in feces)×(% of lipid in feces/% of lipid in diet). 3Apparent digestibility coefficient of dry matter (%)=100-100×(% of Cr2 O3 in diet/% of Cr2 O3 in feces). Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

Table 9. Histological villus length and goblet cell counting of olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW, 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks

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Values are mean of triplicate groups and presented as mean±SD. The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

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Fig. 1. Intestinal histology of olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW, 50.0±0.07 g) fed the experimental diets for 9 weeks. Bar=200 µm. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

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Fig. 2. Cumulative survival of olive flounder Paralichthys olivaceus (average BW, 50.0±0.07 g) during the challenge with Edwardsiella tarda after feeding the experimental diets for 9 weeks. The test diets were prepared to contain 2.5 and 5.0% liquid hydrolyzed blood meal (HBM) (L2.5 and L5.0) and 0.5 and 1.0% powder HBM (P0.5 and P1.0) in the control (Con) diet.

고찰

본 연구에서 사료 내 HBM의 첨가는 넙치의 혈중 lysozyme, anti-protease, SOD의 활성을 향상시키는 것으로 나타났다. 효소를 이용해 단백질을 가수분해하면 생체 내에서 생리활성펩타이드가 생성된다(Kim and Wijesekara, 2010). 크릴 가수분해물과 참치 가수분해물(Khosravi et al., 2015), 틸라피아 가수분해물(Gunathilaka et al., 2020)은 넙치의 비특이적 면역력, 항산화효소 활성을 향상시키는 것으로 보고되었다. 본 연구에서도 HBM의 첨가는 넙치의 비특이적 면역력과 항산화능력을 향상시켰다.

어류 사료에 BM을 적정량으로 사용하면 성장과 사료 섭취율을 높혀주지만, 다량으로 사용하게 되면 부정적인 영향을 미칠 수 있다(Edeh and Gbagi, 2013). 어린 African catfish 사료에 BM을 적정량으로 첨가(7–17%)했을 때는 성장과 단백질이용효율의 저하를 유발하지 않았지만, 과잉 첨가(25–30%)했을 때는 성장이 감소하는 것으로 보고되었다(Ogunji and Iheanacho, 2021). 치어기 gilthead sea bream (1.3–33.8 g)의 연구에서도 HBM을 사료에 적정량 첨가(3–6%)할 경우 성장을 증진시켜 주는 것으로 보고되었다(Gisbert et al., 2015). Silver pompano Trachinotus blochii (10.9–88.1 g)의 경우에서는 사료 내 어분을 BM으로 35%까지 대체가 가능하다고 보고되었다(Hamed et al., 2017). 본 연구에서도 HBM의 첨가(0.5–5%, 9주)는 넙치(50–127 g)의 성장과 건강도(hematocrit, hemoglobin, AST, ALT, total protein)에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 넙치는 온수성 어류로 저수온기에는 체내 소화효소와 물질대사의 활성이 저하되어 어류의 성장과 사료 섭취량이 감소한다(Iwata et al., 1994). 본 연구에서는 넙치의 적수온(21–24°C)보다 낮은 수온(11.2–18.4°C)에서 사육실험이 진행되었다. 따라서, 넙치 사료 내 HBM의 이용효율을 높이기 위해서는 적수온기의 넙치사료에 첨가하는 것이 보다 효율적일 것으로 예측된다. 하지만, 보다 정확한 HBM의 적정 첨가 함량을 알기 위해서는 적수온기의 넙치를 대상으로 한 보충 연구가 요구된다.

소화율과 소화효소 활성은 어류의 건강도, 성장, 대사능력을 분석하는 지표로 사용되고 있다(Hidalgo et al., 1999). Usman et al. (2007)은 tiger grouper 사료 내 어분을 HBM으로 30%까지 대체하여도 사료 소화율에서 차이가 없다고 보고하였다. Ogunji et al. (2020)은 사료에 당나귀 BM이나 소의 BM을 첨가(7%)했을 때 African catfish의 장 내 소화효소(amylase, lipase)의 활성이 증가했다고 보고하였다. 본 연구에서는 액상 HBM을 5%, 분말 HBM은 1%까지 사료에 첨가하여도 소화율과 소화효소 활성에서 차이가 나타나지 않았다. 배상세포(goblet cell)는 점액의 합성과 분비를 통해 소화 과정을 돕고 영양소의 흡수를 용이하게 할 뿐만 아니라 장 표피를 보호하는 역할을 한다(Cerezuela et al., 2013). Kasun et al. (2020)은 배상세포의 수와 융모의 길이가 소화율과 성장에 영향을 준다고 보고하였다. 본 연구에서 HBM은 넙치의 배상세포와 장 융모 길이에 영향을 미치지 않았으며 조직 내 염증반응도 관찰되지 않았다. 따라서 사료 내 HBM의 첨가는 소화율과 성장, 장 염증반응에 어떠한 부정적인 영향을 미치지 않았을 것으로 판단된다.

넙치 사료 내 크릴 가수분해물, 참치 가수분해물, 틸라피아 가수분해물의 첨가는 E. tarda에 대한 질병저항성을 높여주며, 이는 단백질을 가수분해하며 생성되는 생리활성 펩타이드의 영향인 것으로 보고되었다(Khosravi et al., 2015; Gunathilaka et al., 2020). 단백질 가수분해물은 참돔(Pagrus major; Bui et al., 2014), 농어(Lateolabrax japonicus; Liang et al., 2006), 부세(Pseudosciaena crocea R.; Tang et al., 2008)의 질병저항성을 높혀주는 것으로 보고되었다. BM에 포함되어 있는 heme은 H0-1의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있으며, H0-1은 대식세포의 식균작용을 촉진시켜 병원성세균의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다(Canesin et al., 2020). HBM에는 혈액 내 hemoglobin이 가수분해되면서 생성되는 antimicrobial peptide가 함유되어있다(Martínez-Alvarez et al., 2015). Antimicrobial peptide는 어류의 항균과 항산화 활성을 증진시킨다(Nedjar-Arroume et al., 2006). Gilthead sea bream 사료 내 HBM의 첨가는 병원균(V. anguillarum, P. anguilliseptica)에 대한 저항성을 향상시키는 것으로 보고되었다(Gisbert et al., 2021). 본 연구에서도 HBM 첨가구에서 E. tarda에 대한 질병저항성이 향상되었다. 이는 HBM에 함유된 antimicrobial peptide와 생리활성펩타이드가 넙치의 비특이적 면역력, 항산화능력을 향상시켜 E. tarda에 대한 질병저항성을 높였을 것으로 판단된다.

결론적으로, 사료 내 액상 HBM은 5%, 분말 HBM은 1%로 첨가할 경우 넙치의 비특이적 면역력과 항산화능력을 향상시켜 E. tarda에 대한 질병저항성을 어느 정도 높일 수 있을 것으로 사료된다.

사사

이 논문은 2021년도 정부(산업통상자원부)의 재원으로 한국산업기술진흥원의의 지원을 받아 수행된 연구임(P0018265, 2021년 범부처연계형기술사업화이어달리기).

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