폴리도파민으로 코팅된 다공성 PCL/PLGA 복합 폴리머 지지체를 이용한 흉선상피세포의 3차원 세포배양

Three-Dimensional Culture of Thymic Epithelial Cells Using Porous PCL/PLGAComposite Polymeric Scaffolds Coated with Polydopamine

Abstract

생체 면역조직에서는 면역세포의 성장, 분화에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 면역조직 기질세포가 존재하며, 이들은 서로 연결된 3차원적인 그물구조를 형성하면서 그 사이의 공간에 위치한 면역세포와의 상호작용을 통해 다양한 면역반응을 수행한다. 따라서 생체환경을 모사한 면역세포의 배양이 이루어지기 위해서는 면역세포들이 상호작용할 수 있는 3차원적 면역조직 기질세포 뼈대의 구축이 매우 중요한 의의를 지닌다. 특히 면역반응에서 핵심적인 기능을 수행하는 T세포의 생존, 성장 및 분화에 있어서 필수적인 역할을 하는 흉선상피세포에 대한 3차원적 배양은 T세포의 연구에 필수적으로 요구되지만, 아직 이에 관한 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다. 본 연구에서 흉선상피세포는 폴리도파민으로 코팅된 PCL 및 PCL/PLGA 지지체에서 비코팅군에 비해 부착 및 성장이 촉진되었다. 또한 폴리도파민으로 코팅된 지지체에서 흉선상피세포를 배양하였을 때 2차원 배양군에 비해 흉선세포형성촉진인자의 유전자 발현이 더 증가하였다. 따라서 본 연구는 면역조직 기질세포의 3차원 배양 기술의 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

T-cell deficiency may occur in various clinical conditions including congenital defects, cell/organ transplantation, HIV infection and aging. In this regard, the development of artificial thymus has recently been attracting much attention. To achieve this aim, the development of techniques for 3D culture of thymic stromal cells is necessary because thymocytes grown only in a 3D thymic microenvironment can be differentiated fully to become mature, immunocompetent T cells; the same cannot be achieved for thymocytes grown in 2D. This study aimed to develop a nanotechnology-based 3D culture technique using polymeric scaffolds for thymic epithelial cells (TECs), the main component of thymic stromal cells. Scanning electron microscopic observation revealed that the pores of both PCL and PCL/PLGA scaffolds were filled with TECs. Interestingly, TECs grown in 3D on polydopamine-coated scaffolds exhibited enhanced cell attachment and proliferation compared to those grown on non-coated scaffolds. In addition, the gene expression of thymopoietic factors was upregulated in TECs cultured in 3D on polydopamine-coated scaffolds compared to those cultured in 2D. Taken together, the results of the present study demonstrate an efficient 3D culture model for TECs using polymeric scaffolds and provide new insights into a novel platform technology that can be applied to develop functional, biocompatible scaffolds for the 3D culture of thymocytes. This will eventually shed light on techniques for the in vitro development of T cells as well as the synthesis of artificial thymus.

서론

생체 면역조직에서는 면역세포의 성장, 분화에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 면역조직 기질세포(stromal cell)가 존재하며, 이들은 서로 연결된 3차원적인 그물구조를 형성하면서 그 사이의 공간에 위치한 면역세포와의 상호작용을 통해 다양한 면역반응을 수행한다[11]. 하지만 기존의 2차원적 세포배양시스템에서 이루어진 면역반응 측정 방법으로는 생체에서 일어나는 복잡하고 다양한 면역반응을 정확하게 반영하기 어렵기 때문에 실험동물을 이용한 in vivo 실험방법을 통해 이러한 문제점을 극복하고 있는 실정이다. 하지만 in vivo 실험방법은 in vitro 실험방법에 비해 여러 가지 측면에서 비효율적이기 때문에, 최근 기존의 in vitro 및 in vivo 실험방법의 단점을 극복하고 더 많은 장점을 가질 수 있는 실험방법으로서 3차원 in vitro 실험방법이 주목을 받고 있다[1]. 특히 면역반응의 특성을 고려하였을 때, 다양한 자극에 의해 유발되는 생체 면역반응 및 면역세포 사이의 상호작용을 생체 외에서 효율적으로 측정하기 위한 기술을 개발하기 위해서는 면역세포의 3차원적 세포배양 모델을 구축하는 것이 필수적인 요소라고 할 수 있다. 또한 생체환경을 모사한 3차원적 면역세포의 배양이 이루어지기 위해서는 우선적으로 3차원 환경에서 면역세포들을 지지할 뿐만 아니라 상호작용을 통해 면역세포의 성장 및 분화에 관여하는 면역조직 기질세포의 3차원적 뼈대 구축이 매우 중요한 의의를 지닌다[14]. 따라서 본 연구에서는 모든 면역반응에서 가장 핵심적인 기능을 수행하는 T세포의 증식, 생존 및 분화에 필수적인 역할을 하는 흉선(thymus) 기질세포인 흉선상피세포(thymic epithelial cell)를 3차원적으로 배양할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

세포를 3차원적으로 배양하기 위해서는 3차원 환경에서 세포들이 부착하여 성장할 수 있는 생체적합 지지체(biocompatible scaffold)가 필요하다[2]. 지지체의 가공(fabrication) 방법에는 폴리머(polymer), 금속(metal), 유리(glass) 및 세라믹(ceramic) 등이 있는데 그 중에서 폴리머가 가장 흔히 이용된다. 흔히 사용되는 합성 폴리머로서는 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락틱산(poly-lactic acid, PLA), 폴리글리콜산(poly-glycolic acid, PGA), 및 폴리락틱코글리콜산(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)이 있으며 천연 폴리머로서는 콜라겐(collagen), 알긴산염(alginate), 아가로스(agarose), 키토산(chitosan) 및 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 있다[32].

본 연구에서 사용한 폴리머 지지체의 원료인 PCL 및 PLGA는 생분해성 및 생체적합성이 우수하여 FDA 승인을 얻었으며, 조직공학 분야에서 널리 사용되고 있는 생체재료이다[5, 30, 41]. 그러나 PCL은 5개의 비극성 메틸렌기(methylene group)와 1개의 극성 에스테르기(ester group)가 반복되는 지방족의 폴리에스테르(polyester)로 구조상 탄소수가 많아 소수성을 띄는 단점을 가지고 있다[12]. 이와 같이 표면이 소수성을 나타내는 재료의 경우, 단백질의 흡착능이 떨어져 세포의 부착이 느린 속도로 일어나므로 세포의 분화 및 조직 재생이 더디게 일어나는 것으로 알려져 있다[38]. PLGA는 PLA와 폴리글리콜산(poly-glycolic acid, PGA)의 공중합체(copolymer)로서 약물전달, 봉합, 조직재생 및 인공뼈 등 다양한 분야에서 조직공학 재료로 널리 사용되고 있다[15, 24, 28]. 하지만 PLGA는 소수성을 나타내므로 세포와의 부착도가 낮은 문제점을 가지고 있다[9, 10].

따라서 소수성을 띄는 고분자 표면에 대한 세포의 부착과 관련된 문제점을 해결하기 위하여 콜라겐과 폴리엘라이신(poly-L-lysine, PLL)과 같은 성분을 이용하여 폴리머의 표면을 개질하는 방법이 이용되고 있다[26, 29]. 폴리머 지지체의 표면개질에 주로 사용되는 콜라겐은 제1형 콜라겐으로서 섬유아세포, 연골세포, 조골세포, 평활근세포 등에서 합성되어 분비되며 인체의 총 단백질의 25% 정도를 점유하는 생체의 주된 구조단백질로서, 다른 세포외기질(extracellular matrix) 성분과 특이적인 상호작용을 통하여 세포의 증식과 분화에 관여하며 세포 기능 발현에 중요한 환경을 제공하므로 조직공학 분야에서 폴리머 지지체의 표면개질 분자로 자주 이용되어 왔다[34]. 또한 지지체 표면의 물성변화 관찰을 위해 실시한 물 접촉각 변화관찰결과, 콜라겐을 이용한 표면개질은 지지체의 친수성을 증대시키는 효과도 있음이 확인되었다[31]. PLL은 일반적으로 폴리머 지지체와 같은 각종 고체 표면에 강하게 흡착하고 세포 부착을 향상시키기 위해 사용되는 물질로서 양이온성 폴리머 그룹에 속하며 친수성의 아미노기를함유하여 지지체의 표면에 코팅할 경우 세포 표면상의 음이온 부위에 결합하는 특성을 지니고 있다[22].

최근 세포의 부착능을 증가시키기 위해 지지체의 표면개질에 이용될 수 있는 것으로 밝혀진 홍합 접착 단백질 모사 성분의 하나인 폴리도파민(polydopamine)은 여러 종류의 지지체의 표면을 비교적 쉬운 방법으로 친수성을 부여할 수 있는 물질로 알려져 있으며 다양한 생체재료에 널리 응용될 수 있는 가능성을 갖는 물질로 알려져 있다[13, 25, 40]. 홍합 접착 단백질은 일반적으로 실생활에서 사용되는 본드나 테이프 등이 물에 접촉하였을 때 접착성을 잃어버리는 것과 달리 수중환경에서 강한 접착력을 가지기 때문에 세포부착성 표면개질제 연구의 대상으로 많은 관심을 받고 있다[20].

따라서 본 연구는 마우스 흉선상피세포를 대상으로 PCL 및 PCL/PLGA 지지체에서 세포의 파종 밀도와 방법에 따른 세포의 부착 및 성장 특성, 폴리머 지지체의 표면 개질에 따른 세포의 부착 및 형태학적 특성, 그리고 폴리머 지지체에 대한 흉선상피세포의 활성과 관련된 유전자의 발현 변화를 알아보고자 실시하였다.

재료 및 방법

폴리머 지지체의 제조

PCL 및 PCL/PLGA 지지체는 정밀적층가공기술(additive manufacturing technique)의 한 종류인 압출적층기술(fused deposition modeling)을 사용하여 3D 바이오프린터로 출력하여 제작하였다.

PCL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 80℃에서 10분간 가열하여 용융시킨 후, 압력 650 kPa, 증착 속도 80 mm/분으로 금속니들(노즐직경 250 μm)로부터 분사하여 각 층이 직교하게 적층된 구조를 이룬 PCL 지지체를 제조하였다. PCL 지지체의 기공(pore)의 직경은 150 μm, 기공 사이의 벽 두께(line width)는 150 μm 그리고 지지체의 가로, 세로 및 높이는 각 1.0 mm 이었다.

또한 PCL과 PLGA (Sigma-Aldrich)를 유리 용기에서 135℃에서 1:1 중량비로 혼합하고 압력 650 kPa, 증착 속도 80 mm/분으로 금속니들(노즐직경 250 μm)로부터 분사하여 각 층이 직교하게 적층된 구조를 이룬 PCL/PLGA 지지체를 제조하였다[18, 19]. PCL/PLGA 지지체의 기공의 직경은 150 μm, 기공 사이의 벽 두께는 250 μm 그리고 지지체의 가로, 세로 및 높이는 각 1.5 mm 이었다.

세포배양

Simian virus 40 T antigen transgenic 마우스로부터 얻어진 마우스 흉선겉질상피세포주(thymic cortex or cortical reticular cells, CREC) 및 마우스 흉선피막밑상피세포주(thymic subcapsular cortex or thymic nurse epithelial cell, SNEC)는 Dr. Barbara Knowles (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)로부터 분양받았다. 이 세포주를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 U/ml penicillin (Gibco, Thermo Fisher Scientific) 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco, Thermo Fisher Scientific)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, Thermo Fisher Scientific) 완전배지를 사용하여 5% CO2 및 37℃ 조건에서 100 mm dish (SPL Life Sciences, Pocheon, Korea) 혹은 96-웰 플레이트(SPL Life Sciences)에서 배양하였다. 세포들이 subconfluent 상태에 도달했을 때 세포를 0.1 M 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4) 혹은 새 배지로 세척한 후 세포를 배양바닥으로부터 떼어 내기 위하여 0.25% trypsin-EDTA (Gibco, Thermo Fisher Scientific) 혼합용액을 사용하였다. 모든 세포의 배지는 2-3일에 한 번씩 새 배지로 교환하였다.

주사전자현미경을 통한 세포의 파종밀도 및 부착특성 관찰

폴리머 지지체에 대한 적정의 세포 파종밀도를 관찰하기 위하여, PCL 지지체를 자외선(ultraviolet rays, UV) 하에서 70% 에탄올에 1시간 동안 멸균한 후 PBS로 3회 세척하여 세포 배지에 충분히 적신 후 사용하였다. 각각의 지지체에 CREC를 1×10⁵, 3×10⁵, 5×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종하고 세포가 지지체에 부착할 수 있도록 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 지지체가 완전히 잠기도록 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.

폴리머 지지체에 배양된 세포의 형태학적 관찰을 위해, 먼저 예리한 면도칼을 사용하여 CREC가 배양된 폴리머 지지체를 삼등분한 다음, 그 지지체를 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde, Sigma-Aldrich) 고정액으로 2시간 동안 4℃에서 고정한 후 PBS로 10분씩 3회 수세한 다음 1% 오스뮴산(osmium tetraoxide, OsO₄, Sigma-Aldrich)으로 상온에서 2시간 동안 후고정 하였다. 고정이 끝난 표본들을 PBS로 10분씩 3회 수세한 다음 -80℃ 초저온냉장고에서 하루 정도 냉동 후 진공동결건조기(FDS series, ilShin BioBase, Dongducheon, Korea)로 24시간 정도 건조시켰으며 이온 증착기(Ion sputter, E-1010, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 금 도금(gold coating)법으로 표면 처리한 후 주사전자현미경(S-4200, Hitachi)으로 가속전압 20 kV 하에서 관찰하였다.

파종방법에 따른 세포 증식능 측정

PCL 지지체에 대한 세포의 부착률을 높이기 위해 세포를 다양한 방법으로 파종시켰다. 일회표면파종법(single surface seeding)은 반 건조된 폴리머 지지체에 세포를 지지체의 한 면에 일회 파종하는 방법으로서, PCL 지지체를 자외선 하에서 70% 에탄올에 1시간 동안 멸균한 후, 세포배양 배지에서 30분 동안 침지시킨 후, 멸균된 흡지 위에 지지체를 앞, 뒤로 올려놓아 지지체 내의 배지를 제거하여 반 건조상태로 만들었다. 반 건조된 지지체에 1×10⁵ 세포/지지체의 농도의 CREC를 파종하여 세포가 지지체에 부착할 수 있도록 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 지지체가 완전히 잠기도록 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.

다회표면파종법(multiple surface seeding)은 반 건조된 폴리머 지지체에 1×10⁵ 세포/지지체 농도의 CREC를 지지체의 앞, 뒤로 여러 번에 나누어 파종하는 방법이다. 이를위해 폴리머 지지체의 한쪽 면에 0.25×10⁵ 세포/지지체 농도의 세포를 파종한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양한 후, 핀셋으로 지지체를 뒤집은 다음 뒷면에도 같은 방법으로 파종하였다. 이러한 방식으로 2회 반복 후 96-웰 플레이트로 옮겨 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.

부유파종법(suspension seeding)은 폴리머 지지체가 담겨있는 세포배양 배지에 세포를 부유시켜 세포가 스캐폴드에 침투하도록 하는 파종방법으로서, 이를 위해 1×10⁵ 세포/지지체 농도의 CREC를 배지에 부유시켜 일정한 간격으로 피펫팅을 하여, 세포가 지속적으로 부유하게 하였다. 약 10회 이상의 피펫팅 후 세포가 지지체에 부착할 수있도록 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 이러한 방식으로 3-4회 반복 후 96-웰 플레이트로 옮겨 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.

세포의 파종방법에 따른 증식능을 확인하기 위해서 CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Enzo, NY, USA) 시약을 이용하여 세포배양 1일 후 세포의 수를 측정하였다. 세포 증식 평가를 위해 먼저 세포 배양액과 CCK-8 반응 용액을 10 : 1의 비율로 섞어 준비하였다. 그 후 세포 배양액을 모두 제거한 다음 세포가 부착된 지지체에 CCK-8 반응 용액을 지지체가 잠길 정도로 도포하고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 반응을 시킨 후에 마이크로플레이트리더(microplate reader, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

폴리머 지지체의 표면개질에 따른 세포 증식능 측정

폴리머 지지체에 대한 세포의 부착률을 높이기 위해 지지체를 PLL (Sigma-Aldrich), 흰쥐 꼬리에서 분리한 콜라겐(Sigma-Aldrich)과 도파민염산염(dopamine hydrochloride, Sigma-Aldrich)을 사용하여 표면개질을 시행하였다. PLL 표면개질을 위해 PCL 및 PCL/PLGA 지지체를 자외선 하에서 70% 에탄올에 1시간 동안 멸균한 후, PLL과 PBS를 1:100의 비율로 혼합한 수용액에 담가 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 배양시킨 후 PBS에 3회 세척하였다. 그런 다음 PBS를 제거하고 상온에서 3∼4시간동안 건조시켜 사용하였다.

콜라겐 표면개질을 위해 PCL 및 PCL/PLGA 지지체를 자외선 하에서 70% 에탄올에 1시간 동안 멸균한 후, 0.1% 콜라겐 수용액에 충분히 침지시킨 다음 원심분리하여 지지체의 구멍(pore) 사이의 콜라겐 수용액을 제거하였다. 그 후, 37℃ 배양기에서 1시간 동안 겔화(gelation)시킨 후 상온에서 건조하여 사용하였다.

폴리도파민 표면개질은 PCL 및 PCL/PLGA 폴리머 지지체를 자외선 하에서 70% 에탄올에 1시간 동안 멸균한 다음 상온에서 폴리도파민 수용액(2 mg/ml, 9:1)에 16시간 동안 침지시킨 후 증류수로 3회 세척하였다. 세척 후 상온에서 건조하여 사용하였다.

표면개질하지 않은 PCL 지지체와 PLL, 콜라겐 및 폴리도파민으로 표면개질한 PCL 폴리머 지지체 각각에 1×10⁵ 세포/지지체 농도의 CREC를 다회표면파종법으로 파종한 후 주사전자현미경을 이용하여 지지체의 표면개질에 따른 세포의 형태를 관찰하였고, CCK-8 측정법을 이용하여 세포의 증식능을 측정하였다.

Semi-thin 절편 제작

Semi-thin 절편에서 폴리머 지지체에 배양된 세포의 형태학적 특징을 관찰하기 위해 CREC가 배양된 폴리머 지지체를 2.5% 글루타르알데하이드(Sigma-Aldrich) 고정액으로 2시간 동안 4℃에서 고정한 후 PBS로 10분씩 3회 수세한 다음 1% 오스뮴산(Sigma-Aldrich)로 상온에서 2시간 동안 후고정 하였다. 고정이 끝난 표본들을 PBS로 10분씩 3회 수세한 다음 25, 50, 70, 95 및 100% 에탄올에 탈수화시킨 후 100% 에탄올과 epon resin (Sigma-Aldrich)을 1:1로 섞은 용액에서 1시간, 순수 epon resin 용액에 12시간 동안 침지시켰다. 시료는 포매와 중합 과정을 거쳐 semi-thin 절편 제작을 하고 toluidine blue 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.

표면개질에 따른 흉선상피세포의 생존 및 증식능 측정

PCL 및 PCL/PLGA 지지체의 표면을 0.2% 폴리도파민수용액으로 코팅 처리를 시행한 후, CREC 및 SNEC를 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 다회표면파종법으로 파종하였다. 세포의 생존능 및 성장능을 확인하기 위해서 세포배양 1, 3 및 7일 후 CCK-8 방법으로 세포증식능을 측정하였고, 또한 위상차현미경 및 주사전자현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰하였다.

RNA 추출 및 역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 발현 분석

6-웰 플레이트에 CREC를 5×10⁴ 세포/웰의 농도로 파종하여 4일 동안 배양하고, PCL 및 PCL/PLGA 폴리머 지지체에 CREC를 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종하여 21일동안 배양한 다음 CREC의 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Lafayette, LA, USA)를 이용하여 각각 추출하였다. 추출한 RNA는 NFW(Nuclease-Free Water, Qiagen, Valencia, CA, USA)에 녹인 후 nanodrop (Nanodrop 200C, Wilmington, DE, USA)을 이용하여 농도를 측정하였다.

역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 발현 분석을 위해 cDNA 합성 후 2% 아가로즈겔 전기영동을 시행하여 흉선세포형성촉진인자인 과립백혈구-대식세포집락자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) 및 세포간 부착분자-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 프라이머를 이용하여 유전자의 발현을 분석하였고 Image J (National Institutes of Health, Bethseda, MD, USA) 프로그램으로 정량화하여 그래프로 나타내었다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. GM-CSF-sense (5´-GTC ACC CGG CCT TGG AAG CAT-3´) and GM-CSF-antisense (5´-ACA GTC CGT TTC CGG AGT TGG-3´); IL-7-sense (5´-GCC CTG TCA CAT CAT CTG AGT GCC-3´) and IL-7-antisense (5´-CAG GAG GCA TCC AGG AAC TTC TG-3´); GAPDH-sense (5´-TGG AGA AAC CTG CCA AGT ATG-3´) and GAPDH-antisense (5´-TTG TCA TAC CAG GAA ATG AGC-3´).

결과

세포 파종밀도에 따른 폴리머 지지체에 대한 흉선상피세포의 부착 특성 분석

파종밀도에 따른 세포 부착의 정도를 관찰하기 위해 주사전자현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰한 결과, CREC를 1×10⁵ 세포/지지체 농도로 파종한 경우에는 세포가 없는 빈 공간이 많이 보였으나, 지지체에 잘 부착되어 방추형으로 뻗어 있는 세포도 다수 관찰되었다. 하지만 3×10⁵ 세포/지지체 이상의 세포를 파종한 경우에는 지지체에 부착된 CREC의 수는 오히려 감소하였을 뿐만 아니라 세포의 형태도 둥근 모양을 이루는 경우가 많았다(Fig. 1).

Fig. 1. Scanning electron microscopic images of CRECs cultured on PCL scaffolds for 1 day after cell seeding with different densities. Scale bars, top, 500 μm; bottom, 100 μm.

CREC를 1×10⁵ 세포/지지체 농도로 파종하고 배양 1일 후, 주사전자현미경을 이용하여 지지체 내의 세포 분포 특성을 알아보기 위해 Fig. 2의 모식도와 같이 자른 단면에서 지지체 표면에 부착된 세포를 관찰한 결과, 지지체의 중심부 및 하부보다는 상부에 세포가 더 많이 부착함을 확인하였다.

Fig. 2. Scanning electron microscopic images of CRECs cultured on PCL scaffolds to show the distribution of cells at different planes of the scaffolds. CRECs were cultured for 1 day after cell seeding at a density of 1×10⁵. The scaffolds were cut into three pieces with similar thicknesses. The top aspect of each piece of the scaffold was observed. Arrows, CRECs. Scale bars, ×80, 500 μm; ×200, 200 μm.

세포 파종방법에 따른 지지체에 부착된 세포수의 비교

폴리머 지지체에 대한 적절한 세포 파종법을 알아보기 위하여 PCL 폴리머 지지체에 흉선상피세포인 CREC를 일회표면파종법, 다회표면파종법 및 부유파종법으로 파종하고 각각 1일 동안 배양하여 지지체 표면에 세포를 부착시킨 다음, 주사전자현미경 및 CCK-8 측정법으로 세포의 부착 및 증식 특성을 관찰한 결과, 다회표면파종법은 일회표면파종법 및 부유파종법과 비교하였을 때 지지체의 중심부 및 상부에서 세포가 훨씬 더 많이 부착되었으며 또한 더 넓은 지역에 걸쳐 분포함을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 또한 각 지지체에서 세포들의 증식능을 CCK-8 측정법을 이용하여 분석한 결과, 주사전자현미경 관찰 결과와 유사하게 다회표면파종법이 나머지 파종법에 비하여 약 3배 이상의 세포 증식 효과가 있는 것을 알 수 있었다(Fig. 3B).

Fig. 3. Evaluation of cell proliferation by different cell seeding methods. (A) Scanning electron microscopic images of CRECs cultured on PCL scaffolds for 1 day. CRECs (1×10⁵) were seeded by single surface seeding, suspension seeding or multiple surface seeding. Arrows, CRECs. (B) cell proliferation assay for CRECs cultured on PCL scaffold for 1 day by a CCK-8-based cell viability test. Data are presented as a bar graph depicting the means of optical density values ± SD from three independent experiments with 3 replicates (**p<0.01). Scale bar, 500 μm.

복합형질 폴리머 지지체의 표면개질에 따른 흉선상피세포의 부착 특성

PCL 지지체에 PLL, 콜라겐 및 폴리도파민으로 표면개질하여 CREC를 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종 후 1일간 배양하여 주사전자현미경을 통해 관찰한 결과, 폴리도파민으로 표면개질한 실험군은 표면개질을 하지 않은 대조군, PLL 및 콜라겐 표면개질한 실험군의 표면과 비교하였을 때, 부착된 세포의 수가 월등히 많았을 뿐만 아니라 넓은 지역에 걸쳐 고르게 분포하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 표면개질 전후의 세포 증식력을 흉선상피세포 파종 1일 후 CCK-8 측정법을 통해 평가한 결과 도파민으로 표면개질한 PCL 폴리머 지지체에서 가장 높은 증식률을 나타내었다(Fig. 4B).

Fig. 4. Evaluation of cell proliferation by different coating methods. (A) Scanning electron microscopic images of CRECs cultured on PCL scaffolds for 1 day. Scaffolds were coated by PLL, collagen and polydopamine at a concentration as indicated in the Materials and Methods. Arrows, CRECs. (B) Cell proliferation assay for CRECs cultured on PCL scaffold for 1 day by a CCK-8-based cell viability test. Data are presented as a bar graph depicting the means of optical density values ± SD from three independent experiments with 3 replicates (*p<0.05). Scale bar, 200 μm.

PCL/PLGA 지지체에 폴리도파민으로 표면개질 전후의 세포 부착력을 평가하기 위하여, CREC를 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종 후 1일간 배양하여 광학현미경 및 투과전자현미경을 통해 관찰한 결과, 폴리도파민으로 표면개질 하지 않은 PCL/PLGA 지지체에 비해, 폴리도파민으로 표면개질된 PCL/PLGA 지지체에 부착된 세포의 수가 훨씬 더 많이 관찰되었다(Fig. 5). 이러한 결과는 PCL/PLGA 지지체에서 폴리도파민 표면개질이 세포의 부착효과를 증가시킨다는 것을 나타낸다.

Fig. 5. Evaluation of cell attachment by the coating of scaffold surface. Semithin and transmission electron microscopic images of CRECs cultured on PCL/PLGA scaffolds for 1 day. Scaffolds were either non-coated or polydopamine-coated. Arrows, CRECs. Scale bars, Semithin, 50 μm; Ultrathin, 5 μm.

표면개질된 지지체에서의 세포 부착능 및 증식능 평가

PCL 및 PCL/PLGA 폴리머 지지체를 이용하여 폴리도파민으로 표면개질을 함으로써, 세포의 부착력 및 증식력을 높이고자 하였다. 실험군은 표면개질을 하지 않은 PCL군, 표면개질을 하지 않은 PCL/PLGA 대조군, 폴리도파민으로 표면개질한 PCL군 및 폴리도파민으로 표면개질한 PCL/PLGA군으로 총 4군으로 나누었다. 표면개질 후 각 지지체에 흉선상피세포인 CREC와 SNEC를 각각 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종하여 1, 3 및 7일간 배양하여 면역조직 기질세포가 지지체에서의 부착 및 증식능을 CCK-8 측정법을 이용하여 측정한 결과 폴리도파민으로 표면개질한 군이 대조군에 비해 CREC와 SNEC의 증식능이 높게 나타났으며, 또한 배양시간이 경과함에 따라 이들 세포의 증식능이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 6).

Fig. 6. Evaluation of cell proliferation by different types of scaffolds with or without coating of scaffold surface. CRECs and SNECs were cultured on PCL or PCL/PLGA scaffolds for 1 or 3 day(s). Each scaffold type was either non-coated or coated by polydopamine at a concentration as indicated in the Materials and Methods. Cell proliferation was measured by a CCK-8-based cell viability test. Data are presented as a bar graph depicting the means of optical density values ± SD from three independent experiments with 3 replicates (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)

PCL/PLGA 지지체 표면에 폴리도파민으로 표면개질하여 CREC와 SNEC를 각각 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종하여 3일간 배양 후 위상차현미경을 통해 관찰한 결과, 표면개질을 하지 않은 지지체에 비해 폴리도파민으로 표면개질한 지지체의 표면에 더 많은 세포들이 부착되어 있었다(Fig. 7).

Fig. 7. Phase contrast microscopic images of CRECs and SNECs cultured on PCL/PLGA scaffolds for 3 days. Scaffolds were either non-coated or polydopamine-coated. Scale bar, 50 μm.

PCL 및 PCL/PLGA 지지체 표면에 폴리도파민으로 표면개질 하여 CREC와 SNEC를 각각 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종하여 7일간 배양 후 주사전자현미경으로 관찰한 결과 PCL에 비해 PCL/PLGA 지지체에서 CREC와 SNEC의 부착능과 세포질돌기 형성능이 더 뛰어났다. 또한 폴리도파민으로 표면개질한 군이 대조군에 비해 더 많은 수의 흉선상피세포가 부착하였고 인접한 세포와 결합하여 군집을 이루어 성장하는 것을 확인하였다(Fig. 8).

Fig. 8. Scanning electron microscopic images to observe the morphology of the CRECs and SNECs cultured on PCL/PLGA scaffolds for 7 days. Scaffolds were either non-coated or polydopamine-coated. Scale bar, 50 μm.

표면개질된 PCL/PLGA 지지체에 대한 흉선상피세포의 유전자 발현 분석

통상적인 2차원적 세포배양 방법으로 4일 동안 배양한 CREC와 폴리도파민으로 표면개질된 PCL/PLGA 지지체에서 21일 동안 3차원적으로 배양한 CREC를 대상으로 역전사 중합효소연쇄반응법을 이용하여 흉선세포형성촉진인자인 GM-CSF 및 ICAM-1 유전자의 발현 특성을 분석한 결과, 2차원적 세포배양법에 비해 3D 세포배양법에서 이들 유전자의 발현이 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 9).

Fig. 9. Evaluation of gene expression by 2D culture for 4 days or 3D culture of CRECs on polydopamine-coated PCL/PLGA scaffold for 21 days. RT-PCR analysis was performed to measure mRNA levels, and densitometry results are expressed as ratios of GM-CSF and ICAM-1 mRNA normalized to GAPDH mRNA, plotted in a bar graph depicting the means of ratio values ± SD from three independent experiments with 3 replicates.

고찰

본 연구의 목적은 면역반응에서 핵심적인 기능을 수행하는 T세포의 성장 및 분화에 필수적인 역할을 하는 흉선상피세포를 대상으로 (1) 폴리머 지지체에서 세포의 파종밀도와 파종법에 따른 부착 및 성장 특성, (2) 폴리머 지지체의 표면개질에 따른 흉선상피세포의 부착 및 형태학적 특성, 및 (3) 폴리머 지지체에서 3차원 배양된 흉선상피세포의 T세포형성조절유전자의 발현 특성을 알아보고자 하는 것이다.

폴리머 지지체에서의 세포의 파종밀도에 따른 흉선상피세포의 부착 특성을 관찰한 결과, 고밀도에 비해 저밀도에서 세포가 지지체에 더 잘 부착되어 방추형으로 뻗어있는 세포가 더 많은 것으로 나타났다. 세포를 3차원 지지체에서 배양하였을 때 낮은 세포 파종밀도에서 시작하여 점차적으로 증가시키면 세포 간 상호작용과 내인성 신호분자를 통한 세포간 신호가 증가하여 이웃 세포에 의한 다른 세포에 대한 세포외기질 분비를 촉진하여 세포의 기능이 향상된다는 보고가 있다[3, 17]. 이러한 경향은 특정 세포 스캐폴드 구조에 대해 최적의 세포 파종밀도에 도달할 때까지 계속되는데, 세포 파종밀도가 최적 밀도를 초과하면 많은 세포가 공유해야 하는 제한된 영양소, 지나치게 밀집된 세포의 저산소증 및 불충분한 노폐물 제거 등의 요인으로 인해 인접한 세포 사이의 틈새이음(gap junction)을 통한 접촉-억제(contact-inhibition) 현상이 유도되어 세포 증식을 억제하고 결과적으로 세포 기능의 저하를 초래하는 효과를 나타낼 수 있다[39]. 따라서 세포 파종밀도와 관련된 본 연구 결과도 이와 유사한 기전과 관련되어 있을 것으로 생각된다.

폴리머 지지체에 대한 3가지 종류의 세포 파종법을 비교한 결과, 일회표면파종법 및 부유파종법에 비해 다회표면파종법이 세포 파종효율이 훨씬 더 높았다. 폴리머 지지체에 세포를 파종할 때 가장 일반적으로 사용되는 방법은 부유파종법이다[27]. 부유파종법은 간단하고 빠르며 최소한의 기술 요구 사항으로 거의 모든 실험실에서 실행 가능하며 세포에 대한 유체역학적 손상이 최소화될 수 있는 장점이 있다[6]. 또한 일반적으로 사용되는 정적(static) 부유파종법에 비해 폴리머 지지체를 생물반응기(bioreactor) 내에 침지시킨 후 세포부유액을 교반시켜 주는 동적(dynamic) 부유파종법은 세포 파종효율이 증가한다는 보고도 있다[35]. 하지만 부유파종법은 제한된 침투, 불균일한 분포 및 낮은 파종효율성을 초래할 수 있는 잠재적인 단점이 있는데, 이러한 제한점은 부유파종법으로 파종된 세포는 확산과 중력에 의존하여 지지체에 부착하기 때문으로 여겨진다[4, 8]. 또한 지지체 내의 구멍에 존재하는 많은 양의 공기가 구멍을 막아 세포 파종의 효율을 저하시킬 뿐만 아니라 세포막의 손상도 유발할 수 있다는 사실이 알려졌다[7, 33]. 따라서 부유파종법을 시행할 때는 지지체 내부의 공기주머니(air pocket)를 제거하는 것이 특히 중요하다고 할 수 있다[33]. 또한 일회표면파종법의 경우 지지체 표면에 부착된 세포들이 지지체의 중심부 및 하부보다는 상부에 더 많이 부착하는 것으로 나타났는데, 이는 부유파종법에서와 마찬가지로 지지체 표면에 세포가 부착할 때 확산 및 중력에 의존하기 때문이라고 사료된다[7, 33].

조직공학 분야에서 세포 지지체로 많이 사용되고 있는 PCL, PLA, PGA 및 PLGA 등과 같은 합성고분자는 우수한 생분해성 및 생체적합성을 가지는 장점이 있지만 폴리머 표면의 소수성으로 인해 세포 부착 효율이 낮은 단점이 있으므로 폴리머 지지체에 대한 세포의 부착능을 증가시키기 위하여 친수성 성질을 나타내는 물질을 이용한 표면 개질을 통해 이러한 한계점을 극복하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 홍합의 접착단백질에서 접착력을 나타내는 중요한 화학적 작용기인 카테콜(catechol)과 아민(amine)을 모두 가지고 있는 단분자인 도파민을 중합시켜 만든 폴리도파민을 이용한 표면개질 기술은 표면의 특성에 관계없이 대부분의 생체 재료의 표면에 친수성을 부여할 수 있기 때문에 소수성 폴리머 지지체의 표면에 대한 세포의 접착력을 높이기 위해 조직공학 분야에서 널리 응용될 수 있는 큰 잠재력을 갖는 물질이다[21, 23]. 폴리도파민의 고유한 특성 중 하나는 약한 완충액에서 도파민의 산화를 일으키는 자체 중합 능력을 가지는 것이므로 도파민을 이용해 비교적 쉬운 방법으로 폴리도파민을 얻을 수 있는 장점이 있다[37]. 또한 폴리도파민은 소수성 및 친수성 표면 모두에 쉽게 축적될 수 있을 뿐만 아니라 다른 부착단백질(adhesive protein)을 고정시키거나 생체 활성을 갖는 기능기(functional group)와의 상호작용을 증가시킬 수 있으므로 우수한 세포 부착 및 증식 효과를 나타낼 수 있다[16, 36, 37].

본 연구에서도 폴리도파민으로 표면개질된 PCL 및 PCL/PLGA 지지체에서 배양된 흉선상피세포는 표면개질 하지 않은 대조군과 PLL 및 콜라겐으로 표면개질한 실험군과 비교하여 세포의 접착, 생존 및 증식이 증가한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 폴리도파민을 이용한 표면개질은 PCL 및 PCL/PLGA와 같이 생체활성물질이 부족하고 소수성 성질로 인해 세포 부착 및 성장에 어려움이 있어 세포적합성이 낮은 소재의 단점을 극복하는데 유용한 방법이 될 수 있음을 시사한다. 또한 폴리도파민으로 표면개질된 PCL/PLGA 지지체에서 3차원적 배양된 흉선상피세포에서 흉선세포형성촉진인자인 GM-CSF 및 ICAM-1 유전자의 발현은 2차원 배양된 대조군에 비해 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 흉선상피세포의 활성을 증가시킬 수 있는 효율적인 생체모사 3차원 흉선상피세포 배양 기술 개발에 기여할 수 있을 것이다.

결론적으로, 본 연구에서 폴리도파민으로 코팅된 PCL 및 PCL/PLGA 지지체를 이용하여 흉선상피세포를 효과적으로 3차원 배양할 수 있음을 입증하였다. 이러한 결과는 향후 인공면역조직의 개발뿐만 아니라 뼈, 연골 그리고 간 등 다양한 조직을 조직공학적으로 제작하는데 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

감사의 글

이 과제는 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연구되었음.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.