서론
여드름은 얼굴, 목, 가슴 등과 같은 부위에서 발생하는 모피 지성 질환(pilosebaceous disease)으로 구진(papules), 농포(pustules), 낭종(cysts), 결절(nodules)과 같은 다양한 병변이 발생한다(Won et al., 2011). 여드름의 병인으로는 유전적인 원인, 피로와 스트레스, 호르몬 불균형, 과도한 피지 분비, 피지선의 비정상적인 각질화, 피부상재균의 증식 등 다양한 요인들의 복합적인 요인에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다(Ko et al., 2018). 피부상재균 중에서 여드름 유발 원인 세균으로 알려진 Cutibacterium acnes는 피부의 정상 세균총에 속하지만, 모낭 내에서 과도하게 증식하면 피지의 triglycerides를 가수분해할 뿐만 아니라 모낭 세포를 파괴하여 최종적으로 진피의 염증 반응을 유도함으로써 여드름의 원인 인자로 작용한다(Ko et al., 2018). 현재 여드름 치료에 사용되는 방법은 스테로이드 또는 항생제 및 비타민 A 유도체가 사용되고 있다(Kim et al., 2006). 주로 benzyl peroxide, clindamycin doxycycline, erythromycin 및 tetracycline과 같은 항생제가 많이 사용되고 있으나, 피부 건조증, 피부 자극성, 접촉성 피부염, 항생제에 대한 내성 발생 등과 같은 부작용이 보고되고 있다(Won et al., 2011). 따라서, 항생제의 남용을 막고 사용량을 최소화하기 위하여 대체 항생제 역할을 할 수 있는 천연물 유래 물질 탐색에 대한 연구가 필요한 실정이다(Lee et al., 2021). 해조류는 다불포화 지방산, 미네랄 및 비타민의 공급원일 뿐만 아니라 phenol/tannin류, terpen류, 할로겐류, alginate, fucoidan 등의 다당류 기능성 물질을 함유하여 항산화성, 항균성, 항암성, 항당뇨 및 항고혈압성 등과 같은 여러가지 기능성들이 밝혀짐으로써 새로운 신소재 자원으로 주목받고 있다(Athukorala and Jeon, 2005; Heo and Jeon, 2005; Cha et al., 2006; Kim et al., 2006). 해조류 중 감태(Ecklonia cava)는 갈조 식물 다시마목(Laminariales) 미역과의 식물로서 우리나라 동해안과 제주도 근해에 널리 자생하고 있다(Cho and Choi, 2010). 현재까지 보고된 감태에 대한 연구로는 lipase저해활성(Jung et al., 2011), tyrosinase 저해활성(Yoon et al., 2009), 항산화(Athukorala et al., 2006), 항염증(Jung et al., 2009), 항암(Kong et al., 2009), 항고혈압 및 항당뇨(Lee et al., 2009) 등의 생리활성이 보고되었지만 여드름균에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다. 또한, 최근에는 methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes 등의 주요 감염균에 대해 천연물과 항생제 조합에 의한 synergistic antibacterial effect에 대한 보고가 있으나 C. acnes의 경우 이에 대한 연구보고가 많지 않다(Eom et al., 2015).
따라서. 본 연구에서는 여드름 원인균인 C. acnes의 감태 분획물에 대한 항균활성을 확인하였고, 항생제에 대한 내성을 가지고 있는 분리 균주들에 대한 감태 분획물의 첨가에 의한 항생제의 항균력 회복에 대한 연구를 실시하였다.
재료 및 방법
시약
본 연구에 사용된 추출시약으로 methanol (MeOH)은 DAEJUNG Chemical & Metals Co., Ltd (Siheung, Korea)의제품을 사용하였으며, n-hexane (hexane), dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)은 SK Chemicals Co., Ltd. (Gunpo, Korea)에서 구입하였다. Chloramphenicol, ciprofloxacin, nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G, tetracycline와 Sephadex LH-20는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한, thin layer chromatography는 silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.
사용균주
한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM; Seoul, Korea)에서 분양받은 표준균주 C. acnes KCCM 41747와 경상대학교병원 병원체자원은행(GNUH-NCCP; Jinju, Korea)에서 분양 받은 2종의 임상 분리균주(C. acnes isolate P02875, P04697)를 본 연구에서 사용하였다. C. acnes 균주 배양을 위해 GAM (Gifu Anaerobic Medium) 배지(KisanBio, Seoul, Korea)를 이용하였고, CO2 incubator (WS-180CA; World Scicence, Bucheon, Korea)에서 37°C 혐기조건으로 24시간동안 배양하였다. 최적의 성장 조건에서 세균 세포의 생장 곡선을 결정하기 위해 C. acnes의 배양액을 GAM agar에 배양하여 colony forming unit (CFU)의 수를 결정하였다(data not shown).
감태 추출물의 용매분획
본 실험에 사용된 건조분말 상태의 감태(E. cava)는 장명식품(Seoul, Korea)에서 구매하였다. 건조분말 감태 100 g당 1 L의 MeOH (DAEJUNG Chemical & Metals Co., Ltd)을 가한 후 heating mantle (MS-DM608; MISUNG Scientific Co., Ltd, Seoul, Korea)로 65°C에서 3시간씩 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 추출액을 모아 40°C에서 감압회전농축기(R-210; Buchi, Flawil, Switzerland)를 이용하여 농축하였다. 농축된 메탄올 추출물에 물 1 L를 넣고 분획깔때기를 이용하여 hexane (SK Chemicals Co., Ltd.; 1.0 L×3), DCM (SK Chemicals Co., Ltd.; 1.0 L×3), EtOAc (SK Chemicals Co., Ltd.; 1.0 L×3), 그리고 BuOH (SK Chemicals Co., Ltd.; 1.0 L×3) 용액순으로 용매분획을 실시하였다(Fig. 1). 각각의 용매분획물은 45°C에서 진공회전농축기(Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축시켰다.
Fig. 1. Isolation and purification procedure of antimicrobial substances from Ecklonia cava. MeOH, Methanol; Hex, n-hexane; DCM, Dichloromethane; EtOAc, Ethyl acetate; BuOH, n-butanol; H2O, Water.
Ethyl acetate 분획으로부터 항균성 물질의 분리
가장 항균활성이 높은 감태의 ethyl acetate fraction을 sephadex LH-20 open column chromatography (10×120 cm)를 이용하여 chromatography를 실시하였고, silica gel 60 F254 (Merck)를 사용하여 7개의 소분획(sub-fraction)으로 확보하였다. 7개의 fraction을 상기 1종의 표준균주(C. acnes KCCM 41747)와 2종의 시험균주(isolated C. acnes P02875, P04697)로 항균 활성을 확인하였다.
총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 일부 수정하여 측정하였다(Lee et al., 2011). 희석된 추출물 시료 0.1 mL에 0.5 N Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich)를 0.5 mL을 가하여 혼합한 후 3분간 실온에 반응시켰다. 다음 20% sodium carbonate solution 0.4 mL을 가하여 혼합한 후, 실온에1시간 방치한 다음 원심 분리를 실시하였다(1600 g, 8 min). 상층액을 취하여 Versamax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 phloroglucinol (Sigma-Aldrich)의 표준검량곡선을 작성하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 검량선의 선형방정식을 사용하여 계산되었으며, mg phloroglucinol equivalent (PGE)/g으로 표시하였다.
최소 억제 농도(minimum inhibition concentration, MIC) 결정
여드름균에 대한 해조류 추출물에 대한 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC) 측정은 clinical laboratory standard institutes (CLSI, 2011; formerly national committee for clinical laboratory standards)의 액체 배지 희석법에 따라 실시하였다. 시료는 각각의 시료는 Mueller-Hinton broth (Difco, Detroit, MI, USA)로 희석하였고, 시험균의 농도는 1×104 CFU/mL의 농도로 현탁하여 측정하였으며, Mueller-Hinton broth (Difco)를 이용하여 연속적으로 2배 희석 (broth microdilution method)하여 농도의 범위를 정하였다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 뒤, 균의 성장을 관찰할 수 없는 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
항균 시너지 효과(antibacterial synergy effect) 측정
C. acnes에 대한 sub-fractions (Fr.1–Fr.7)과 항생제 간의 항균 시너지 효과는 fractional inhibitory concentration (FIC) assay (Hsieh et al., 1993)를 이용한 checkerboard 방법(Norden et al., 1979)으로 다음 방정식에 따라 계산하였다.
FIC index=FICA+FICB=(CA/MICA)+(CB/MICB)
MICA와 MICB는 각각 A (항생제)와 B (EtOAc sub-fr.)의 단독 MIC 값이며, CA와 CB는 A와 B를 병용하였을 때, 대상 균주에 대해 가지게 되는 A와 B의 생육저해농도를 의미한다. MICA와 MICB를 합산하여 시너지 효과의 범위를 나타낼 수 있는 FIC index를 결정하였다. 이때 FIC index <0.5는 synergistic, >0.5 to ≤1.0은 addictive synergy, >1.0 to ≤4는 indifferent 그리고 >4.0은 antagonistic으로 평가한다(Lee et al., 2008).
통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며 그 결과를 SPSS 프로그램(Statistics Package for the Social Science, Ver. 12.0 for Window; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)으로 분석하였다. 시료간 유의성 검정은 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였으며 P<0.05에서 Duncan's multiple range test를 실시하여 각 군의 유의차 검정을 실시하였다.
결과 및 고찰
감태 MeOH 추출물 용매 분획물의 총 폴리페놀 함량
육상식물의 페놀성 물질은 gallic acid 또는 ellagic acid로부터 유래하지만, 해양 해조류의 페놀성 물질은 phenolic acid과 같은 단순한 분자부터 phlorotannins 등 매우 복잡한 구조와 분자량을 가지는 화합물까지 다양하다(Gupta and Abu-Ghannam, 2011; Li et al., 2011). 페놀 화합물은 특정 구조인 phenolic hydroxy기를 가지고 있기 때문에 식품의 품질변화와 생체노화의 근원이 되는 산화반응은 이들 물질과 반응 시 산화반응이 지연되면서 항산화 및 항균성을 가지게 되는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2005). 감태 추출물 및 각 용매 분획의 생리활성물질을 확인하기 위해 총 폴리페놀 함량을 Folin-Denis법으로 측정하였다(Table 1). 총 폴리페놀 함량은 감태 MeOH 추출물이 111.54 mg PGE/g이었으며, 용매 분획별로는 EtOAc 분획이 698.95 mg PGE/g으로 가장 높게 나타났으며 DCM (322.61 mg PGE/g), BuOH (216.45 mg PGE/g), Hex (79.59 mg PGE/g), H2O (8.45 mg PGE/g) 분획 순으로 나타났다. 이러한 결과는 감태의 분획 중 EtOAc 분획이 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 가진다는 기존의 연구 결과들과 일치하는 것으로 확인되었다(Lee et al., 2014). 따라서, EtOAc 분획에서 가장 높은 폴리페놀 함량을 보이는 것을 확인하였으며, 용매의 극성차에 의해 분획된 분획물 중 EtOAc에 용해되는 페놀성 화합물이 함유되었기 때문으로 판단된다
Table 1. Total polyphenolic (TP) contents in Ecklonia cava methanolic extract and its solvent-soluble fractions
1PGE, Phloroglucinol equivalents; 2MeOH, Methanol; Hex, n-hexane; DCM, Dichloromethane; EtOAc, Ethyl acetate; BuOH, n-butanol; H2O, Water.
감태 MeOH 추출물의 용매 분획물의 C. acnes에 대한 항균활성
감태 MeOH 추출물과 용매 분획물의 여드름균에 대한 최소 저해농도를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 표준 균주 C. acnes KCCM 41747와 임상 분리 2종(isolated C. acnes P02875, P04697)에 대하여 항균활성을 측정한 결과, EtOAc 분획이 32–128 μg/mL의 농도에서 생육을 억제시켜 가장 강한 항균력을 보였으며, DCM 및 BuOH (64–256 μg/mL), Hex (128–512 μg/mL), H2O (>1,024 μg/mL) 분획 순으로 높은 항균력을 나타냈다. 본 연구에서 감태 MeOH 추출물로부터 용매의 극성차에 의해 Hex, DCM, EtOAc, BuOH, 및 H2O 분획물을 얻어 항균활성을 측정한 결과, 페놀성 화합물이 용해되는 EtOAc 분획이 가장 높은 항균 활성을 보이는 것을 확인하였다. 이는 가장 높은 토탈페놀 함량을 가진 EtOAc 분획이 가장 높은 항균활성으로 가지는 기존 연구 결과에 부합하는 것으로 확인되었다(Lee et al., 2014).
Table 2. Antimicrobial activity of solvent fractions from Ecklonia cava against Cutibacterium acnes and isolated C. acnes
1MIC, Minimum inhibitory concentration; 2MeOH, Methanol; Hex, n-hexane; DCM, Eichloromethane; EtOAc, Ethyl acetate; BuOH, n-butanol; H2O, Water.
감태 EtOAc 용매분획 추출물 sub-fraction의 C. acnes 항균활성
감태 용매 분획물 중 가장 높은 항균력을 나타낸 EtOAc 분획물을 sub-fr. 1–7로 구분하여 여드름 균에 대한 최소저해농도를 측정하였다(Table 3). 표준 균주 C. acnes KCCM 41747에 대하여 항균활성을 측정한 결과, sub- fr. 07이 32 μg/mL으로 가장 높은 항균력을 보였으며, 임상 분리 균주 2종(isolated C. acnes P02875, P04697)에 대하여 sub-fr. 7이 각각 128 μg/mL, 64 μg/mL의 농도에서 가장 강한 항균력을 보였다. 따라서 감태 EtOAc 용매 분획 추출물 sub-fr. 1–7 중에서 가장 높은 항균력을 가진 sub-fr. 07과 C. acnes에 대한 내성을 갖는 항생제와의 시너지 효과를 비교 분석하였다.
Table 3. Antibacterial activities of ethyl acetate sub-fractions from Ecklonia cava methanol extracts
1MIC, Minimum inhibitory concentration.
C. acnes 분리균주의 항생제 내성
Chloramphenicol, ciprofloxacin, nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G, tetracyclin은 주로 피부 병원균 및 여드름 치료에 사용된다(Ravenscroft, 2005; Han et al., 2010). 하지만, 상용적으로 사용되고 있는 항생제에 대해 피부 병원균이 항생제 내성을 나타내고 있는 것으로 보고되고 있다(Pfaller et al., 2006; Lee et al., 2014). 이에 본 연구에서는 표준 균주 C. acnes KCCM 41747와 임상 분리 균주 2종(isolated C. acnes P02875, P04697)에 대한 6종의 항생제 감수성을 확인하고자 하였다(Table 4). 항생제 내성 profile은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011)와 Sowmiya et al. (2011)를 비교하여 MIC breakpoint를 비교분석하였다. C. acnes에 대한 항생제의 MIC breakpoints는 chloramphenicol (≥32 μg/mL), ciprofloxacin (≥8 μg/mL), nalidixic acid (≥2 μg/mL), oxacillin sodium (≥1 μg/mL), penicillin G (≥2 μg/mL), 그리고 tetracycline (≥16 μg/mL)로 확인되었다(CLSI, 2011; Sowmiya et al., 2011; Blaskovich et al., 2019). C. acnes와 isolated C. acnes P02875, P04697에 대한 항생제의 MIC를 측정한 결과, chloramphenicol (2–4 μg/mL), ciprofloxacin (<0.25 μg/mL), tetracycline (4–8 μg/mL) 로 각 항생제의 MIC breakpoint를 충족시킴으로써 항생제에 대한 내성을 가지고 있지 않는 것으로 판단되었다. 하지만, C. acnes와 isolated C. acnes P02875, P04697에 대한 nalidixic acid의 MIC break point는 8–16 μg/mL, oxacillin sodium은 4–8 μg/mL, penicillin G은 4 μg/mL으로 항생제 저항성을 나타냈다. 항생제 내성 병원균을 제어하기 위해 천연 항균제를 병용하여 기존 항생제의 항균활성을 회복시키기 위해, 감태 EtOAc 용매분획 추출물 sub-fr. 07과 C. acnes에 대한 내성을 갖는 항생제(nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G)와의 병용에 의한 항균 활성의 시너지 효과에 대한 연구를 진행하였다(Eom et al., 2013, 2016; Kim et al., 2015).
Table 4. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of chloramphenicol, ciprofloxacin, nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G, and tetracycline against Cutibacterium acnes and isolated C. acnes
감태 EtOAc 용매분획 추출물sub-fr. 07 과 항생제와의 시너지 효과
가장 항균 활성이 높았던 감태 EtOAc 용매 분획 sub-fr. 07과 C. acnes에 내성을 나타낸 항생제(nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G)와의 병용처리에 의한 시너지 항균효과를 FIC assay로 분석하였다. Table 5에서 나타낸 것처럼 표준 균주 C. acnes KCCM 41747는 3종의 항생제(nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G)에 대한 내성을 나타내고 있다. 하지만, 감태 EtOAc 용매분획 sub-fr. 07 (32 μg/mL, 64 μg/mL)을 병용 사용하였을 때, 표준균주 C. acnes KCCM 41747에 대한 nalidixic acid의 값은 8 μg/mL에서 1 μg/mL, 0.25 μg/mL로 각각 8배, 32배 낮은 농도에서 균의 증식을 억제할 수 있었다. Oxacillin sodium경우, 감태 EtOAc 용매분획 sub-fr. 07 (32 μg/mL, 64 μg/mL)을 병용처리에 의해 MIC값이 8 μg/mL에서 1 μg/mL, 0.5 μg/mL로 8배, 16배 낮은 농도에서 균의 증식을 억제하였다. Penicillin G의 MIC값은 4 μg/mL에서 1 μg/mL, 0.5 μg/mL로 4배, 8배 낮은 농도에서 균의 증식을 억제할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 감태 EtOAc 용매분획 sub-fr. 07 (32 μg/mL)과 nalidixic acid, oxacillin sodium 그리고 penicillin G의 FIC index를 계산한 결과, 모두 >1.0값을 나타내었기 때문에 C. acnes균에 대해 indifference가 나타나는 것으로 확인되었다. 감태 EtOAc 용매분획 sub-fr. 07의 농도를 64 μg/mL로 하여 FIC assay를 실시하였을 때, 3종의 항생제(nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G) 모두 >0.5 to ≤1.0의 값을 나타내어 C. acnes균에 대해 additive synergy 효과로 확인됐다. 이러한 additive 효과는 표준균주 C. acnes KCCM 41747와 분리균주(isolated C. acnes P02875, P04697)에서 확인할 수 있었다. 이상의 결과로, 감태 추출물과 항생제 병용 사용으로 항생제 내성을 가진 여드름균이 항생제에 대한 감수성이 회복되었고, 이는 이전의 다른 연구 결과들과도 일치하는 것으로 확인되었다(Kim et al., 2015; Nshimiyumukiza et al., 2015; Eom et al., 2016).
Table 5. Minimum inhibitory concentrations (MICs) and fractional inhibitory concentration (FIC) indices of ethyl acetate sub-fraction 07 in combination with antibiotics against Cutibacterium acnes
A, Without sub-fr. 07; B to C and b to c, sub-fr. 07 at 32 and 64 μg/mL, respectively. aThe FIC index indicated synergism ≤0.5, additive > 0.5 to ≤ 1.0, indifference>1.0 to≤4, antagonism>4.0.
피부에 흔히 나타나는 여드름의 발생 원인은 명확하게 규명되지 않았으나, 대표적인 피부상재균인 C. acnes가 여드름 유발과 밀접한 관련을 가진다고 알려져 있다. 최근 항생제의 대한 내성 발생과 부작용으로 인해 효과적이고 안전한 대체 항생제 역할을 할 수 있는 천연물 유래 물질에 대한 선호도가 증가하고 있다. 이에 식용해조류인 감태 추출물을 대상으로 여드름균에 대한 항균 효과를 실시하였다. 감태 추출물의 용매 분획물 중에서 감태 EtOAc 용매분획 추출물 sub-fr. 07이 C. acnes 및 분리균주에 대한 MIC 값이 32–64 μg/mL로 가장 뛰어난 항균활성을 나타내었다. 또한, C. acnes가 내성을 나타내는 항생제 nalidixic acid, oxacillin sodium, penicillin G와 감태 EtOAc 용매분획 추출물 sub-fr. 07과의 병용처리에 의한 항균 시너지 효과를 조사하였다. Nalidixic acid경우, MIC값이 8–32배 감소되었고 oxacillin sodium은 8–16배, penicillin G은 4–8배 낮은 농도에서 균을 억제할 수 있었다. 감태 EtOAc 용매분획 추출물 sub-fr. 07과 이들 항생제와의 병용처리시 FIC값이 >0.5 to ≤1.0의 값을 나타내어 C. acnes균에 대해 additive synergy 효과를 나타내었다. 따라서, 본 연구를 통해 여드름과 관련된 질병의 대체 치료제로써 감태 추출물의 가능성을 확인할 수 있었다.
사사
본 연구는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구(No. 2018R1C1B504380613)이며, 국립해양생물자원관 연구사업 (2022M00500)의 지원을 받아 수행되었습니다. 이에 감사드립니다.
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