Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

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Evaluation of Comprehensive Effects of Methanol Extracts of Coptidis rhizoma against Several Oral Pathogenic Bacteria

황련 메탄올 추출물의 주요 구강 병원성 세균에 대한 포괄적 활성 평가

  • Received : 2023.01.10
  • Accepted : 2023.03.15
  • Published : 2023.03.31
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Abstract

This research was conducted to investigate the comprehensive effects of methanol extract of Coptidis rhizoma (MECR) against oral pathogen. We studied the antibacterial, anti-biofilm, anti-gingipain and anti-inflammatory activity of MECR. The minimum bactericidal concentration (MBC) of MECR was 100 ㎍/mL against several oral pathogens. The formation of biofilm of Streptococcus mutans was reduced to 8.93~24.12% in the presence of 25 ㎍/mL of MECR. The gingipain activity of Porphyromonas gingivalis were reduced to 3.91~6.23% in case of Kgp and 5.73~7.78% in case of Rgp in the presence of 10 mg/mL of MECR. The expression of fadA mRNA, virulence factor of Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) was 3 folds decreased in the presence of 25 ㎍/mL of MECR. In case of YD-38 cells challenged with F. nucleatum, RQ values of IL-8 and IL-6 were reduced about 12 folds and 5.45 folds in the presence of 2 ㎍/mL of MECR. In case of RAW 264.7 murine cell challenged with F. nucleatum, RQ values of IL-1β and IL-6 were 2.52 folds and 2.55 folds reduced in the presences of 2 ㎍/mL of MECR. Conclusively, MECR showed potent antibacterial and anti-inflammatory effects against oral pathogenic bacteria.

Keywords

충치와 치주질환은 대표적인 구강 질병이며 Streptococcus mutans(S. mutans), Fusobacterium nucleatum(F. nucleatum), Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)등 병원성 세균에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.1,2) 충치의 원인균으로 알려진 S. mutans는 고병원성 세균은 아니지만 치아우식증을 유발하는 대표적인 균으로 탄수화물을 이용하는 대사과정에서 산을 생성하여 치아 법랑질 손상, 치아 표면 부식 및 생물막의 일종인 플라그를 생성하여 치아를 손상시킨다.3,4) 특히 균이 생성하는 생물막(biofilm)인 플라크는 항생제나 면역세포의 공격 등에 강한 저항성을 가지게 하여 제균을 어렵게 한다. 고병원성 red complex에 속하며 치주염의 원인균인 P. gingivalis는 그람음성 절대혐기성 세균이며, 잇몸 염증의 원인이 되고 그 결과 치조골 파괴를 유도하여 치아손실을 유발한다.5) P. gingivalis의 대표적인 독성인자는 세포 외막 성분인 lipopolysaccharide (LPS)와 강력한단백질 분해효소인 gingipain이다.2) Gingipain는 cystein protease로 다양한 숙주유래 단백질을 분해하여 영양분으로 사용할 뿐 아니라, 숙주의 면역계로부터 회피에도 일조한다.5) P. gingivalis의 세포벽 외막 성분인 LPS는 Toll Like Receptor(TLR) 2 및 4에 결합해 신호전달 과정을 유도하여 proinflammatory cytokine인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α등을 생성하여 염증반응을 유도한다.6,7) F. nucleatum는 orange complex에 속하는 구강 병원균으로 부착분자(FadA adhesin)를 이용하여 구강내 다른 세균과의 응집을 촉진하고 그 결과 생물막인 플라크형성에 기여한다. 한편 부착분자인 FadA는 숙주세포내로 세균의 직,간접적인 침투를 도와 IL-6, IL-8등의 proinflammatory cytokine의 생성을 유도하여 구내염, 치은염및치주염등다양한 염증반응에 관여한다.8,9) 황련은 미나리아재비과 (Ranunculaceae)에 속하는 여러해살이 초본식물로 그 근경을 약용으로 사용한다.10-12) 주요 약효성분은 isoquinoline계 alkaloid인 berberine, coptisine, palmatine 및 worenine 등이 알려져 있고13,14) 주요 효능으로는 해열, 살균효과가 있어 상처치유 속도가 빠르며 동물실험에서는 항균, 소염, 해열, 담즙분비촉진, 혈압하강작용 등이 확인되었다. 황련의 구강 병원성 세균에 대한 약리효과는 일부 연구에서 항균효과에 대한 보고는 있으나 그 이상의 다양한 효능을 연구한 결과는 없는 것으로 확인되었다.15,16) 따라서 본 연구에서는 황련 메탄올 추출물의 구강 병원성 세균에 대한 항균효과, 생물막 억제효과, 단백질 분해 효소 억제능 및 항염효과등 포괄적인 효과를 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

황련시료 − 황련시료는 경동한약재시장에서 구입하여 임동술 교수가 검증한 후 85℃, 80%-메탄올을 사용하여 3시간씩 3회 반복하여 추출 및 회전증발농축한 황련 Ex.[MeOH extracts of Coptidis rhizoma(MECR)]을 임동술 교수 연구실에서 지원받아 사용하였다(수율 21.75%). 황련의 성분인 berberine(BRBR), palmatine(PAL)은 시그마(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)에서구입하였다. 각시료는 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)를 용매로 10 mg/mL 농도의 stock solution으로 조제하여 사용하였다.

세포배양 − 충치 및 치주염의 원인 세균인 Streptococcus mutans(S. mutans) KCTC 3065, Lactobacliius casei(L. casei) KCTC 2180, Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis) KCTC 5352, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum(F. nucleatum) KCTC 2640, Prevodetella intermedia(P. intermedia) KCTC 15693으로 한국생명공학연구원(정읍, 전라북도) 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. S. mutans와 L. casei 는 각각 Brain Heart Infusion 배지(BHI, Difco, Franklin Lakes, NJ, USA), MRS 배지(De Man, Rogosa, Sharpe, BHI, Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에 37 ℃, 5% CO2가 공급되는 환경에서 배양하였으며, P. gingivalis와 P. intermedia는 BHI 배지에 5% 농도의 horse blood(Kisan Bio)를 포함한 배지에, F. nucleatum는 reinforced clostridia medium(Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에 혐기배양장치를 이용하여 배양하였다. 사람의 치주인대섬유아상피세포인 YD-38 세포주와 대식세포인 RAW264.7는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, 서울, 대한민국)에서 분양받아 사용하였다. YD-38은 RPMI1640 배지(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, USA)에, RAW264.7은 DMEM배지에 fetal bovine serum(FBS, HyCloneTM) 10%과 penicillin/streptomycin(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, USA)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대배양 하였다.

항균력 측정 − 5종의 구강병원성 세균에 대한 최소저지농도측정(minimum inhibitory concentration, MIC)은 CLSI (Clinical & Laboratory Standard Institute) guideline에 따라 액체배지희석법으로실시하였다.17) MECR, BRBR 및 PAL을 0.2~400 μg/mL로 함유한 배지에 S. mutans와 L. casei는 5×105 cell/mL 농도로 37 ℃, 24시간, 혐기균 3종은 1×108 cells/mL 농도로 37 ℃, 48시간 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 최저 농도를 MIC로 결정하였다. MIC를 확인 후 해당 농도의 배양액 각 10 μL을 시료를 함유하지 않은 배지에 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 가장 낮은 농도를 최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC)로 결정하였다. S. mutans, P. gingivalis는 ampicillin(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, USA), L. casei, P. intermedia, F. nucleatum는 moxifloxacin(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, USA)을 대조물질로 항균력을 측정하여 본 실험과정 및 결과에 대한 정도 관리를 하였고, 시료를 최고 농도로 함유한 경우 (400 μg/mL) 용매인 DMSO가 40 μL/mL 함유되어 있어 용매의 영향을 확인하기 위해 DMSO만 40 μL/mL농도로 함유한 군을 동시에 실험하였다.

S. mutans의 자가응집력 및 생물막 형성능에 대한 황련 추출물 효과 – S. mutans는 세포외 고분자 물질(extracellular polymeric substance, EPS)을 생성하여 세균의 자가응집력 (autoaggregation)과 생물막의 구조적 안정성에 기여한다. 따라서 황련의 S. mutans의 자가응집력 및 생물막 형성을 저해하는 효과를 측정하였다. 자가응집력은 Sorroche등의18)방법에 따라 다음과 같이 실시하였다. S. mutans(1×107 CFU/mL)을 MECR, BRBR, PAL을 MIC농도의 1/2 농도로 함유한 BHI(3% sucrose포함)배지 5 mL에 접종 후 37 ℃, 24시간 배양하였으며 시료를 처리하지 않은군을 대조군 (control)로 하고 시료대신 용매인 DMSO만 12.5 μL/mL 처리한 군도 동시에 실험하여 용매의 영향을 확인하고자 하였다. 배양 후, 4 ℃, 12,000×g, 10분간 원심분리 후 침전을 PBS로 2회 세척 후 BHI(3% sucrose포함) 배지에 흡광도 값이 600 nm에서 0.5±0.05(ODinitial)되도록 현탁 후 37 ℃, 10시간 배양 후 600 nm에서 상층부의 흡광도(ODtreatment)를 측정하고 다음의 식으로 계산하였다;

[autoaggregation(%)=(1-ODtreatment/ODinitial)×100]. 생물막 생성능은 salts solution을 이용하는 방법을 변형하여 다음과 같이 실시하였다.19) S. mutans를 BHI(3% sucrose포함) 액체 배지에 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양 후, S. mutans의 흡광도를 측정 후 균수를 조정하여 10 μL(3×107 cell)를 96 well plate에 MECR, BRBR 및 PAL을 6.25~50 mg/mL 농도로 각각 함유한 BHI배지(3% sucrose 포함) 190 μL에 접종하고 5% CO2, 37 ℃에서 24 h 배양하였다. 상등액을 제거한 뒤, 10% formaldehyde(Sigma Co. St. Louis, USA) 200 μL를 각 well에 처리하고, 30분 후 제거하였다. 3차 증류수로 3회 세척 후 0.5% crystal violet(Sigma Co. St. Louis, USA) 200 μL을 각 well에 처리 후 30분간 biofilm을 염색하였다. 3차 증류수로 3회 세척 후 isopropyl alcohol 200μL을 각 well에 처리 후 1시간 반응하여 crystal violet이 용출되도록 한 후 용출된 crystal violet을 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 배지만 있는 well을 blank로, 시료없이 S.mutans 균만 배양한 대조군(control) well의 흡광도 값을 생물막 생성능 100%로 환산하여 비교 계산하였으며 시료대신 DMSO만 25 μL/mL 처리한 군도 동시에 실험하여 용매의 영향을 확인하였다.

Gingipain 효소활성 억제능 − Gingipain 효소 활성은 King등의20) 방법을 응용하여 형광펩타이드 기질이 gingipain에 의해 분해되어 증가하는 형광의 양을 형광분광광도계로 측정하였다. P. gingivalis 세포에 결합된 gingipain(cell associated gingipain, CAG)과 세포외로 분비된 gingipain (cell free gingipain, CFG) 효소액을 다음과 같이 준비하였다. P. gingivalis를 48시간 배양 후 12,000 rpm, 4 ℃, 15분간 원심분리 후 상등액과 침전을 분리하였다. 상등액을 0.2 μm filter로 여과 후 0.2 mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)를 첨가 후 소분하여 -70 ℃ 보관하고 CFG로 사용하였다. 침전으로 얻은 균체는 4×109/mL로 희석 후 0.2 mM PMSF를 첨가 후 소분하여 -70 ℃ 보관하고 CAG로 사용하였다. 형광기질인 Boc-VLK-AMC(Bachem Americas Inc., USA)와 Boc-VPR-AMC(Peptide Institute. Inc., Japen)는 각각 20 mM이 되도록 DMSO에 조제 후 50μL씩 소분해 -70℃에서 보관하였다. 반응중지용 시약인 TLCK(Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)는 DMSO에 10 mM이 되도록 조제후 -20 ℃에서 보관 후 사용시 PBS에 희석해서 사용하였다. CAG및 CFG 효소원액을 1 mM cystein이 첨가된 PBS에 10배 희석한 효소액 20 μL와 MECR, BRBR, PAL을 최종농도 5 μg/mL 및 10 μg/mL 되도록 각각 black 96 well plate에 취한 후 37 ℃에서 10분간 전배양 하였다. 전배양후 각각의 형광기질을 0.2 mM이 되도록 넣고 최종 부피가 100 μL 되도록 하여 37 ℃에서 15분간 반응 후 1.5 mM TLCK 50 μL를 첨가하여 반응을 종료하였다. 형광분광측정기(Tecan™, Tecan Trading AG, SWISS)를 사용하여 excitation 365 nm, emission 460 nm조건에서 형광을 측정하였다. Gingipain 저해제인 leupeptin(SigmaAldrich Co., St. Louis, USA)을 10 μM 농도로 처리한 군의 억제능력을 양성대조군으로 하였으며 gingipain에 시료대신 PBS를 처리한 군의 흡광도값을 100% 효소 활성의 대조군 (control)로 하여 시료 처리한 군의 흡광도 값을 상대비교하여 효소활성을 환산하였다. 시료대신 용매인 DMSO만을 10 μL/mL 처리한 군을 같이 진행하여 용매의 영향을 보고자 하였다.

F. nucleatum의 부착유전자 fadA발현 억제 −F. nucleatum의 부착 및 숙주내 침투에 관여하는 부착분자 FadA유전자 발현에 대한 효과를 확인하기 위해 F. nucleatum을 Clostridial broth에 37 ℃에서 48시간 배양 후, 전배양한 균액을 균수가 3×109/mL이 되도록 새 배지로 옮긴 후, MECR, BRBR 및 PAL을 MIC의 1/2 농도로 처리하고 8시간 동안 37 ℃에서 배양 후, 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 대조군 (control)으로는 시료를 처리하지 않고 배양한 균을 사용하였으며 시료 조제에 사용한 용매의 영향을 보기 위해 DMSO만 12.5 μL/mL 함유하도록 처리한 군을 동시에 진행하였다. PBS로 균체를 세척 후 total RNA 분리는 GeneAll Hybrid-RTMregent(GeneAll, Korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 실시하였다. 분리한 RNA 0.1 μg을 template로 하여 AccuPower CycleScript RT premix(dN12)(Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성 후 quantitative real time PCR (qRT-PCR)을 실시하여 fadA mRAN발현을 비교하였다. 본 실험에서 사용한 primer는 Table I에 나타내었으며, 각각의 primer는 제노텍(Genotech, Daejeon, Korea)에서 합성하여 사용하였다. qRT-PCR반응은 cDNA 3 μL, 각 primer 10 pmol 1 μL, PowerSYBR Green PCR Mastermix(Life Technologies Pty Ltd, NY, USA) 10 μL를 넣고 nuclease free water를 넣어 최종 부피가 20 μL가 되도록 하였다. 이후 StepOne realtime PCR System (Life Technologies Pty Ltd, NT, USA)을 사용하여 다음과 같은 조건에서 반응하였다. 95 ℃에서 10분간 변성 후, 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 60초간 합성을 40회 반복 수행 후, 95 ℃에서 초당 온도를 0.3 ℃씩 낮추며 생성된 PCR 산물의 melting curve 분석을 실시하였다. 결과 분석은 house keeping gene인 16S rRNA를 기준으로 fadA를 각각 상대정량분석하는 ddCt 분석을 실시하여 분석하였으며, 1.5배 이상의 차이를 유의적으로 판단하였다.

Table I. Primer sequences for the PCR analysis

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세포독성 측정 − MECR의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma Co. St. Louis, USA) assay를 실시하였다. 6 well plate에 YD-38 cell과 RAW 264.7을 5×105 cells/well 분주하고, 24시간 배양 후 MECR 0.125 ~ 32 μg/mL 농도로 배양액에 첨가하여 24시간 배양하였다. MECR 조제에 사용한 DMSO만을 2.5 μL/mL ~ 20 μL/mL를 처리한 세포도 함께 진행하여 용매 자체에 의한 세포독성도 확인하였다. 배양액을제거하고 MTT 시약 1 mL(0.5 mg/mL)를첨가하여 4시간동안반응후상등액을제거하고 1 mL의 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Co. St. Louis, USA)를 첨가하여 5분 동안 추가 반응 후 spectrophotometer(Molecular Devices, VERSA max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 대조군과 비교하여 90% 이상의 생존율을 보이는 농도를 독성이 없는 농도로 간주하여 세포실험에 사용할 MECR의 농도로 결정하였다.

Proinflammatory cytokine 유전자 발현억제능 − YD-38 cell과 RAW 264.7을 6 well에 5×105 cells/well로 분주하여 24시간 배양 후 MTT결과 세포독성이 없는 것이 확인된 MECR 1 μg/mL 및 2 μg/mL 농도로 처리하고 30분 후 YD-38세포는 세포수 대비 100배(MOI 100), RAW 264.7세포는 세포수 대비 25배(MOI 25)의 F. nucleatum을 처리하여 염증반응을 유도하였다. 상기 MTT 결과 용매인 DMSO의 독성은 없는 것으로 확인되어 이때 대조군으로는 시료대신 용매인 DMSO만을 2 μL/mL처리하여 실시하였다. 6시간 배양후 Triazol법을 응용한 Hybrid-R™ (GeneAll, Seoul, Korea) kit을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 0.1 μg을 template로 하여 AccuPower CycleScript RT premix (dT20) (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNF-α를 표적으로 Quantitative realtime PCR(qRT-PCR)을 실시하였다. 본 실험에 사용한 PCR primer는 Table I에 나타내었으며, 각각의 primer는 제노텍 (Genotech, Daejeon, Korea)에서 합성하여 사용하였다. qRT-PCR 반응은 cDNA 3 μL, 각 primer 10 pmole 및 PowerSYBR Green PCR Mastermix(Life Technologies Pty Ltd, NY, USA) 10 μL를 넣고 nuclease free water 넣어 최종 부피가 20 μL가 되도록 하였다. StepOne realtime PCR System (Life Technologies Pty Ltd, NY, USA)을 사용하여 다음과 같은 조건에서 반응하였다. 95 ℃에서 10분간 변성 후, 95 ℃에서 15초 다시 변성, 60 ℃에서 60초간 합성을 40회 반복 수행 후 95 ℃에서 초당 온도를 0.3 ℃씩 낮추며 생성된 PCR 산물의 melting curve 분석을 실시하였다. YD-38은 β-actin을 기준으로, Raw 264.7은 GAPDH를 기준으로 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNF-α를 상대정량분석을 하는 ddCt 분석을 실시하여 분석하였으며, 1.5배 이상의 차이를 유의적인 것으로 판단하였다.

통계분석 − 모든 실험은 3회 반복으로 실시하였고 통계분석은 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, Student’s t-test법을 이용하여 p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결과 및 고찰

항균력 측정 − 5종의 구강병원성 세균에 대한 황련성분인 MECR, BRBR, PAL의 항균력은 MIC는 25~50 μg/mL였고 MBC는 3가지 시료 모두 100 μg/mL로 확인되어 Park16)의 결과에서 250 μg/mL을 황련추출물의 MBC값으로 보고한 것과 비교할 때 한단계 정도 낮은 농도에서 항균력이 확인되었다. 또한 단일성분인 BRBR, PAL의 항균력이 황련추출물인 MECR과 비교해 우수하지 않은 것은 항균력의 주 성분이 BRBR, PAL이외에 다른 유효 성분이 있는 것으로 사료된다(Table II). 용매인 DMSO만 40 μL/mL처리한 대조군은 배지만 사용한 경우와 동일한 흡광도를 나타내 정상적인 성장이 확인되어 항균력에 대한 용매의 영향은 배제할 수 있었다.

Table II. Antibacterial activity of MECR, BRBR and PAL against oral pathogenic bacteria

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MECR; methanol extract of C. rhizoma, BRBR; berberine, PAL; palmatine

S. mutans의 자가응집력 및 생물막 형성 억제효과 − 자가응집력과 생물막은 S. mutans의 대표적인 병인인자로 S. mutans은 EPS를 생성하여균체가 자가응집하게 되고그 결과 돔모양의 생물막을 형성하고 S. mutans를 포함한 다양한 구강세균들이 생물막의 보호아래 증식하며 치아의 법랑질과 잇몸을 손상시킨다.3,4) 자가응집력은 S. mutans균의 부착에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 구강내 다양한 세균과의 응집을 유도하여 군집을 이루어 생물막 형성을 촉진시킨다.21,22)배양초기 흡광도를 기준으로 10시간 배양 후 대조군의 응집력은 75.78±3.28%였고 MIC 1/2 농도의 MECR, BRBR 및 PAL을처리한결과응집력이각각 37.61±3.45%, 43.46±3.44%, 48.91±1.97%로 감소하여 우수한 응집억제효과가 있음을 알 수 있었다(Fig. 1). 한편 MECR, BRBR 및 PAL의 생물막 형성 억제능을 관찰한 결과 3가지 시료 모두 농도 의존적으로 생물막 생성을 억제하였다. 시료를 처리 하지 않은 대조군의 생물막을 100% 형성된 것으로 하였을 때 고농도인 50μg/mL와 25 μg/mL에서는 3가지 성분 모두 생물막이 8.93~24.12%정도만 형성되어 억제능이 75.98~91.06%로 우수한 효과를 나타내었다. 하지만 낮은 농도인 6.25 μg/mL에서 MECR을 처리시 형성된 생물막이 54.93%이었으나 BRBR은 74.46%, PAL은 97.08%의 생물막이 형성되어 저농도에서는 MECR에서만 유의미한 생물막 억제능을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 시료대신 DMSO만 12.5 μL/mL 처리한 대조군의 자가응집력과 생물막 생성은 시료를 처리하지 않은 대조군과 동일하여 자가응집력과 생물막 생성에 대한 효과에서 용매의 영향은 배제할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 특히 저농도에서의 MECR의 우수한 효과를 볼 때 단일 성분인 BRBR, PAL이외 MECR중 다른 성분이 생물막 억제에 기여할 것으로 추정된다. 황금의 성분인 baicalein이 200 μM농도에서 생물막 형성을 약 80%정도 억제한 연구 결과와 비교할 때 황련도 S. mutans의 효과적인 생물막 억제제로서 기능을 할 것으로 사료 된다.23)

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Fig. 1. Autoaggregation of S. mutans in the presence of MECR, BRBR and PAL. control; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose), MECR; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose) with 1/2 MIC of methanol extracts of C. Rhizoma, BRBR; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose) with 1/2 MIC of berberine, PAL; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose) with 1/2 MIC of palmatine. All data were performed in triplicate and expressed as mean±SD. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

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Fig. 2. The effects of MECR, BRBR and PAL on the formation of biofilm of S. mutans. control; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose), MECR; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose) with methanol extracts of Coptidis rhizoma, BRBR; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose) with berberine, PAL; S. mutans cultured in BHI (w/3% sucrose) with palmatine. All data were performed in triplicate and expressed as mean ± SD. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

Gingipain 효소활성 억제능 − Gingipain은 치주염의 원인균인 P. gingivalis가 생성하는 trypsin-like cystein protease로 lysine 잔기의 C 말단 부위를 절단하는 Kgp와 arginine 잔기의 C-말단을 절단하는 Rgp로 구분한다.5) 본 실험결과 MECR, BRBR 및 PAL 모두 gingipain 활성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다. 단일성분인 BRBR, PAL보다 MECR의 억제능이 우수했으며 Rgp와 Kgp에 대한 억제능은 MECR의 경우 큰 차이 없이 효과적으로 억제하였다. Gingipain 저해제로 알려진 양성대조물질 leupeptin을 10 mM 처리시 효소 활성이 Kgp는 36.1~24.7%, Rgp는 9.2~12.8%로 시료를 처리하지 않은 대조군의 활성 100%에 비해 현저히 감소하였다. 한편 MECR 10 μg/mL에서 Kgp는 3.91~6.23%, Rgp는 5.73~7.78%의 효소 활성을 나타내 시료를 처리하지 않은 대조군의 활성 100%에 비해 현저히 감소하였으며 전체적으로 농도의존적으로 효소 활성이 감소함을 알 수 있었다. 따라서 황련은 우수한 gingipain 억제제로의 가능성을 확인하였다(Fig. 3A&B). 시료대신 DMSO만을 10 μL/mL 함유한 군의 gingipain활성은 시료를 처리하지 않은 군과 동일하여 용매의 영향은 배제하였다. 최근 천연물 유래 polyphenol이나 flavonoids 성분 중 gingipain 효소 억제능이 우수한 성분에 대한 연구 결과들이 보고되고 있으며24) 황련도 그러한 천연물 중 하나로 기대된다. Gingipain은 단백질 분해 효소로 잇몸을 손상시켜 치아의 손실을 일으키거나, 숙주 방어시스템으로부터 회피를 가능하게 할 뿐 아니라 최근에는 알츠하이머 환자의 뇌에서 P. gingivalis와 gingipain의 확인되어 gnigipain이 신경독성과 연관이 있음을 추정하게 한다.25) 따라서 gingipain 효소 억제제는 구강 질병뿐 아니라 P. gingivalis에 의한 중추신경 독성을 예방할 수 있는 가능성도 시사하고 있다.

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Fig. 3. P. gingivalis gingipain activity in the presence of MECR, BRBR and PAL. (A), P. gingivalis Kpg enzyme activity; (B), P. gingivalis Rgp enzyme activity. Kgp; lysine specific gingipain, Rgp; arginine specific gingipain, CAG; cell associated gingipain, CFG; cell free gingipain, Control; Kgp and Rgp gingipain activity without MECR, BEBR and PAL, 10 μM leupeptin; positive control. All data were performed in triplicate and expressed as mean±SD. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

부착소 유전자 fadA의 발현 억제 − F. nulceatum의 병인 인자중균의부착과숙주세포로의침투에관여하는부착소는 치주 질환 발병 초기에 매우 중요하다.8) 따라서 황련에 의해 F. nulceatum의 부착소 유전자 발현이 억제되는지를 qRT-PCR로 확인하였다. 그 결과 시료를 처리하지 않은 대조군의 RQ값 1에 비해 MIC의 1/2농도인 25 μg/mL의 MECR을 처리한 결과 RQ값이 약 3배 감소한 0.322±0.07, BRBR을 처리한 결과 약 2배 감소한 0.45±0.10 및 PAL을 처리한 결과 약 30배 감소한 0.038±0.01로 3가지 시료 모두 유의미하게 부착분자 유전자 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며 특히 PAL의 경우 현저하게 유전자 발현을 억제하여 이러한 결과는 황련성분이 F. nucleatum에 의한 치주 질환 발병 초기를 억제하는 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다(Fig. 4). DMSO만 12.5 μL/mL 처리한 군에서의 fadA유전자 발현은 대조군과 동일하여 용매의 영향을 배제하였다.

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Fig. 4. Effect of MECR, BRBR and PAL on the expression of adhesin fadA mRNA of F. nucleatum. The concentration of each sample was 1/2 of MIC. Control means the samples prepared from cells cultured without MECR, BRBR and PAL. MECR; cells cultured with methanol extracts of Coptidis rhizoma, BRBR; cells cultured with berberine, PAL; cells cultured with palmatine. All data were performed in triplicate and expressed as mean ± SD. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

Proinflammatory cytokine 유전자발현억제능 −F. nulceatum은 사람의 구강 상피세포에서는 IL-1β, IL-8의 발현 증가, 마우스 대식세포에서는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현이 증가와 그로 인해 IL-1β는 치주조직파괴를 강력하게 유도하고, 뼈 흡수 촉진 및 조직파괴 단백질 분해효소의 생성을 유도한다.26) IL-6는 파골세포 형성 및 뼈 흡수 촉진, T 림프구 분화를 촉진함으로써 조직파괴 과정에 관여한다.27,28) 따라서 황련추출물에 의한 proinflammatory cytokine 유전자 발현에 미치는 영향을 비교하였다. YD-38세포에서 균을 감염시켜 염증반응을 유도한 결과 RQ값이 IL-1β는 7.11±0.71, IL-6는 3.49±0.46, IL-8은 8.59±0.58로 유의미하게 전염증성 싸이토카인유전자발현이증가하였다. 한편 MECR 1 mg/mL 농도로 처리했을 때 RQ값이 IL-1β는 2.14±0.29로 약 3.32배, IL-6는 1.08±0.14로 약 3.30배, IL-8은 0.89±0.05로 약 9.64배 감소하였고, MECR 2 mg/mL농도로 처리했을 때 RQ값이 IL-1β는 1.56±0.31로 약 4.55배, IL-6는 0.65±0.14로 5.45배, IL-8은 0.72±0.07로 11.93(약 12배) 감소하였다. 특히 IL-8의 유전자 발현이 약 12배 감소하여 매우 현저히 억제됨을 확인하였다(Fig. 5). 마우스 대식세포인 RAW264.7에서 균을 감염시켜 염증반응을 유도한 결과 RQ값이 IL-1β는 33.02±2.75, IL-6는 24.02±3.24, TNF-α은 2.99±0.21로 유의미하게 proinflammatory cytokine유전자 발현이 증가하였다. 한편 MECR 1 μg/mL농도로 처리했을 때 RQ값이 IL-1β는 28.96±0.1.22로 약 1.1배, IL-6는 24.02±3.23로 약 1.3배, TNF-α은 2.66±0.15로 약 1.1배 감소하여 ddCt법에 의한 상대 정량의 기준(1.5배 이상 차이가 나는 경우)으로 볼 때 유의미한 영향은 없는 것을 확인하였다. 그러나 MECR 2 mg/mL농도로 처리했을 때 RQ값이 IL-1β는 13.09±0.22로 약 2.52배, IL-6는 9.41±0.79로 2.55배, TNF-α은 1.24±0.29로 2.41배 감소하여 유의미한 감소 효과를 확인하였다(Fig. 6). F. nucleatum는 사람 상피세포에서 proinflammatory cytokine인 IL-1β, IL-6, IL-8을 유도하고 그 결과 염증반응, 파골세포 활성화등을 통해 조직파괴를 유도하며26,27) 동물의 경우에서도 IL-1β, IL-6을 유도하는 것으로 보고하고 있다.27,28) 본 연구에서도 F. nucleatum감염에 의해 동일한 proinflammatory cytokine의 발현이 유도되었으며 MECR을 처리한 결과 이러한 proinflammatory cytokine의 유전자 발현이 현저히 억제됨을 확인하였다. F. nucleatum의 병인 인자인 부착소 FadA에 대한 PAL의 우수한 효과를 제외하면 전반적인 구강 병원성 세균에 대한 효과는 메탄올 추출물인 MECR이 단일성분인 BRBR이나 PAL 비해 우수한 것을 확인하였으며 이는 혼합물 중 다른 성분에 의한 효과를 기대하게 한다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 황련은 주요 구강 병원성 세균에 대한 직접적인 항균효과외에도 구강 병원성 세균의 주요 독성인자인 부착소, gingipain을 효과적으로 억제하며 균에 의해 유도된 염증반응도 억제하는 포괄적인 약리효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.

Fig. 5. Effect of MECR (MeOH Ex of C. Rhizoma) on F. nucleatum (FN) induced expression of IL-1β, IL-6 and IL-8 mRNA in YD-38 human epithelial cells. Control means the samples prepared from cells cultured without MECR. All data were performed in triplicate and expressed as mean ± SD. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.

Fig. 6. Effect of MECR (MeOH Ex of C. Rhizoma) on F. nucleatum (FN) induced expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α mRNA in RAW264.7 murine macrophage. Control means the samples prepared from cells cultured without MECR. All data were performed in triplicate and expressed as mean±SD. *p<0.05, **p<0.01 compared with control.​​​​​​​

결론

본 연구는 전통적으로 소염, 해열등의 약리작용이 알려진 황련의 메탄올 추출물의 구강 병원성 세균에 대한 포괄적 효능을 평가하였다. 그 결과 주요 구강병원성 세균에 대한 우수한 항균력이 있음을 확인하였다. 또한 S. mutans의 병인인자인 생물막 형성 억제능, F. nucleatum의 부착소 유전자 발현 억제능 및 P. gingivalis의 병인인자인 gingipain 효소 활성 억제능이 우수함을 확인하였다. F. nucleatum에 의해 유도된 염증반응에서 황련 추출물은 염증성 싸이토카인의 유전자 발현의 유의미하게 억제하여 구강내 충치 및 치주염 치료제로서의 가능성을 시사하고 있다.

사사

본 연구는 삼육대학교의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

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