Characterization of Weissella sp. Strains Isolated from Fermented Squid and the Antibacterial Activities of Fermented Rice against Harmful Bacteria

발효된 오징어젓갈에서 분리된 Weisella sp. 균주의 특성 분석 및 쌀발효물의 유해세균에 대한 항균활성 검증

Abstract

The purposes of this study were to isolate and characterize lactic acid bacteria with antibacterial activity against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from fermented food and to confirm the antibacterial activities of fermented rice products using the isolated lactic acid bacterium. Three bacteria, namely, Weissella sp. ISF-1, ISF-2, and ISF-3, were selected from fermented squid based on the 16S rRNA gene sequence. All three strains grew well in an MRS medium containing 5% (w/v) NaCl and showed antibacterial activity against Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, and MRSA. Their growth was excellent at 0% ~ 5% (w/v) NaCl and relatively good up to 7% (w/v) NaCl. The initial pH of 8 was optimal for their growth, and good growth was also observed at pH 6, 7, and 9. The lyophilisates of the fermented rice using Weissella sp. ISF-1 showed antibacterial activities against B. cereus, S. aureus, and MRSA. We inferred that isolated lactic acid bacteria could be useful in the development of probiotics and biopreservatives for foods and in the treatment of MRSA and may increase the value of rice products.

본 연구의 목적은 전통식품에서 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 보이는 유산균을 분리하고 특성을 파악한 후에, 분리된 유산균을 이용한 쌀 발효물의 항균 활성을 확인하는 것이었다. 오징어 젓갈에서 선별된 3종의 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열을 기반으로 Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3으로 명명하였다. 이들은 장내 유해세균들인 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus 및 MRSA에 대해 우수한 항균 활성을 보였다. 이들의 생장은 0-5% (w/v) NaCl에서 우수하였고 7% (w/v) NaCl까지 비교적 양호하였다. 초기 pH 8이 생육에 최적이었으며, pH 6, 7, 9에서도 우수한 생육을 보였다. 분리 된 Weissella sp. ISF-1 균주를 이용하여 발효한 쌀발효 동결건조물들도 B. cereus, S. aureus 및 MRSA에 대해 항균 활성을 보였다. 본 연구결과로 획득한 균주들은 프로바이오틱스 및 안전한 식품 이용을 위한 생물 보존제 개발이나 MRSA 치료에 유용할 수 있고, 쌀의 부가가치를 높이는 새로운 기능의 제품개발에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

서론

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 건강한 사람의 피부와 코에서 흔히 발견되는 상재균으로 그람 양성의 구형 세균이다. 황색포도상구균(S. aureus)은 황금색 색소를 생성하고 용혈성을 가지며 coagulase를 생성하는 종으로, 농양이나 창상감염 등의 피부감염, 골관절염, 폐렴 등을 일으키는 병원성이 높은 유해세균으로 알려져 있다[8]. 황색포도상구균과 같은 상재균은 평상시에는 질병을 일으키지 않지만, 피부병과 식중독을 일으킬 수 있다[9, 14]. 황색포도상구균으로 인한 질병을 치료하기 위해 항생제를 남용한 결과, 메티실린을 포함한 전체 항생제 그룹에 내성이 있는 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)이 출현하였다[9, 14]. MRSA는 일반적인 항생제에 내성을 보이고 의료기관 내에서 환자 간의 전파가 쉬우며 치료도 어렵다[1]. MRSA의 치료제 개발에 관한 연구는 주로 새로운 항균물질 개발과 기존의 항생제와의 병용투여에 초점이 맞추어져 있지만, 아직 괄목할 만한 성과가 부족하다[10]. 따라서 MRSA에 대해 항균 활성을 갖는 항균 물질의 개발은 시급하다고 할 수 있다. 항생제 내성 균주의발생에 관한 우려가 없으며 항생제를 대신할 수 있는 천연물질을 이용한 항균 물질의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 여러 천연물질이 항생제 내성 균주에 대해 항균력을 나타낸다고 보고되었다[10].

유산균(Lactic acid bacteria)은 식품의 발효에 관여하는 중요한 세균이다. 여러 발효식품뿐만 아니라 사람이나 동물의 장이나 질 내에 정상 미생물군으로 존재하고 있다[11]. 또한, 유산균과 같은 식품 유래의 미생물들은 오랜 기간 동안에 인류가 발효 식품과 함께 섭취한 GRAS (generally regarded as safe) 미생물로서 안전성이 증명되었다[6]. 발효식품들의 발효 후의 저장성 개선 효과의 원인을 조사한 결과, 유산 발효에 의한 식품 내의 산 농도의 증가로 병원성, 부패성 미생물이 생육하기에 부적합한 환경을 만드는 효과와 함께 이들 유산균이 생산하는 항균 물질에 의한 잡균의 생육 저해 효과를 확인할 수 있었다[11].

프로바이오틱스는 일반적으로 사람이나 동물이 섭취하였을 때에 장내 균총의 균형을 조절하여 건강에 도움을 주는 살아있는 미생물로 정의하고 있다[2]. 이러한 프로바이오틱스에는 유산균을 비롯한 효모 및 기타 세균들이 있는데 유산균이 대부분을 차지하고 있다[2]. 유산균은 장내 미생물군의 안정화, 과형성 증후군, 유당불내성, 비특이성 면역 이상반응의 완화 및 비타민 생산 등의 다양한 기능을 나타낸다[15]. 유산균은 장내에서 정상 미생물군으로 존재하고 있기 때문에, 독성이 적다고 판단되며, 유산균들이 생산하는 항균 물질은 식품 등의 새로운 생물학적 보존제로 사용 가능하고, 식품이나 의약품 산업에도 응용될 수 있다[6].

한국인들은 전통적으로 소금에 절인 생선, 오징어 등을 발효시켜 식품으로 사용해왔다[16]. 유산균은 이러한 발효 해산물에서 쉽게 발견된다[5]. 따라서, 이로부터 새로운 유산균을 탐색하는 것은 프로바이오틱스 측면과 안전한 생물보존제나 MRSA 치료제 개발에도 유용할 것이다.

한편, 2020년 현재의 쌀가공식품은 떡, 밥, 죽, 면, 쌀과자, 쌀 음료, 막걸리 등의 주류가 있으며 정부에서도 2011년에 쌀 가공산업법 제정 이후에 1인당 연간 쌀 소비량의 감소 문제 해결 및 쌀 가공산업의 활성화를 위해 노력하고 있다[17]. 이에 본 연구에서는 전통 식품인 오징어젓갈에서 유산균을 분리하고 MRSA 등에 대한 항균활성을 확인하였고, 분리된 유산균을 이용하여 발효한 쌀발효물의 항균 활성을 확인하였으며, 점점 감소하고 있는 쌀 소비시장의 활성화에 기여하기 위하여 쌀가공식품에 새로운 기능성을 부여하고자 하였다.

재료 및 방법

유산균 균주들의 분리 및 동정

MRSA에 대해 항균 활성을 나타내는 유산균을 분리하기 위해 발효된 오징어젓갈 10 g을 1.0% (w/v) 펩톤이 첨가된 멸균 증류수 10 ml에 현탁시킨 후, 5% (w/v) NaCl, 0.1% (w/v) nystatin (Merck, USA) 및 0.1% (w/v) polymyxin B (Duchefa, Netherlands)를 함유하는 MRS (Difco, USA) 한천 배지를 이용하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 생장이 확인된 세균집락에서 균주를 3차례 이상 분리한 뒤에 순수배양하였고 MRSA에 대한 항균활성을 확인하였다. 최종적으로 ISF-1, ISF-2, ISF-3의 세 균주를 선별하였으며, 이들을 배양하고 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, USA)를 사용하여 총세포 DNA를 정제하였다. 정제된 총세포 DNA를 주형으로 16S rRNA 유전자를 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 primer로 이용하여 증폭하였으며, Cosmogenetech (Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석이 완료된 염기서열들은 BLAST를 사용하여 염기서열이 알려진 균주들과의 유사도를 검토하여 균주들을 동정하였다. 이후, Clustal 프로그램 (ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후에 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.

유산균 균주들의 항균 활성 측정

장내 유해세균인 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)와 장내상재균인 Escherichia coli에 대한 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들의 항균 활성을 paper disc법으로 측정하였다. 대장균과 장내 유해세균 3종을 tryptic soy (TS) 액체 배지(Difco, USA) 4 ml에 접종하여 250 rpm, 37°C에서 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. 대장균과 각 장내 유해세균 배양액을 TS 액체 배지로 100배 희석한 후, TS 한천 배지(Difco, USA)에 200 ㎕씩 도말하였다. 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들은 5% (w/v) NaCl을 함유하는 MRS 액체 배지(Difco, USA) 4 ml에 접종하여 250 rpm, 37°C에서 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. Paper disc를 장내 유해세균과 대장균을 도말한 한천 배지 위에 놓고 하룻밤 동안 배양한 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들의 배양액을 paper disc에 10 ㎕씩 첨가하였다. Ampicillin (10 mg/ml)과 kanamycin (60 μg/ml)을 양성 대조군으로 사용하였고, 5% (w/v) NaCl을 함유하는 MRS 액체 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 이를 30℃에서 하룻밤 동안 정치 배양한 후에 항균 작용에 의해 형성된 생육억제환(clear zone)을 관찰하고 직경(mm)을 측정하였다.

유산균 균주들의 생장 특성 분석

최종 선정된 유산균 균주들의 생장에 최적인 초기 pH의 수준과 NaCl의 농도를 결정하기 위하여 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들을 4 ml의 MRS 액체배지(Difco, USA)에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 각 균주들을 다양한 pH 수준 또는 NaCl의 농도를 갖는 4 ml의 MRS 액체배지(Difco, USA)에 최종농도 1% (v/v)가 되도록 접종하였다. 24시간 배양한 후에 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들의 광학밀도를 분광광도계(Model: X-ma 3000, Human Corporation, Korea)를 이용하여 600 nm에서 측정하였다.

유산균 균주 ISF-1을 이용한 쌀발효물의 제조

쌀가루 1.6 kg과 분리 대두 단백질 0.4 kg에 정제수 6.0 kg을 투입하여 50℃에서 가열하여 쌀추출액을 제조하였다. 쌀추출액에 효소혼합액(0.2% (v/v) 당 분해효소(Novozyme, Denmark), 0.05% (v/v) 섬유질 분해효소 (Novozyme, Denmark), 0.05% (v/v) 단백질 분해효소(Novozyme, Denmark), 0.1% (v/v) 전분 분해효소(Shin Nihon Chemical, Japan))을 최종농도 0.2% (v/v)가 되도록 첨가하고 50℃에서 90분 동안 처리하였다. 이후 90~95℃에서 30분 동안열처리하여 효소를 실활시켰다. 선별된 유산균 ISF-1 균주를 5% (w/v) NaCl을 함유하는 MRS 액체 배지 1 l에 접종하여 37°C에서 하룻밤 동안 진탕배양한 후, 원심분리(3,000× g, 30 min)하여 상층액을 제거하고 4℃에 보관하였다. 효소 처리와 열처리를 거친 쌀추출액에 유산균 ISF-1 균주의 배양물을 최종농도 1% (w/v)가 되도록 접종하고 30℃에서 4일간 발효하였다. 발효가 완료된 후에 121℃에서 15분 동안 멸균하고, 여과 후에 동결건조하였다.

쌀발효 동결건조물의 항균활성 측정

쌀 발효액을 동결건조한 후에 멸균수로 희석한 쌀 발효 동결건조물 용액(pH 4.0)과 섭취가 용이하도록 쌀 발효액의 pH를 6.5로 조절하고 동결건조한 pH 조절 쌀발효 동결 건조물 용액 2가지를 준비하였다. 두 동결건조물 용액의 최종농도는 25% (w/v)가 되도록 하였다. 항균활성은 “유산균 균주들의 항균 활성 측정”과 동일하게 측정하였다.

결과 및 고찰

유산균 균주들의 분리 및 동정

항균활성을 갖는 새로운 유산균을 선별하기 위해 많은 염장 또는 한국 전통 발효 식품을 사용하였다. 이 연구에서는 발효된 오징어 젓갈에서만 항균활성이 있는 유산균을 분리할 수 있었다. 진균류와 그람 음성 세균의 생육을 억제하기 위하여 0.1% (w/v) nystatin 및 0.1% (w/v) polymyxin B를 첨가한 5% (w/v) NaCl이 함유된 MRS 한천 선택배지에서 오징어젓갈 시료로부터 많은 세균 집락을 얻었다. 배양 배지에는 5% (w/v) NaCl이 포함되어 있기 때문에 오징어젓갈에서 호염성 또는 내염성 세균들이 선택적으로 배양되었을 것이다. 최종적으로 MRSA에 대한 항균 활성을 측정하여 3종의 균주들을 선별하였고, 이들을 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주로 명명하였다. 이 균주들을 순수배양하고 총세포 DNA를 정제한 후에 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭하고 약 1.5 kb 크기의 DNA 단편의 염기 서열을 분석하였다. BLAST를 이용하여 유산균 ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 세 균주 모두 97% 이상의 유사도로 Weissella cibaria와 가장 유사한 것으로 나타났다. 따라서 분리된 유산균 균주들을 Weissella sp. ISF-1, ISF-2 및 ISF-3으로 명명하였다. Weissella sp. ISF-1, ISF-2 및 ISF-3의 분류학적 위치를 알 수 있는 계통도는 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1. Neighbor-Joining phylogenetic tree based on almost complete 16S rRNA gene sequences comparing iso-lated lactic acid bacteria ISF-1, ISF-2 and ISF-3 with other bacteria. The numbers at the branch nodes are percentages of bootstrap values (n=1,000) and numbers in parenthesis are accession numbers in GenBank.

현재 Weissella 속으로 분류되는 유산균의 계통발생은 1990년에 명확해졌으며[12], Weissella 종의 분류는 1993년에 추가로 평가되었다[4]. Weissella 종은 다양한 시료들에서 분리되었으며, 그 중 일부는 발효에서 중요한 역할을 한다[3]. Weissella cibaria는 다양한 종류의 발효 식품에서 발견된다[16]. Weissella cibaria CMU 균주는 구강 관리 프로바이오틱스로 상업적으로 사용되어 왔으며[7], 따라서, 분리된 Weissella 속 균주들은 프로바이오틱스가 될 가능성이 있을 것이다.

유산균 균주들의 항균활성

식중독을 일으키는 B. cereus와 S. aureus, MRSA 및 대장균(E. coli)에 대한 Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3의 항균 활성을 확인한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. Paper disk에서 세균 생장이 없는 생육 억제환(clear zone)의 거리가 멀수록 항균활성이 높은 것으로 간주하였다. Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들은 B. cereus에 대하여 각각 2.0, 2.5, 5.0 mm의 항균 활성을 보여, Weissella sp. ISF-3이 가장 높은 항균 활성을 보였다(Fig. 2A). S. aureus에 대하여 각각 4.1, 2.9, 2.4 mm의 항균 활성을 보여, Weissella sp. ISF-1이 가장 높은 항균 활성을 보였다(Fig. 2B). 또한, 다제내성균주인 MRSA에 대하여 각각 3.2, 2.1, 1.1 mm의 항균 활성을 보여, Weissella sp. ISF-1이 가장 높은 항균 활성을 보였다(Fig. 2C). 하지만, 세 균주 모두는 그람 음성균인 대장균에 대해서는 항균 활성을 보이지 않았다(Fig. 2D). 양성대조군인 ampicillin (10 mg/ml)과 kanamycin (60 μg/ml)은 B. cereus에 대하여 각각 4.0, 5.0 mm의 항균 활성을 보였으며(Fig. 2A), S. aureus에 대하여 각각 4.1, 5.9 mm의 항균활성을 보였다(Fig. 2B). 하지만, 다제내성균인 MRSA에 대해서는 항균 활성을 나타내지 않았다(Fig. 2C). 한편, 그람 음성균인 대장균(E. coli)에 대하여 각각 4.0, 6.0 mm의 항균 활성을 보였다(Fig. 2D). 이러한 결과들은 새우젓에서 분리한 Weissella sp. S1, S2, S3 균주들의 항균 활성 양상과 유사하였다[1]. 따라서, Weissella sp, ISF-1, ISF-2 균주들은 MRSA 감염의 치료에 필요한 치료제 개발 연구에도 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Fig. 2. Antibacterial activities of Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3 against pathogenic bacteria. (A) B. cereus, (B) S. aureus (C) MRSA, (D) E. coli. (Amp.: ampicillin (10 mg/ml), Kan.: kanamycin (60 μg/ml), Med.: MRS broth medium containing 5% (w/v) NaCl).

유산균 균주들의 생장 특성

초기 pH에 따른 Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들의 생장 양상을 Fig. 3에 나타내었다. 세 균주 모두 pH 8에서 최적의 생장을 보였으며, pH 5와 pH 9 사이에서 잘 자랐지만, pH 4와 10 이상에서는 낮은 생장을 보였다. 또한, 세 균주 모두 pH 3에서는 생장하지 않았다. Ahn [1]의 연구에서 Weissella sp. S1, S2 및 S3는 pH 5와 pH 9 사이에서 잘 자랐고 pH 4, pH 10, pH 11에서는 낮은 성장을 보였다.

Fig. 3. Effects of initial pHs on growths of Weissella sp. ISF-1 (□), ISF-2 (△) and ISF-3 (○).

초기 NaCl 농도(%)에 따른 Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들의 생장 양상을 Fig. 4에 나타내었다. 세 균주 모두 0~5% (w/v) NaCl에서 비교적 잘 자랐고, 7% (w/v) NaCl에서는 약 30% 정도의 생장 억제가 나타났으며, 9%(w/v) NaCl 이상에서는 강력한 생장 억제가 나타났다. Ahn[1]의 연구에서도 Weissella sp. S1, S2 및 S3는 5%(w/v) NaCl에서 비교적 잘 자랐고, 7% (w/v) NaCl에서 약간의 생장 억제가 나타났으며, 9% (w/v) NaCl 이상에서는 강력한 생장 억제가 나타났다. 따라서, 본 연구의 Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주는 내염성 균주로 판단된다.

Fig. 4. Effects of initial NaCl concentrations on growths of Weissella sp. ISF-1 (□), ISF-2 (△) and ISF-3 (○).

쌀발효 동결건조물의 항균활성

MRSA에 대해 가장 높은 항균 활성을 나타낸 Weissella sp. ISF-1 균주를 이용하여 발효한 쌀발효 동결건조물의 항균 활성을 Fig. 5에 나타내었다. 항균 활성 측정을 위하여 pH가 보정되지 않아 pH가 4.0인 쌀발효물과 섭취의 편의성을 위하여 pH를 6.5로 조정한 쌀발효물을 동결건조하여 시료로 사용하였다. 쌀발효 동결건조물(pH 4.0)과 pH조절 쌀발효 동결건조물(pH 6.5)은 B. cereus에 대하여 각각 5.0, 9.0 mm의 항균 활성을 보였고(Fig. 5A), S. aureus 에 대하여 각각 2.5, 2.0 mm의 항균 활성을 나타내었으며(Fig. 5B), MRSA에 대해서도 각각 1.3, 1.0 mm의 항균 활성을 보였다(Fig. 5C). 유산균은 젖산, 박테리오신, 과산화수소 등을 생성하여 병원균의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다[2]. 유산균은 glucose, lactose를 탄소원으로 사용하여 최종산물로 유산, 초산 등의 유기산을 주로 생산하는데, 유산균이 생산한 유기산들은 pH를 감소시켜 병원성 미생물이나 식품 위생 미생물의 생육을 억제하는 작용을 하며, 유기산 자체가 항균력을 나타내기도 한다고 보고되어 있다[13]. 본 연구에서는 쌀발효물의 동결건조를 통하여 과산화수소는 제거되었을 것으로 판단되며 pH 6.5에서도 항균활성이 있으므로 산성에 의한 항균 가능성은 낮은 것으로 판단되었다. Ahn 등[1]은 새우젓갈에서 Weissella 속 세균을 분리하고 MRSA 등에 대한 항균활성을 확인하였고 박테리오신을 분리하고 열안정성 등의 특성을 밝혔다[1].

Fig. 5. Antibacterial activities of lyophilisate of a fermented rice product (pH 4.0) and a pH adjusted fermented rice product (pH 6.5) by Weissella sp. ISF-1 against pathogenic bacteria (A) B. cereus, (B) S. aureus (C) MRSA. (Med.: an MRS broth medium containing 5% (w/v) NaCl).

본 연구에서 획득한 Weissella sp. ISF-1, ISF-2, ISF-3 균주들은 프로바이오틱스가 될 수 있으며, MRSA와 같은 장내 유해 세균의 생육 억제에 활용이 가능할 것으로 판단된다. 또한, Weissella sp. ISF-1 균주를 이용하여 발효한 쌀발효물의 항균 활성이 확인되었으므로, 이를 활용한 쌀 소비시장의 활성화에 기여할 수 있는 새로운 기능성의 쌀 가공 제품의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.