Diversity and Succession of the Bacterial Community during the Initial Fermentation Period in Modernized Soy Sauce (Ganjang)

개량식 간장의 발효 초기 단계에서의 미생물 다양성 및 천이에 관한 연구

Abstract

The taste and quality of soy sauce, a fermented liquid condiment, is greatly influenced by microbial metabolism during fermentation. To investigate the microbiological characteristics of ganjang during the initial fermentation process, we prepared meju (fermented soybean) blocks fermented with starter cultures and solar salts and analyzed the microbial community quantitively using 16S rRNA gene profiling from ganjang that had been fermented over a five-week period. The ganjang samples were collected and analyzed after soaking for week one (1W), three (3W), and five (5W) weeks. We found that Halomonadaceae was significantly higher in the 1W group (89.83%) than the 3W and 5W groups (14.46%, and 13.78%, respectively). At a species level, Chromohalobacter beijerinckii and Chromohalobacter canadensis were the dominant species in the 1W group but several taxa such as Bacillus subtilis, Pediococcus acidilactici, and Enterococcus faecalis were more abundant in the 3W and 5W groups. Pearson correlation analysis of the relative abundance of the bacteria showed a negative correlation between Chromohalobacter and two bacterial genera Bacillus and Enterococcus. Beta-diversity showed a statistical distinction between the 1W and the 3W and 5W groups, while no significance was evident between the 3W and 5W groups. Linear discriminant effect size analysis was used to identify biomarkers and significant differences in the relative abundance of several halophilic bacteria, Bacillus sp. and lactic acid bacteria at 1W, 3W, and 5W, recpectively, which indicates the important role of the bacterial community at these time points.

콩을 주원료로 발효하여 제조되는 조미료인 간장의 맛과 품질은 발효 중 미생물의 대사에 큰 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 개량식 간장의 초기 발효과정에서 미생물학적 특성을 분석하기 위해 본 연구원 보유 미생물을 스타터로 활용한 메주와 염수를 이용하여 간장을 제조하였으며, 5주간의 발효과정에서 발효 1주차, 3주차, 5주차 간장 시료의 16S rRNA 유전자를 정량적으로 분석하였다. 발효기간에 따른 미생물의 분포를 분석한 결과 발효 1주차 간장에서는 Halomonadaceae과 미생물이 89.83%를 차지하였으며, 3주차 간장과 5주차 간장에서는 각각 14.46%, 13.78%로 나타나 매우 유의한 수준으로 높은 것으로 나타났다. 종 수준에서 미생물 분포를 분석한 결과 발효 1주차 간장에서는 Chromohalobacter beijerinckii와 Chromohalobacter canadensis가 가장 우점하는 미생물로 나타났으나, 발효 3주차와 5주차 간장에서는 Bacillus subtilis, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecalis가 상대적으로 높은 비율로 우점하는 것으로 나타났다. 또한, 발효과정 중 우점 미생물의 분포 상관관계를 분석한 결과 Chromohalobacter는 Bacillus, Enterococcus와 음의 상관관계를 나타냈다. Beta-diversity 분석 결과 발효 1주차 간장의 미생물 군집은 발효 3주차, 5주차 간장의 미생물 군집과 통계적으로 유의한 수준의 차이가 있는 것으로 나타났으나, 발효 3주차 간장과 5주차 간장의 미생물 군집 사이에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 간장 발효기간별 바이오 마커를 분석하기 위해 선형 판별 효과 크기 분석을 수행한 결과 호염성 미생물, Bacillus 속 미생물, 유산균의 상대적인 풍부도가 발효기간에 따른 미생물 군집 구조 차이에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

서론

간장은 콩을 주원료로 하는 발효식품으로서, 탄수화물을 주식으로 하는 우리나라 국민들에게 부족하기 쉬운 비타민, 미네랄, 필수 지방산 및 필수 아미노산 등의 영양분을 보충해주는 영양학적으로 우수한 조미식품이다[2]. 간장의 주요 기능으로는 맛과 풍미를 부여하는 1차적인 기능, 대두 등의 원료로부터 유래되는 영양성분 공급원으로서 2차적인 기능과 생체조절과 같은 3차적인 기능이 있다. 특히, 3차 기능으로서 항노화, 항산화성, 항종양성, 콜레스테롤 생성억제 등과 같은 기능성이 확인됨에 따라 식품학적 가치를 재조명 받고 있으며, 아시아권 식품의 세계화와 더불어 그 사용범위도 점차 확대되고 있다[2, 7, 18]. 현재 국내에서 생산 및 유통되고 있는 간장은 제조방법에 따라 크게 한식간장과 개량간장으로 구분된다. 한식간장은 자연 발효시킨 메주를 염수에 담금하여 발효, 숙성한 후 여액을 가공한 것으로 재래식 국간장 또는 재래식 한식 간장이라고 하며, 개량간장은 개량메주를 주원료로 식염수에 담금하여 발효, 숙성한 후 여액을 가공한 것으로 개량식 한식간장 또는 개량식 국간장이라고 한다[10]. 재래식 한식 간장은 메주의 제조 과정에서 자연으로부터 유래한 다양한 곰팡이와 세균의 복합적인 작용에 의해 표준화가 어려우며, 제조, 발효 및 숙성 기간이 6개월 이상의 장기간이 소요되어 산업화가 어려워 생산량이 적다는 문제점이 있다[7]. 이러한 재래식 한식 간장의 단점을 보완하기 위한 방법으로 종균의 사용이 바람직하며[12], 소비자들의 웰빙, 건강에 대한 관심이 증가함에 따라 간장의 소비가 증가하고 있는 추세에 따라 산업적으로 대량생산 공정을 갖춘 기업에서 개량식 간장을 제조하여 증가하는 수요에 대응하는 동시에 우리 고유의 맛을 살리고자 노력하고 있다[2, 9].

간장을 포함한 발효식품의 특성은 원재료, 제조지역, 숙성기간과 발효조건 등의 다양한 요인에 따라 크게 달라지며, 특히 맛, 풍미, 기능성 물질과 같은 특성을 결정하는데 미생물이 중요한 역할로 작용하는 것이 알려져 있다[5, 11]. 간장의 발효와 숙성과정에 관여하는 미생물로 Bacillus 속 미생물과 Lactobacillus 속, Pediococcus 속, Leuconostoc 속 등의 유산균 등이 보고되어 있으며, 이러한 미생물은 대부분 메주에서 기인하는 것으로 알려져 있으나[11], 종균을 사용하여 제조되는 개량식 간장의 발효 기간에 따른 주요 미생물들의 분포 변화 또는 발효과정에서의 미생물간 상관관계에 대한 연구가 아직 미비하여 제품의 품질 유지 또는 개선을 위한 자료가 부족한 실정이다. 이에 따라, 본 연구에서 차세대염기서열분석법을 활용하여 간장의 맛, 풍미 및 품질에 영향을 미치는 것으로 알려진 미생물 분포를 발효초기 단계의 기간별로 분석하였으며, 개량식 간장 제조를 위한 미생물학적 기초자료를 제시하고자 한다.

재료 및 방법

메주, 간장의 제조

미생물 군집 분석을 위한 메주, 염수 및 간장 시료는 모두 순창장류(주)(전라북도 순창군, 한국)로 부터 제공받았으며, 메주 제조를 위한 대두와 천일염은 모두 국내산을 사용하였다. 메주 제조를 위한 스타터 균주로는 본 연구소에서 분리하여 보유하고 있는 Aspergillus oryzae 1종과 Bacillus amyloliquefaciens 균주 1종을 사용하였으며, 메주와 간장 제조를 위한 제조 공정도를 Fig. 1에 나타내었다. 종균을 사용하여 제조한 개량식 간장의 발효 초기 단계의 미생물 다양성과 천이(succession)를 분석하기 위해 메주, 염수 및 간장을 실험 시료로써 실험에 사용하였다. 담금 과정 전, 간장 제조에 사용될 메주와 염수를 수집하였고 담금 과정 이후 1주차 부터 2주 간격으로 액상 부분인 간장을 회수하여 미생물 군집 분석을 위한 시료로 사용하였으며, 획득한 시료는 모두 균질화를 하여 메주는 1 g, 염수와 간장은 1 ml 씩 실험에 사용하였고 간장의 발효기간 동안 고체(메주)를 분리하지 않았다.

Fig. 1. A manufacturing process diagram of Meju and Ganjang.

메주와 염수, 간장 시료의 total genomic DNA 추출

종균을 활용하여 제조한 메주와 염수, 간장으로부터 미생물 군집을 분석하기 위한 DNA는 QIAGEN사의 Power Food Microbial Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)의 추출 가이드에 따라 추출하였으며, 추출된 DNA는 0.8% agarose gel 전기영동을 수행하여 DNA의 분절 정도를 확인하였다. Qubit 4 (Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 추출된 각 DNA의 정밀한 DNA의 농도를 측정하였으며, Nanodrop One 장비를 이용하여 DNA의 순도를 측정하여 최종적으로 16S rRNA 유전자 library를 제작하기 위한 DNA의 품질검사를 수행하였다.

16S metagenomic library 제작

메주와 염수, 미생물 군집분석을 위한 16S rRNA library를 제작하기 위해 Illumina사의 16S metagenomic sequencing library preparation guide [8]에 따라 16S rRNA 유전자의 V3-V4 region을 증폭하기 위한 1차 PCR을 수행하였으며, V3-V4 region의 서열을 증폭하기 위한 PCR premix로 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Roche, Basel, Switzerland)와 universal primer set (forward : 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3', reverse : 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CT A ATC C-3', N; A or C or G or T, W; A or T, H; A or C or T, V; A or C or G)를 혼합하여 PCR을 수행하였으며, PCR은 이전의 연구방법[5]에 따라 25회 반복하여 수행하였다. 1차 PCR 종료 후 AMpure XP bead (Beckman Coulter, Brea, California, USA)를 이용하여 증폭산물 이외의 불순물을 제거하였다. 각 시료로부터 생산되는 raw read들의 구분을 위한 index primer로 Nextera XT Index kit v2 (Illumina)를 사용하였으며, 각각 다른 조합의 index를 library에 연결하기 위한 2차 PCR은 이전의 연구방법[5]에 따라 8회 반복하여 수행하였다. 2차 PCR 종료 후 AMpure XP bead를 이용하여 증폭산물 이외의 불순물을 모두 제거하여 최종 16S rRNA 유전자 library를 제작하였다. 1.5% agarose gel에 전기영동을 진행하여 library의 크기를 분석하였으며, Qubit 4 장비와 Nanodrop One 장비를 이용하여 각 library의 농도와 순도를 분석하여 품질검사를 수행하였다.

염기서열 분석

각 library는 모두 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) buffer를 이용하여 4 nM의 동일한 농도로 희석하여 정규화하였으며, HT1 buffer (Illumina)를 이용하여 최종 7 pM의 library를 제작하였다. 염기서열 분석의 품질 및 보정을 위해 30% PhiX (Illumina)를 spike-in 하여 대조군으로 사용하였으며[8], 최종 30% PhiX를 포함한 library를 MiSeq reagent kit V3 (Illumina)의 cartridge에 주입하여 Illumina사의 MiSeq platform을 이용하여 염기서열을 분석하였다. Sequencing 방법으로는 library의 양쪽 말단으로부터 염기서열을 분석하는 paired-end를 선택하여 2x301회의 sequencing cycle을 수행하였다.

통계분석

각 시료로부터 얻은 read로 부터 alpha-diversity 지수 및 미생물 분포, beta-diversity 분석은 CJ 바이오사이언스사의 EzBiocloud 16S-based microbiome taxonomic profiling (MTP) pipeline [21]을 통해 수행하였다. PCR 과정에서 생산된 raw read 중 non-bacterial, chimeric, low quality amplicon을 제거하여 통계 분석을 위한 valid read로 사용하였으며, OTUs 기반의 분류학적 수준에 따른 미생물을 분류하기 위한 database로 PKSSU 4.0 database [4]가 사용되었고 97% cut off 값으로 종 수준의 생물학적 분류를 진행하였다[21]. 메주 및 염수, 발효 기간에 따른 간장의 개별 시료의 alpha-diversity 지수 및 미생물 분포 분석에는 single MTP browser를 사용하였으며, 각 시료간 미생물 군집 구조 차이를 나타내는 beta-diversity의 통계학적 유의성 분석에는 comparative MTP analyzer를 이용하였으며, beta-diversity 통계분석은 generalized UniFrac distance metric[1]을 기반으로 수행되었으며, permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) 분석[19]을 통해 발효 기간에 따른 미생물 군집 구조에 통계적으로 유의한 차이가 있는지 분석하였다. 간장의 발효 기간에 따라 유의한 수준의 분포 차이를 나타내는 미생물을 분석하기 위해 linear discriminant analysis effect size (LEfSe) [17]분석을 수행하였으며, LDA score가 2.0 이상인 미생물을 생물학적 분류수준에 따라 분석하였다.

결과 및 고찰

메주 및 염수, 발효 기간에 따른 간장의 alpha-diversity 분석

메주 및 염수, 발효 기간에 따른 간장으로부터 얻은 raw read의 trimming 후 시료당 평균 95,880개의 valid read를 얻었으며, 모든 시료에서 Good's coverage of library가 99.80% 이상으로 나타나 각 시료의 미생물 군집 구조를 분석하기 위한 read의 수가 통계적으로 충분한 것으로 나타났다(Table 1). 종 추정치 지수(OTUs)와 종 풍부도 지수(ACE, CHAO) 및 종 다양성 지수 중 종 간의 계통학적 차이를 수치화 하여 종 다양성을 나타내는 phylogenetic diversity 지수가 메주와 염수보다 간장에서 통계적으로 유의한 수준으로 높은 것으로 분석되었다. Shannon 지수는 종 균등성을 수치화 하여 표현하는 종 다양성 지수로 값이 클수록 다양성 증가를 의미하며, Simpson 지수는 분석된 염기서열이 다른 염기서열과 동일한 확률을 나타내어 값이 낮을수록 다양성 증가를 나타낸다. 두 가지 지표를 분석한 결과, 3주차까지 미생물 군집의 다양성이 증가하다 5주차에서 감소하는 추세가 나타났으며, 간장의 발효 기간 중 발효 3주차의 종 추정치, 종 풍부도, 종 다양성 지수가 가장 높은 것으로 나타났다(Fig. 2). 간장의 발효에 영향을 미치는 메주와 염수는 각각 미생물 군집을 이루는 미생물 종이 다르며, 이에 따라 상기결과는 간장의 미생물 군집이 두 종류의 원재료로부터 기인하였기 때문으로 판단되[6, 13], 간장의 숙성시기 중 20일 전후에 미생물수가 크게 증가하여 미생물의 생육이 가장 활발한 것으로 나타난 연구결과[20]와 유사한 것으로 나타났다.

Table 1. Sample codes for this study and summary of valid reads remained after trimming

Fig. 2. Changes of alpha-diversity indices among groups during fermentation. Alpha-diversity of microbial communities is shown as species richness, diversity, and evenness.

간장의 발효기간에 따른 미생물 분포 변화 분석

간장의 발효기간에 따른 미생물 분포 변화를 분석하기 위해 담금 1, 3, 5주차에 sampling하여 미생물 군집을 분석하였다. 발효기간에 따른 간장 미생물 군집을 구성하는 미생물을 생물학적 분류 수준에 따라 분석하였다. 발효 1주차에는 호염성 미생물(Oceanospirillales, Halomonadaceae)가 가장 우점하였으나, 발효 3주차와 5주차에는 유산균(Lactobacillales, Lactobacillaceae)과 Bacillales 목, Bacillaceae 과가 가장 우점하는 것으로 나타나 간장 발효 1주차부터 3주차 사이에 우점종이 크게 변하는 것으로 나타났다(Fig. 3). 종 수준에서 미생물 분포를 분석한 결과 간장 발효 1주차에는 Chromohalobacter beijerinckii, Chromohalobacter canadensis가 각각 54.36%, 32.36%를 차지하여 가장 우점하였으나, 발효 3주차에는 Bacillus subtilis와 Pediococcus acidilactici가 각각 24.99%, 27.66%를 차지하여 가장 우점하였으며, 발효 5주차에는 Bacillus subtilis가 32.74%, Pediococcus acidilactici가 25.46%를 차지하여 가장 우점하는 것으로 나타났다. 장 담금에 사용된 메주의 미생물 분포는 Bacillus licheniformis (47.63%), Pediococcus acidilactici (29.77%), Enterococcus faecium (10.38%), Bacillus subtilis (8.61%)가 우점종으로 나타났으며, 염수의 미생물 분포는 Staphylococcus equorum (25.18%), Tetragenococcus halophilus (23.54%), Chromohalobacter beijerinckii (13.55%), Chromohalobacter canadensis (9.54%)가 우점종으로 나타났다. 간장의 발효 초기에는 염수로부터 유래한 것으로 예상되는 Chromohalobacter beijerinckii, Chromohalobacter canadensis와 같은 호염성 미생물이 크게 우점하는 것으로 나타났으며, 발효 3주차부터 메주로부터 유래한 것으로 예상되는 Bacillus subtilis, Pediococcus acidilactici가 우점하는 것으로 나타났다(Fig. 4). 발효 기간에 따른 우점 미생물들의 분포 상관관계(Pearson correlation coefficient)를 분석한 결과를 Fig. 5에 나타내었다. 속 수준에서 분석한 결과 Pseudomonas와 Bacteroides, Enterococcus와 Pediococcus는 매우 높은 수준의 양의 상관관계(r>0.90)를 나타내었으며, Enterococcus와 Chromohalobacter, Chromohalobacter와 Bacillus는 매우 높은 수준의 음의 상관관계(r < -0.90)를 나타내었다(Fig. 5A). 종 수준에서는 Chromohalobacter beijerinckii와 Chromohalobacter canadensis, Enterococcus faecium과 Pediococcus acidilactici가 매우 높은 수준의 양의 상관관계를 나타내었으며, Chromohalobacter beijerinckii와 Bacillus subtilis, Chromohalobacter canadensis와 Bacillus subtilis는 매우 높은 수준의 음의 상관관계에 있는 것으로 나타났다(Fig. 5B). 이전의 연구 결과[14]에 의하면 간장의 40일까지의 발효기간 동안 pH가 감소한다고 보고한 바 있으며, 이번 연구에서 간장의 발효 기간에 따라 Pediococcus와 Enterococcus와 같은 유산균의 분포가 동시에 증가하는 것을 확인할 수 있어 간장의 pH 감소에 유산균이 영향을 미치는 것으로 판단된다. Mannaa 등의 연구 결과[15]에 의하면 된장의 발효기간 동안 미생물간의 상관관계를 분석한 결과 Bacillaceae 과(family)와 호염성 또는 내염성 미생물 과인 Halomonadaceae 과 사이에 통계적으로 유의한 수준의 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, Bacillaceae 미생물이 Chromohalobacter 속 미생물과 같은 호염성 또는 내염성 미생물의 비율을 감소시킨다 보고한 바 있어 간장에서도 Bacillus 속 미생물 분포에 따른 길항작용에 의해 호염성 또는 내염성 미생물의 증식이 조절되는 것으로 판단된다. 간장의 발효기간에 따른 pH, 산도, 당도, 염도 등과 같은 이화학적 분석을 추가적으로 수행한다면 미생물과 간장의 이화학적 특성과의 상관관계 및 인과관계를 규명할 수 있을 것으로 기대되며, 간장의 미생물 군집 구조를 이루는 우점종이 메주와 염수로부터 유래되므로, 간장 제조의 원재료로 사용되는 메주와 염수의 미생물 분포가 간장의 미생물 및 이화학적 특성에 큰 영향을 미칠 것으로 추측된다.

Fig. 3. Mean of bacterial proportion during fermentation periods at phylum (A), class (B), order (C), family (D), genus (E), and species (F) levels.

Fig. 4. Comparison of relative abundances of bacteria among raw materials and Ganjang fermented during each periods.

Fig. 5. The correlation matrix heatmap shows the values of the Pearson correlation coefficient (r) for different dominant genus (A) and species (B) in Ganjang samples.

발효 기간에 따른 간장의 beta-diversity 분석

간장의 발효기간에 따른 미생물 군집 구조 차이의 유무를 위해 Generalized UniFrac metric 기반의 principal coordinate analysis (PCoA) 분석과 UPGMA-clustering 분석을 통하여 시각화하였다. PCoA와 UPGMA-clustering 분석 결과 발효 1주차 그룹의 cluster는 3주차와 5주차 그룹의 cluster와 명확히 분리되는 것을 확인하였으나, 3주차 그룹의 cluster와 5주차 그룹의 cluster는 명확히 분리되지 않는 것으로 나타났다. 발효 1주차 그룹의 cluster에 비해 발효 3주차 그룹의 cluster와 5주차 그룹의 cluster는 각 그룹의 중심으로부터 산포도가 증가하였으며, 이는 간장의 발효기간이 길어짐에 따라 외부환경 변화에 따른 미생물 풍부도와 다양성이 증가하면서 개별 시료간의 다양성이 증가한 것으로 판단된다(Fig. 6). PERMANOVA 분석을 통해 발효기간에 따른 간장의 미생물 군집구조에 통계적으로 차이가 있는지 분석하였다. 1주차 부터 5주차까지의 전체 발효기간에 따른 미생물 군집구조에는 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타나 5주간의 간장 발효기간 동안 미생물 군집 구조가 변화한다는 것을 확인하였다. 2주 단위의 간장 발효기간별 미생물 군집 구조 차이에 대한 분석 결과 발효 1주차 간장의 미생물 군집 구조는 3주차와 5주차 간장의 미생물 구조와 통계적으로 차이가 있는 것으로 나타났으나, 3주차 간장의 미생물 군집 구조와 5주차 간장의 미생물 군집 구조에는 통계적으로 차이가 없는 것으로 나타나 간장의 담금 단계부터 발효 3주차까지의 발효 초기단계에는 미생물천이가 급격하게 일어나는 것으로 나타났으며, 3주차 이후부터는 발효기간에 따른 미생물 분포에 큰 차이가 없는 것으로 판단된다(Table 2). 이러한 결과는 간장 발효 3주 까지의 pH가 급격하게 감소하는 단계[3, 6]에서 우점종이 Chromohalobacter 속 호염성 미생물에서 Bacillus 속 미생물 또는 Pediococcus, Enterococcus 속과 같은 유산균으로 교체되고, 이후 우점종의 분포에 큰 변화가 없기 때문으로 판단된다.

Fig. 6. Principal coordinate analysis (A) and Unweighted paired group method with arithmetic mean tree (B) of microbial community composition constructed from Generalized UniFrac distance metric. (Blue circle & bar ; Ganjang fermented for 1 week, green circle & bar ; Ganjang fermented for 3 weeks, red circle & bar ; Ganjang fermented for 5 weeks).

Table 2. PERMANOVA table showing the significant effect of fermentation periods on microbial structure

Taxonomic biomarker 분석

간장의 발효기간에 따른 미생물 군집 구조를 이루는 미생물의 상대적 존재비를 기반으로 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 미생물을 확인하기 위해 LEfSe 분석을 수행하였으며, 선형 판별 분석 점수(LDA effect size, Linear discriminant analysis effect size)에 따라 발효 기간별 biomarker를 분석하였다. 간장의 발효기간에 따른 미생물 군집 구조 차이에 영향을 미치는 미생물을 전체 생물학적 분류 수준에서 LDA effect size가 높은 미생물을 순서대로 나열하였으며, 각 미생물의 생물학적 분류 수준과 LDA effect size, p-value 및 상대적 풍부도를 Fig. 7A에 나타내었다. 간장 발효기간에 따른 미생물 군집 구조에 가장 큰 영향을 미치는 LDA effect size 상위 20종의 미생물은 모두 호염성 미생물 또는 유산균, Bacillus (f_Bacillaceae, o_Bacillales, c_Bacilli, p_Firmicutes)로 나타났다. 5주 동안의 전체 간장 발효 기간에서 가장 큰 분포의 변화가 나타난 미생물은 Chromohalobacter (f_Halomonadaceae, o_Oceanospirillales, c_Gammaproteobacteria, p_Proteobacteria)로 발효기간 동안 분포가 감소하면서 간장의 전체 미생물 군집 구조 차이에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 유산균(f_Lactobacillaceae, f_Enterococcaceae)과 Bacillus (f_Bacillaceae, o_Bacillales, c_Bacilli, p_Firmicutes)는 발효기간 동안 분포가 증가하는 것으로 나타났다. 발효기간별 종 수준에서 LDA effect size에 따른 biomarker를 분석한 결과 발효 1주차에는 Chromohalobacter 속 미생물이 상대적으로 많이 분포하였으며, 3주차에는 Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium과 같은 유산균과 Bacillus 속 미생물 중에는 B. licheniformis, B. coagulans가 상대적으로 많이 분포하는 것으로 나타났으며, 발효 5주차에는 B. subtilis와 호염성 미생물인 Tetragenococcus halophilus의 분포가 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 7B).

Fig. 7. LEfSe analysis of taxonomic biomarkers of microbiota. A LEfSe analysis identified the most differentially abundant taxa (A). Biomarkers of different species were identified (B).

간장의 발효기간별 우점미생물 대부분이 간장 제조를 위한 원재료인 메주와 염수의 우점미생물과 동일한 것으로 나타나 간장의 미생물 군집을 이루는 미생물은 원재료부터 유래하는 것으로 판단된다. 간장의 발효 1주차 까지는 염수로부터 유래되는 미생물로 예상되는 Chromohalobacter 속 미생물이 우점하는 것으로 나타났으며, 3주차와 5주차에는 메주로부터 유래하는 것으로 예상되는 Pediococcus acidilactici와 Bacillus subtilis가 우점하는 것으로 나타났다. 특히 Chromohalobacter는 염장식품에서 문제가 되는 biogenic amine을 생산하는 것으로 알려져 있어 Bacillus 속 미생물의 길항작용을 통하여 Chromohalobacter의 분포를 조절할 수 있을 것으로 기대되며[16], 발효 5주차에서 biomarker로 검출된 호염성 유산균으로 알려진 Tetragenococcus halophilus는 된장에서 염도에 따라 30~80% 수준으로 분포하며[6], 아플라톡신 B1 분해능 및 항알러지 효능이 있는 것으로 알려져 있어[15] 발효기간 조절을 통해 간장의 일부 유해 미생물 및 유익 미생물의 분포 조절을 통한 간장의 생물학적 품질 개선에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구에서는 종균을 활용한 메주를 주원료로 개량식 간장을 제조하였으며, 개량식 간장의 발효 기간에 따른 미생물 분포 변화와 미생물간의 분포 상관관계를 분석하여 개량식 간장의 발효 초기 단계에 대한 미생물학적 기초자료를 확보하였다. 간장 제조를 위한 종균 또는 제조 공정 중의 이화학적 조건이나 외부환경 조건 등의 복합적인 요인들에 관한 실험과 미생물에 의한 품질 특성 영향, 간장 발효에 영향을 미치는 미생물의 조절 등의 추가적인 연구 수행 추진을 위한 연구 기반자료로 활용이 기대되며 간장의 특성 및 품질의 발전에 기여할 수 있을 것으로 희망된다.

감사의 글

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 연구되었습니다(과제번호 : 322023-4).

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.