서론
김치는 배추, 무, 오이 등의 채소를 소금에 절여 적절한 부재료와 양념을 가미하여 일정 기간 숙성시켜 제조되는 한국의 고유 전통 발효식품으로, 김치의 종류는 제조 지역의 특성과 제조 방법 및 재료 등에 따라 매우 다양하고, 현재까지 알려진 김치의 종류만 해도 수백 가지에 달한다[11]. 김치는 맛, 조직감, 품질 등이 좋고 한국인들에게 섬유질, 비타민, 미네랄, 식물성 화합물 등과 같은 주요 영양원을 공급해 주는 필수 식품으로[23], 2006년 미국의 건강 전문지인 Health에서 세계 5대 건강식품으로 선정되면서 전 세계적으로 건강 기능성 식품으로 주목받고 있다[27].
김치의 기능성을 높여주는 주요 인자는 김치 제조 시 사용되는 재료와 김치의 발효에 관여하는 미생물 및 발효 숙성 과정을 거치며 생성된 발효산물 등이 있으며, 이들의 복합 작용에 의해 면역증강, 항비만, 항노화, 항산화, 항암 효과 등을 갖는다고 알려져 있다[24]. 과거에는 주로 가정에서 직접 김치를 만들어 먹었지만, 지금은 50% 정도가 산업체에서 제조되고 있으며, 급속한 국민소득 증대와 핵가족화 및 편의성을 추구하는 소비자 생활패턴 변화 등으로 인해 김치 시장의 산업 규모가 점차 확대되고 있다. 그중에서도 한국의 대표적인 김치인 배추김치의 경우 김치 소비시장의 약 70%를 차지하고 있으며[26], 김치 시장의 세분화와 함께 다양한 소비자의 기호도에 따라 숙성 정도를 달리한 김치의 수요도 증가하는 추세이다[8].
김치는 숙성 정도에 따라서 갓 담은 김치, 익은 김치, 묵은지 등으로 나눌 수 있다. 갓 담은 김치는 김장 후 숙성 과정을 거치지 않은 김치로 절기 상 입동 전, 후에 김치를 대량으로 담가 겨우내 먹는 김장 김치라 부르며, 통상적으로 김장 김치라 하면 포기 배추김치를 일컫는다[12]. 묵은지는 일반 배추김치보다 양념이 많이 들어가지 않고 6개월에서 1년 이상 발효 및 숙성되어 제조되는 묵은 김치로 특유의 독특한 풍미를 지닌 비살균 자연 발효식품이다[20]. 김치의 숙성에 따른 pH, 산도 등의 이화학적 특성과 발효에 관여하는 다양한 미생물은 김치의 풍미에 영향을 미치는 주요 인자로 작용한다고 알려져 있다[29]. 이에 대하여 김치의 발효 및 숙성 정도에 따른 이화학적 특성 및 미생물에 대한 연구가 수행된 바 있으나, 국제식품규격외원회에서 제정한 김치의 표준 국제규격은 식염 1.0~4.0%, 산도 1.0% 이하의 김치에만 한정되어 있어 산도 1.0% 이상을 품질기준으로 하는 묵은지는 규격에 포함되기 어려우며[2], 묵은지는 다른 김치 종류에 비해 미생물 군집 구조에 대한 연구도 미비한 수준이다.
현재까지 진행된 묵은지에 대한 연구는 제조 및 숙성과정에 따른 품질 특성[7, 10, 16, 18, 20], 향미 및 관능적 특성 변화[4, 9], 묵은지 제조를 위한 혼합 스타터 개발[8, 19], 묵은지를 이용한 제품개발[13, 14], 발효 미생물[3, 22] 등이 이루어졌으나, 시판 묵은지에 대한 품질 및 미생물학적 특성에 대한 비교 연구는 부족한 실정이다.
따라서, 본 연구에서는 숙성 과정을 거치지 않은 김치와 6개월에서 3년간 숙성시킨 시판 묵은지를 온라인을 통해 구매하여 숙성 기간에 따른 수집 시료의 품질 및 차세대 염기서열 분석기술(Next generation sequencing)을 활용하여 확인된 미생물 군집을 비교 분석하였으며, 향후 묵은지의 품질 규격의 개발 및 표준화에 활용될 수 있는 기초자료를 제공하고자 한다.
재료 및 방법
시료의 수집
본 연구에서는 김치와 묵은지 시료 간의 이화학적 특성 및 미생물 군집의 비교를 위하여 국내의 온라인 판매처로 부터 스타터를 사용하지 않은 김치와 자연적으로 발효시킨 묵은지 제품을 제품명에 따라 구매하여 시료로 사용하였다. 김치는 광주·전라 7종, 부산·경상 5종, 제주 3종 총 15종을 수집하였고, 묵은지는 광주·전라 8종, 부산·경상 4종, 제주 3종 총 15종을 수집하였다. 본 연구에서는 국립농산물품질관리원에서 발간한 전통식품 표준규격의 김치 표준 규격에 따라 김치는 산도 1.0% 이하, pH 3.8 이상, 묵은지는 산도 1.0% 이상, pH 3.4 이상인 시료로 구분하였다.
이화학적 특성 분석
수집한 김치와 묵은지 시료를 MQ7045 핸드블렌더(BRAUN, Kronberg, Germany)로 마쇄 후, 멸균된 거즈로 여과한 여액을 이화학적 특성 분석에 사용하였다. pH는 S20 Seven Easy pH meter (Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)를 사용하여 측정하였고, 적정 산도는 A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists)법에 따라 김치 및 묵은지 여액 10 ml에 0.1 N NaOH 용액을 pH 8.30이 될 때까지 적정한 후, 0.1 N NaOH 용액의 소비량을 다음 계산식에 대입하여 lactic acid (%) 함량으로 나타내었다[1].
산도(lactic acid %, w/v) = [(0.1 N NaOH 소비량(ml) × 0.1 N NaOH factor ×0.009/시료량(ml) ×100%)]
염도는 TM-30D 염도계(TAKEMURA, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였고, 당도는 김치 및 묵은지 여액을 10배 희석한 후, PAL-1 당도계(ATAGO, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.
Total DNA 추출
김치와 묵은지로부터 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위한 total DNA를 추출하기 위하여 QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하였으며, 제조사의 추출 방법에 따라 total DNA 추출을 진행하였다. 각 시료로부터 추출된 total DNA의 농도와 순도를 Qubit 4 형광측정기(Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA)와 Nanodrop One 분광광도계(Thermofisher scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 측정한 후 1.5% agarose 전기영동을 통해 추출된 total DNA의 품질을 검증하였다.
16S metagenomic library 제작 및 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)
미생물 군집 분석을 위한 16S metagenomic library 제작의 모든 과정은 Illumina (Illumina, San Diego, California, USA)사의 16S metagenomic sequencing library pre paration guide에 따라 수행하였다[6]. 추출된 total DNA 내의 16S rRNA 유전자의 V3-V4 부분을 증폭시키기 위하여 V3-V4 region target primer set (forward : 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3', reverse : 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3')와 KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. 1차 PCR 반응은 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초간 polymerization하는 단계를 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 최종 extension을 수행하는 조건으로 진행하였으며, library 이외의 불순물은 AMpure XP bead (BECKMAN COULTER, Brea, California, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 library마다 다른 index를 붙이는 2차 PCR을 수행하기 위해 Nextera XT Index kit v2 (Illumina, San Diego, California, USA)를 사용하였다. 2차 PCR 반응은 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초간 polymerization하는 단계를 8회 반복한 후, 72℃에서 5분간 최종 extension 반응을 수행하는조건으로 진행하였으며, library 이외의 불순물은 AMpure XP bead를 사용하여 제거하였다. 제작된 library의 품질 검증을 위해 Qubit 4 형광측정기와 Nanodrop One 분광광도계를 이용하여 library의 농도 및 순도 측정을 수행하고, 1.5% agarose 전기영동을 통해 제작된 library의 크기를 분석하였다. 각 library를 동일한 농도(4 nM)로 희석하는 normalization을 진행한 다음 pooling을 통하여 mixture를 제작하고, PhiX library (Illumina)와 혼합하였다. 최종적으로 combined library를 MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina) cartridge에 주입하고, Miseq (Illumina) 플랫폼을 통해 염기서열 분석을 실시하였다.
데이터 분석
염기서열 분석을 통하여 생산된 FASTQ 파일을 Ezbio Cloud 16S-based microbiome taxonomic profiling (MTP, CJ bio science Inc.) software를 통해 분석하였다. 각 시료의 library로부터 얻어진 read 중에서 low quality, non-target, chimeric read를 제거한 다음 97.0% 이상의 염기서열 유사성 기준으로 Operational taxonomic unit (OTU) clustering하였다. α-diversity 분석을 위한 종 다양성(diversity)의 지표로 Simpson, Phylogenetic diversity를 산출하였으며, 종풍부도(richness)의 지표로 ACE, Chao1, Jackknife, 종 균등성(evenness)의 지표로 NPShannon, Shannon을 산출하여 비교분석하였다. 시료 간 미생물 군집의 다양성 분석은 UniFrac metric [17]을 기반으로 한 β-diversity 분석으로 수행되었으며, 김치와 묵은지 미생물 군집의 차이를 비모수 다변량 통계 검정(PERMANOVA, Permutational multivariate analysis of variance) 분석으로 검증하였다. 마지막으로, 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe, Linear discriminant analysis effect size) 분석을 통하여 김치와 묵은지의 미생물학적 분류 수준에 따른 taxonomic biomarker를 분석하였다[28].
결과 및 고찰
김치 및 묵은지의 이화학적 특성
이화학적 특성 분석 결과 수집된 김치 시료 15종의 평균 pH와 산도는 각각 pH 5.50±0.43, 0.40±0.11%로 나타났으며, 묵은지 시료 15종의 평균 pH와 산도는 각각 pH 3.82±0.23, 1.44±0.29%로 나타났다. 수집된 모든 김치의 pH는 3.8, 산도는 1.0% 이하으로 나타났으며, 묵은지의 pH는 3.4, 산도는 1.0% 이상으로 나타나 전통식품 표준규격에 적합한 것으로 나타났다. 묵은지 시료들의 pH가 더 낮고, 산도는 더 높은 것으로 확인되었다. 이는 김치가 발효되는 동안 이형발효 유산균 및 동형발효 유산균의 작용을 통하여 젖산을 비롯한 다양한 유기산을 생성하기 때문으로 사료된다[30]. 또한 김치의 평균 염도는 3.02±0.52%, 평균 당도는 11.76±1.36 brix°였으며, 묵은지의 평균 염도는 3.03±0.59%, 평균 당도는 9.29±1.55 brix°로 나타나, 김치와 묵은지 간의 염도는 유의미한 차이가 없었지만, 당도에서는 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 김치 발효에 관여하는 미생물들이 에너지원으로 당을 이용하기 때문에 김치 발효 중에 김치 내의 환원당을 에너지원으로 이용함에 따라 당도가 낮아진 것으로 사료된다[25]. 이와 같은 연구 결과는 김치의 숙성기간이 경과할수록 pH는 급격히 감소하고 산도는 증가하며, 염도에서는 큰 변화를 보이지 않지만 당도는 감소한다는 Hwang 등의 연구 결과[5]와 유사하였다.
Table 1. pH, acidity, salinity, and sugar contents of Kimchi and Mukeunji samples
Symbols: KC: Kimchi, MEJ: Mukeunji
김치 및 묵은지 시료의 α-diversity 분석
김치 및 묵은지 시료의 α-diversity 분석 결과를 Table 2과 같이 요약하였다. 김치의 평균 valid read 수는 84,470개, 묵은지의 평균 valid read 수는 92,240개였으며, 모든 시료에서 99.7% 이상의 Good's coverage of library를 나타내 시료 내 미생물 군집을 파악하고 비교분석 하는데 신뢰성을 확보할 수 있는 충분한 read를 얻은 것으로 확인하였다. 김치와 묵은지의 종 추정치(OTUs) 수는 각각 346.60, 368.73으로 계산되었으며, 종 균등성(evenness)을 나타내는 Shannon 지표는 김치에서 1.13, 묵은지에서 1.25로 나타났고, 하나의 시료에서 임의의 두 read를 선택하였을 때 같은 종일 확률, 즉 종 다양성을 나타내는 Simpson 지표는 김치에서 0.55, 묵은지에서 0.49로 나타났지만, 종간의 계통학적 차이를 수치화하여 계통적 다양성을 나타내는 phylogenetic diversity 지표는 김치에서 평균 435.67, 묵은지에서 평균 539.33으로 나타나 김치와 묵은지 간의 미생물 분포의 균등성이나 다양성에는 차이가 없으나, 묵은지의 phylogenetic diversity 지표가 김치보다 유의미한 수준으로 높으므로(p=0.033) 묵은지에서 계통학적으로 먼 미생물이 김치보다 더 다양하게 존재하고 있음을 확인하였다.
Table 2. α-diversity of Kimchi and Mukeunji samples
Symbols: KC: Kimchi, MEJ: Mukeunji
김치 및 묵은지 세균 분포 분석
김치 및 묵은지의 세균 분포도를 확인하기 위하여 미생물학적 분류단계 수준에 따른 미생물의 비율을 Fig. 1에 나타내었다. 김치와 묵은지는 문(phylum) 수준에서 Firmicutes, 강(class) 수준에서 Bacilli, 목(order) 수준에서 Lactobacillales가 95% 이상의 비율을 차지한다는 공통점을 나타내었다. 과(family) 수준에서는 김치 Leuconostocaceae 83.74%, 묵은지 Lactobacillaceae 80.87% 비율로 차이를 보였으며, 속(genus) 수준에서는 Weissella 속이 김치의 60.62%를 차지한 반면, 묵은지에서는 Pediococcus 속이 57.61%를 차지하였다.
Fig. 1. Microbial composition and relative abundance in Kimchi (KC) and Mukeunji (MEJ) based on taxonomic levels of classification. uc: uncultured.
종(species) 수준에서는 김치에서 Weissella kandleri 58.97%, 묵은지에서 Pediococcus inopinatus 56.90%를 차지하였다. Pediococcus inopinatus의 경우 묵은지에서 56.90% 비율을 차지하는 묵은지의 우점 종인데 반해, 김치에서는 전혀 존재하지 않았다. Ohn 등의 연구 결과[22]에 의하면 전통발효식품인 가자미 식해로부터 분리된 Pediococcus inopinatus가 pH 2.5의 산성 조건에서 60% 이상의 생존율을 나타내었다고 보고한 바 있어 묵은지 내에서만 Pediococcus inopinatus가 존재하는 원인은 김치보다 평균 pH가 낮은 묵은지의 산성 조건에서도 높은 생존율을 보이기 때문인 것으로 사료된다.
또한 종 수준에서 평균 1.00% 이상의 비율을 차지하는 세균의 분포를 비교분석한 결과, 김치에는 Weissella kandleri, Leuconostoc gelidum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus algidus만 확인되었으나, 묵은지에는 Pediococcus inopinatus, Lactobacillus sakei, Weissella kandleri, Leuconostoc gelidum, Lactobacillus malefermentans, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus algidus가 확인되어 김치보다 묵은지에 더욱 다양한 미생물이 분포한다는 것과 미생물학적 분류 수준이 낮아질수록 미생물 분포 차이가 확연하게 드러나는 것을 확인할 수 있었다.
김치 및 묵은지 시료의 β-diversity 및 beta set-significance 분석
김치와 묵은지 시료 간의 세균 군집구조를 비교하기 위하여 UniFrac metric을 기반으로 한 β-diversity 분석을 실시하였다. 클러스터링을 통하여 시료 간 미생물 군집의 차이를 알아보는 PCoA (Principal coordinate analysis) 분석과 UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic mean) 분석을 수행한 결과, 속 수준과 종 수준에서 모두 김치와 묵은지 그룹 간의 클러스터가 명확하게 분리되는 것을 확인하였다(Fig. 2, Fig. 3). 또한, 김치와 묵은지의 미생물 분포에 통계학적으로 유의한 수준의 차이가 있는지 분석하기 위하여 Generalized UniFrac distance metric, UniFrac distance metric을 기반으로 PERMANOVA 분석을 수행하였다. 그 결과, p-value가 0.001로 나타나 김치와 묵은지의 미생물 분포가 상이하다는 것이 통계학적으로 검증되었다(Table 3).
Fig. 2. PCoA clustering result based on UniFrac dissmimilarity metric of bacterial communities at genus (A) and species (B) level (green circle : Kimchi, purple circle : Mukeunji).
Fig. 3. UPGMA clustering result based on UniFrac dissmimilarity metric of bacterial communities at genus (A) and species (B) level (green bar : Kimchi, purple bar : Mukeunji).
Table 3. PERMANOVA for bacterial communities from Kimchi and Mukeunji
Taxonomic biomarker 분석
김치와 묵은지 내의 세균 군집을 대표하는 지표(biomarker)를 확인하기 위한 LEfSe 분석을 실시하였다. 종 수준에서 2.0 이상의 LDA (Linear discriminant analysis) score를 LDA effect size로 하였으며, LEfSe 분석 결과를 바탕으로 LDA effect size 상위 22종의 taxa와 p-value를 Table 4에 나타내었다. 종 수준에서의 biomarker를 비교한 결과 Weissella kandleri, Leuconostoc gelidum은 상대적으로 김치에서 많이 분포하며, Pediococcus inopinatus, Lactobacillus malefermentans, Leuconostoc mesenteroides는 묵은지에 상대적으로 많이 분포하는 것으로 나타났다(Fig. 4). 이러한 biomarker 미생물들은 김치와 묵은지 사이에 p<0.05의 값을 나타내어 김치와 묵은지 세균 군집 간에 매우 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 묵은지에서 Pediococcus 속이 우점한다는 Hong 등의 연구 결과[3]와 유사하였다. 이전의 연구결과[15]에 의하면 Weissella 속과 Leuconostoc 속은 낮은 내산성으로 김치 발효 초기에 우점하나 Leuconostoc mesenteroides는 발효 후기에 우점하며, Lactobacillus 속 또한 높은 내산성으로 김치 발효 후기에 우점하는 것으로 알려진 바 있어 본 연구 결과와 유사하였으며, 김치의 미생물 군집 구조 변화는 김치 발효 기간이 진행됨에 따라 낮아지는 산도에 의한 것으로 판단된다.
Table 4. Biomarker analysis of microorganisms at the species level between Kimchi and Mukeunji using LEfSe analysis
Symbols: KC: Kimchi, MEJ: Mukeunji
uc: uncultured.
Fig. 4. Biomarker discovery by LEfSe analysis between Kimchi and Mukeunji at species level (green bar : Kimchi, purple bar: Mukeunji). uc: uncultured.
본 연구에서는 국내 시판 김치와 묵은지의 이화학적 특성 및 군집 구조를 비교 분석한 결과, 김치에 비하여 묵은지의 pH가 더 낮고 산도는 상대적으로 더 높으며, 염도는 유미한 차이를 보이지 않았지만, 당도는 김치가 더 높은 것을 확인하였다. 차세대 염기서열 분석기술을 통하여 군집 구조를 분석한 결과 김치보다 묵은지 내에 계통학적으로 먼 미생물이 더 다양하게 존재하고 있는 것으로 확인되어, 종 수준에서 평균 1.00% 이상의 비율을 차지하는 세균의 분포를 비교해 보았을 때, 김치에는 Weissella kandleri, Leuconostoc gelidum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus algidus로 나타났으나, 묵은지에는 Pediococcus inopinatus, Lactobacillus sakei, Weissella kandleri, Leuconostoc gelidum, Lactobacillus malefermentans, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus algidus가 나타났다. 특히 P. inopinatus는 묵은지 내에서만 특이적으로 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 김치와 묵은지 시료 간 미생물 분포에 통계학적으로 유의한 수준의 차이가 있는지 분석하기 위하여 PERMANOVA 분석을 수행하였으며, 그 결과 p-value가 0.001로 나타나 김치와 묵은지의 미생물 분포가 상이하다는 것이 통계학적으로 검증되었다. LEfSe 분석을 통하여 김치와 묵은지 내의 세균 군집을 대표하는 지표(biomarker) 탐색 결과 W. kandleri, L. gelidum은 김치의 biomarker 미생물이며, P. inopinatus, L. malefermentans, L. mesenteroides는 묵은지의 biomarker 미생물로 확인되었다. 이와 같은 연구 결과는 향후 묵은지의 품질 규격의 개발 및 표준화에 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
감사의 글
본 연구는 2022년 농림축산식품부 농축산·식품 마이크로바이옴 통합 바이오뱅크구축사업의 지원에 의해 수행된 것입니다.
The Conflict of Interest Statement
The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.
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