RAW 264.7 대식세포에서 환원형 glutathione인 luthione의 면역 증강 활성 평가

Evaluation of Immune Enhancing Activity of Luthione, a Reduced Glutathione, in RAW 264.7 Macrophages

Abstract

항산화제로서 산화적 손상의 방지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 glutathione (GSH)의 면역 조절에 대한 연구는 현재까지 제대로 이루어지지 않았다. 본 연구에서 우리는 환원형 GSH인 luthione^®이 RAW 264.7 세포에서 면역 강화 효과가 있는지를 조사하였다. 유세포 분석 및 면역 형광 실험의 결과에 의하면, luthione은 대조군 세포에 비해 대식세포의 대표적인 기능인 식세포 활성을 luthione 처리 농도 의적으로 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, cytokine array의 결과에 의하면, IL-5, IL-1β와 IL-27의 발현이 luthione이 처리된 세포에서 유의하게 증가하였다. 아울러 luthione에 의한 TNF-α 및 IL-1β의 생성 증가는 그들의 단백질 발현 증가를 통해 이루어졌으며, NO 및 PGE₂와 같은 면역 매개체 유리의 증가는 iNOS 및 COX-2의 발현 증가와 관련이 있었으며, 이는 M1 대식세포 분화 마커인 CD86 발현의 증가와 연관성이 있었다. 그리고 heatmap 분석을 통하여 SOCS1/3 매개 STAT/JAK 신호 전달 경로가 luthione에 의한 면역 조절 증가에 관여함을 확인하였다. 결론적으로, 우리의 결과는 luthione이 M1 macrophage polarization의 분자 조절자로 작용하여 면역 능력을 향상시킬 수 있음을 시사한다.

Although glutathione (GSH) has been shown to play an important role in the prevention of oxidative damage as an antioxidant, studies on immune regulation by it have not been properly conducted. In this study, we investigated whether luthione^®, a reduced GSH, has an immune enhancing effect in murine macrophage RAW 264.7 cells. The results of flow cytometry and immunofluorescence experiments indicated that luthione increased phagocytic activity, a representative function of macrophages, compared to the control cells. According to the results of the cytokine array, the expression of interleukin (IL)-5, IL-1β, and IL-27 was significantly increased in the luthione-treated cells. Luthione also enhanced the production of tumor necrosis factor-α and IL-1β through increased expression of their proteins, and increased release of the immune mediators such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E₂ was associated with increased expression of inducible NO synthase and cyclooxygenase-2. In addition, the expression of cluster of differentiation 86, an M1 macrophage marker, was dramatically enhanced in RAW 264.7 cells treated with luthione. Furthermore, as a result of heat map analysis, we found that cytokine signaling 1/3-mediated signal transducer and activator of transcription/Janus tyrosine kinase signaling pathway was involved in the immunomodulatory effect by luthione. In conclusion, our data suggested that luthione could act as a molecular regulator in M1 macrophage polarization and enhance immune capacity by promoting macrophage phagocytic function.

서론

면역계(immune system)는 감염, 질병 또는 기타 외부 침입 병원체에 대응하기 위한 생물학적 방어의 균형에 핵심적인 역할을 한다. 면역 반응은 선천 면역(innate immunity과 후천면역(adaptive 혹은 acquired immunity)으로 크게 구분된다. 선천 면역 체계는 외부 물질을 인식하고 즉각적인 방어를 하기 위하여 병원균의 특이적인 구조를 인식하는 수용체를 이용하여 세포독성 물질을 분비하거나 감염 세포를 사멸시킨다[21]. 적응 면역 체계는 B 세포 및 T 세포가 관여하는 체액성 면역반응(humoral immune response) 및 세포성 면역반응(cell-mediated immune response)으로 나눌 수 있으며, 전자는 항원 특이적인 항체의 생성으로 이어지며 후자는 T 세포 자체의 독성화 및 독성 물질 생성으로 이어져 감염된 세포의 사멸을 유도한다[2, 11].

선천 면역 체계에서 필수적인 역할을 하는 대식세포(macrophages)는 감염 및 암의 공격 방어에 중요한 역할을 하며[20], 활성화된 대식세포(M1)는 interferon γ (IFN-γ), interleukin-1β (IL-1β) 또는 박테리아 독소인 지질과 다당류로 구성된 lipopolysaccharide (LPS) 등에 의해 극성화되는 반면, IL-4 및 IL-13에 의한 대식세포의 활성화(M2)는 면역 반응을 억제한[19, 34]. 활성화된 대식세포의 가장 기본적인 기능은 식균 작용(phagocytosis)이다, 이는 포획된 침입자를 중화시키기 위한 과정이며, 침입자의 항원 조각이 T helper 및 B 세포와 같은 다른 면역 세포에 제시되어 면역 반응을 더욱 강화할 수 있도록 한다[18]. 또한, 대식세포는 면역 캐스케이드(immune cascade)를 활성화하기 위하여 nitric oxide (NO), prostaglandins과 같은 면역 매개체와 cytokine의 생성에 관여한다[5, 30].

최근 면역 반응에서 산화 환원 조절 기전의 중요성이 크게 대두되고 있다[24]. 이는 면역 반응 동안 동반되는 대사 재프로그래밍(metabolic reprogramming)은 과도한 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성을 유도하기 때문이다. 특히 증가된 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADH) 산화효소 유래 ROS는 대부분 산화 스트레스의 원인이 되며, 이는 면역 세포의 기능적 변화에 기여할 수 있다[29]. 특히 면역 유도 반응에 필수적인 면역 매개체와 cytokine 생성의 상위 조절인자인 nuclear factor (NF-κB), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT) 및 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 등을 포함하는 세포 내 신호 전달계가 이러한 대사 및 산화-환원 변화에 의하여 조절되고 있기 때문이다[10, 25, 28]. 이는 산화적 스트레스의 억제제가 면역 반응의 증가와 밀접한 연관성을 가진다는 선행 연구에서 잘 입증되고 있다[14, 27, 40].

Glutamic acid, cysteine 및 glycine으로 이루어진 glutathione (GSH)은 식물, 동물뿐만 아니라 균류 일부 박테리아나 고세균 등에서 광범위하게 작용하는 항산화제이다. 생체 내에서 활성형인 환원형 GSH (reduced GSH 또는 L-glutathione)은 산화성 자유 라디칼(free radical)을 무력화시켜 비활성인 산화형 GSH (oxidized glutathione, GSSG)로 변하면서 세포 내 구성요소의 산화적 손상 방어에 핵심적인 역할을 한다[8, 36]. 산화적 스트레스 감소에 의한 산화 환원 균형 유지 이외에, GSH의 기능으로는 대사 해독 강화, 항노화 및 면역 체계 기능 조절을 포함한다. 따라서, 건강 증진 및 다양한 질병 예방을 위한 전략으로 GSH 수치를 최적화하는 것이 주요하다고 인식되지만, 인과 관계는 아직 명확하지 않다[8, 22]. 그럼에도 불구하고, 체내 환원형 GSH의 흡수율을 상승시키기 위하여 지질 내부에 GSH 분자를 캡슐화시킨 다양한 유형의 GSH (liposomal GSH) [17, 31]가 널리 시판되고 있다. 따라서 본 연구에서는 환원형 GSH의 면역 활성과 작용기전 및 이와 연관된 새로운 면역증강 표적 유전자의 발굴을 시도하였다. 이를 위하여 in vitro 면역 조절 연구 모델로 가장 널리 사용되는 RAW 264.7 대식세포(murine macrophage RAW 264.7 cells)를 사용하였으며, 대조군으로 LPS를 처리하였다.

재료 및 방법

세포 배양 및 luthione의 처리

RAW 264.7 대식세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Republic of Korea)에서 분양받았으며, 10%의 fetal bovine serum와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)가 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, WelGENE Inc., Gyeongsan, Republic of Korea)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 환원형 GSH인 luthione^®은 ㈜대한뉴팜(DaehanNewPharm. Co., Ltd., Seoul, Republic of Korea)에서 제공받았고, 양성 대조군으로 사용한 LPS는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Luthione과 LPS를 세포에 처리하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co.)에 녹여 stock solution을 만든 후, DMEM에 적정 농도로 희석하여 처리하였다.

RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 luthione과 LPS의 영향

RAW 264.7 세포를 96-well plates에 well 당 1×10⁴개의 밀도로 분주하여 24시간 배양 후, luthione과 LPS를 각각 24시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 후, 10 μl의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약(5 mg/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 각 well에 첨가하였다. 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 100 μl의 DMSO를 처리하여 형성된 formazan crystal을 10분 동안 용해시킨 후, well 당 흡광도를 microplate reader를 사용하여 540 nm에서 측정하였다. Luthione과 LPS 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율은 대조군과 비교하여 백분율로 제시하였다.

식세포 활성(phagocytic activity)의 분석

Luthione 및 LPS가 함유된 배지에서 24시간 배양된 RAW 264.7 세포의 식세포 활성은 Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)에서 구입한 Vybrant™ Phagocytosis Assay Kit를 이용하여 분석하였다. 이를 위하여 제조사의 지침에 따라 4-well chamber slide (SPL Life Sciences Co., Pocheon, Republic of Korea)에서 배양 및 처리된 세포에 형광 표지된 Latex Beads-Rabbit IgG-FITC complex를 각 well에 첨가하여 반응시켰다. 2시간 동안 반응 후, assay buffer로 세포를 수세하고 세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 식작용이 일어난 세포의 형광 강도를 정량적으로 측정하였다. 아울러 assay buffer로 세척된 세포를 40 μM의 4‘,6’-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액으로 염색 후, 세포를 cover glass에 도말하였다. phosphate buffered saline로 다시 세포를 수세 후, 형광 강도를 형광현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 관찰하였다.

Cytokine profiling

Luthione 및 LPS 처리에 따른 cytokine의 상대적인 발현 수준 차이를 조사하기 위하여 R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 Mouse Cytokine Array Kit를 사용하였다. 이를 위하여 luthione과 LPS를 24시간 동안 처리 후 세포 배양액을 수거하여 1시간 동안 40개의 서로 다른 cytokine 항체를 포함하는 nitrocellulose membrane과 반응시켰다. Membrane을 세척하고 제조사의 지침에 따라 streptavidin-horseradish peroxidase (HRP)를 30분 동안 반응시키고 화학발광 검출(chemiluminescent detection)을 시도하였다. Membrane에서의 면역 반응성 반점(immune-reactive spots)은 Fusion FX Image system (Vilber Lourmat, Torcy, France)으로 시각화하였으며, 반점의 정량 분석은 ImageJ^® software (version 1.50i; NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다.

NO, prostaglandin E₂ (PGE₂), tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-1β 및 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 생성량의 정량적 분석

NO의 생성에 미치는 luthione과 LPS의 영향을 조사하기 위하여 Griess 방법을 적용하였다. 이를 위하여 수거된 세포 배양액을 동량의 Griess reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.)와 혼합 후 15분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양 상층액의 PGE₂, TNF-α, IL-1β 및 MCP-1 농도는 Cytokine Detection Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (R&D Systems, Inc.)를 이용하여 450 nm의 흡광도에서 제조사의 지침에 준하여 측정하였다.

단백질의 분리 및 Western blot analysis

Luthione 및 LPS가 함유된 배지에서 24시간 동안 배양된 세포들을 모아 PRO-PREPTM Protein Extraction Solution 및 quantified using protein assay reagent (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Republic of Korea)를 이용하여 총 단백질을 분리하고 정량화하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용한 전기영동으로 분리시킨 후, polyvinylidene fluoride membrane (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시켰다. 5% non-fat skim milk 용액에 1시간 동안 membrane을 반응시킨 후, 검출 대상 단백질(iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, Arg-1 및 CD86)에 대한 1차 항체를 2시간 이상 처리하고, 1차 항체에 적절한 2차 항체(HRP-conjugated antibodies)에 1시간 이상 반응시켰다. 각 단백질의 발현은 Enhanced Chemiluminescence Kit (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK) 및 Fusion FX Image system을 이용하여 시각화하였다. 본 연구에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA), Abcam Inc. (Cambridge, UK) 및 BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다.

nCounter 유전자 발현 분석

Luthione 및 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 전사 수준에서의 TLRs, adhesion markers 및 cytokine 신호계 조절인자들의 발현을 조사하기 위해 nCounter Sprint platform (NanoString Technologies, Inc. Seattle, WA, USA)을 이용한 nCounter in-solution hybridization을 적용하였다. 이를 위하여 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분리된 mRNA와 reporter-capture probe pair와 hybridization 후, 비 반응성 probe를 제거하였다. 형성된 probe-target complex를 nCounter cartridge (NCT-120)에 정렬하고 고정화 후 Digital analyzer를 이용하여 이미지 수집 및 데이터 처리를 수행하였으며, 유전자 발현 변화는 heatmap으로 나타내었다. Heatmap은 fold-change cutoof 0.5 및 2(각각 빨간색 및 녹색)를 사용하여 RNA sequencing 분석에 의한 차등적으로 발현된 유전자를 나타내었으며, 대조군 세포와 비교하여 log-2배 변화 값으로 표현하였다.

통계 분석

평균 및 표준 편차(standard deviation, SD)는 Graphpad Prism (Version 5, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 그룹 간의 차이를 비교하기 위하여 One-way analysis of variance에 이어 Tukey’s multiple comparison test를 수행하였으며, p<0.05, p<0.01 및 p<0.001의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

RAW 264.7 세포의 증식 및 식세포 활성에 미치는 luthione의 영향

Luthione이 RAW 264.7 세포에서 면역 활성에 미치는 영향을 조사하기 위한 조건의 설정을 위하여 다양한 농도의 luthione을 24시간 동안 처리한 후, MTT assay를 실시하였다. Fig. 1A에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 본 연구에서 설정된 범위의 luthione 처리 조건(20, 40 및 60 μg/ml)에서는 대조군과 비교하여 유의적인 세포 생존율의 저하 현상이 관찰되지 않았다. 그리고 선행연구 결과에 준하여[13, 16] 양성 대조군으로 사용된 LPS 처리 농도의 경우, 1 ng/ml로 설정하여 24시간 처리하였으며, 유의적인 세포독성이 없음을 확인하였다. 따라서 RAW 264.7 세포에서 luthione의 면역 활성을 평가하기 위하여 LPS 처리 농도는 1 ng/ml로, luthione 처리 농도는 최고 60 μg/ml로 설정하였다.

Fig. 1. Enhancement of phagocytosis by luthione in RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentration of luthione or LPS for 24 hr. (A) The cell viability was measured by the MTT assay. (B-E) Phagocytosis activity was quantified by flow cytometry (B and C) or visualized by fluorescence microscopy (D and E). (B) Representative histograms by flow cytometric analysis were presented. (C) Flow cytometry results from three independent experiments were calculated as the average value. (D) Representative images observed under a fluorescence microscope were presented. (E) The number of cells exhibiting fluorescence intensity was expressed as the number of phagocytes per field of view. (A, B and D) Statistical analysis from three independent experiments was performed using analysis of variance between groups ( **p<0.01 and ***p<0.001 when compared to control).

다음은 luthione이 RAW 264.7 세포에서 대식세포의 대표적인 기능인 식세포 활성[18]을 증가시키는지를 평가하였다. 이를 위하여 유세포 분석기를 이용한 latex beads의 탐식능을 조사하였다(Fig. 1B, Fig. 1C). 제시된 결과에서 알 수 있듯이, luthione의 처리 농도의 증가할수록 식세포 활성이 증가하였으며, 40 μg/ml의 luthione 처리군에서 대조군으로 사용된 1 ng/ml의 LPS 처리군과 유사하였다[16, 23, 33]. 또한, 형광현미경 하에서 탐식된 latex beads의 녹생 형광 강도가 핵 내에서 LPS 뿐만 아니라 luthione 처리군에서도 강하게 발현되었다(Fig. 1D, Fig. 1E). 그러나 LPS와 luthione이 동시에 처리된 조건에서는 시너지효과가 관찰되지는 않았다(data not shown). 이는 luthione의 처리에 의하여 RAW 264.7 세포가 대식세포로의 분화 및 활성이 증가되었음을 나타내는 직접적인 증거이다.

RAW 264.7 세포에서 cytokine, chemokine 및 면역 매개체의 생성과 발현에 미치는 luthione의 영향

Luthione이 처리된 RAW 264.7 세포에서 cytokine의 발현 변화를 조사하기 위하여 30 및 60 μg/ml의 luthione을 24시간 처리 후 cytokine array를 실시하였으며 검출된 면역 반응성 반점들의 정량적 수치를 산출하였다. Fig. 2에 나타낸 바와 같이, luthione의 처리군에서는 대조군에 비하여 IL-5, IL-1β 및 IL-27의 발현이 유의적으로 증가하였으며, 양성 대조군으로 LPS가 처리된 세포에서도 유사한 경향성을 보여주었다. 그러나 IL-6의 발현은 고농도 처리군(60 μg/ml)에서 유의적으로 감소하였으며, IL-7은 저농도 처리군(30 μg/ml)에서 다소 증가하여 처리 농도에 따른 차이를 보였다.

Fig. 2. Results of protein array analysis showing effect of luthione on cytokine profile in RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 cells were treated with different concentration of luthione or 1 ng/ml LPS for 24 hr. After treatment, cell culture supernatants were collected and analyzed using the cytokine array kit. (A) The spots with the most prominent differentially regulated ILs were identified by circles and marked with squares. (B) ImageJ^® software was used for quantitative analysis of each IL ( *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 when compared to control).

Cytokine array 결과에서 관찰된 luthione의 처리에 의한 cytokine의 발현 변화에 대한 추가적인 결과를 도출하기 위하여 ELISA kit를 이용하여 TNF-α, IL-1β 및 MCP-1의 생성량의 변화를 평가하였다. Fig. 3에 제시한 바와 같이, IL-1β의 농도가 luthione 처리 농도 의존적으로 증가하여 cytokine array의 결과가 재현되었음을 알 수 있었고, TNF-α 및 MCP-1의 생성 또한 LPS 처리군에서와 유사하게 유의적으로 증가하였다(Fig. 3A - Fig. 3C). 아울러 Western blot 분석을 통하여 TNF-α 및 IL-1β의 생성 증가는 그들의 단백질 발현 상승에 의한 것임을 확인하였다(Fig. 4).

Fig. 3. Effects of luthione on the production of TNF-α, IL-1β, MCP-1, NO and PGE₂ in RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 cells were treated with luthione of 20 μg/ml to 60 μg/ml or 1 ng/ml LPS for 24 hr. (A-C and E) Using the culture supernatant, the amounts of TNF-α (A), IL-1β (B), MCP-1 (C) and PGE₂ (E) were measured with ELIAS kits. (D) The amount of NO in the culture supernatant was determined using Griess reagent. Results were expressed as the mean ± SD of three independent experiments ( *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 when compared to control).

Fig. 4. Effects of luthione on the expression of immunomodulation-related proteins in RAW 264.7 macrophages. (A) After treatment with the concentrations of luthione or LPS for 24 hr, total protein was isolated, and then Western blot analysis was performed using the antibody of each protein presented. (B) Relative band density was measured by ImageJ^® software ( *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 when compared to control).

다음은 면역 매개체로 분류는 NO와 PGE₂ [5, 30]의 생성에 미치는 luthione의 영향을 평가하기 위하여 RAW 264.7 세포에 luthione에 24시간 처리 후 세포 배양액을 이용하여 Griess reagent 반응 및 ELISA를 실시하였다(Fig. 3D, Fig. 3E). 제시된 결과에서 알 수 있듯이, luthione의 처리 농도 증가에 따라 NO와 PGE₂의 생성이 유의적으로 증가되었으며, 60 μg/ml의 luthione 처리군에서는 1 ng/ml의 LPS 처리군에 비하여 더욱 높게 나타났다. 이러한 NO와 PGE₂의 생성 증가는 cyclooxygenase-2 (COX-2) 및 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현의 증가와 연관성이 있었다(Fig. 4). 아울러 LPS 처리군에서도 TNF-α 및 IL-1β와 유사하게 이들 단백질의 발현이 다소 증가하였다.

RAW 264.7 세포에서 대식세포 분극 인자의 발현에 미치는 luthione의 영향

대식세포는 외부 신호에 대응하여 M1 또는 M2형으로 분극화가 일어나기 때문에[19, 34], 이상에서 관찰된 luthione 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 반응이 분극화와 직접 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 M1형 대식세포의 대표적인 표현형 마크인 cluster of differentiation 86 (CD86 또는 B7-2)과 M2형 마크인 arginase-1 (Arg-1)의 발현[6, 41]에 미치는 luthione의 영향을 조사하였다. Fig. 4의 Western blot 분석의 결과에서 알 수 있듯이, luthione의 처리 농도 증가에 따라 CD86의 발현이 유의적으로 증가하였으며, 양성 대조군인 LPS 처리군에서도 유사하게 증가하였다. 그러나 Arg-1의 발현은 유의적인 변화가 없었으며, LPS 처리군에서는 다소 감소되었다. CD86은 CD80과 함께 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 보조 자극 신호를 제공하는 항원 제시 세포(antigen-presenting cells)에서 발현되는 단백질이다[32, 35]. 따라서 본 연구의 결과는 luthione의 대식세포의 활성화 유도에는 CD86의 활성화가 최소한 관여하며, LPS 처리군에서와 유사하게 NF-κB, PI3K/Akt 및 MAPKs 신호계의 경로를 포함한 M1 극성화 경로의 활성화에 의한 것이라 추정된다[10, 25, 29].

RAW 264.7 세포에서 luthione의 표적 매개 세포 신호 전달계의 탐색

이미 잘 알려진 바와 같이 LPS는 toll-like receptor (TLR)/NF-κB 신호 경로의 활성화를 통하여 단핵구를 대식세포로 활성화시킨다[7, 37]. 그러나 최근 TLR4와 NF-κB 이외에 대식세포의 활성화에 관여하는 다수의 전사 인자 및 세포 내 신호계의 역할이 밝혀지고 있으며, 이들은 대식 세포 분극에도 관여하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 luthione에 의한 대식세포의 활성화에 관여하는 새로운 표적 신호계의 발굴을 위하여 유전자 발현 프로파일링을 보여주는 heatmap 분석을 시도하였다. 조사된 TLRs 및 신호전달계를 포함한 유전자 중에서 luthione에 의하여 감소(파란색)하였거나 증가(붉은색)된 유전자를 Fig. 5A에 제시하였으며, 2배 이상 증가된 유전자를 Fig. 5B에 나타내었다. 제시된 결과에서 알 수 있듯이, TLRs 중에서 luthione에 의하여 TLR4의 발현도 증가하였지만, TLR3의 발현이 가장 높게 증가하였으며, cytokine signaling (SOCS)1 및 SOCS3 또한 LPS 처리군과 유사하게 증가하였다. 그리고 signal transducer and activator of transcription (STAT) 계열 인자 중에서는 STAT2 및 STAT3가 가장 높게 증가하였으며, Janus tyrosine kinase (JAK) 또한 LPS 뿐만 아니라 luthione 처리에 의하여 유의적으로 증가되었다.

Fig. 5. Effects of luthione on the transcriptional activity of TLRs, adhesion markers and cytokine signaling regulators in RAW 264.7 macrophages. (A) Heatmap results of gene expression using NanoString nCounter^® miRNA expression analysis in RAW 264.7 cells treated with luthione or LPS were presented. For this experiment, total RNA was isolated cells treated with luthione or LPS for 24 hr and hybridization was performed using reporter probe and capture probe. (B) Expression of each gene was indicated as fold change compared to the control.

염증 관련 감염에서 면역 조절 역할을 하는 것으로 밝혀진 SOCS 단백질 계열의 분자는 cytokine 신호 전달의 조절자로서 중요한 역할을 하며, 그들은 T-helper type 1(Th1)-Th2 세포 균형을 조절하고 Th2 유발 염증을 감소시킨다[9, 12]. 그중, SOCS1은 TLR의 자극에 따라 강력하게 유도되는 염증의 음성 조절자로이며, SOCS3와 함께 NF-κB의 p65 subunit과의 직접적인 상호작용을 통해 TLR-유도 NF-κB 및 JAK-STAT 신호계의 조절에도 관여한다[3, 39]. 또한, SOCS3는 Th2 매개 알레르기 반응의 조절에 유익한 역할을 하며, 이는 SOCS3가 천식 및 알츠하이머병을 포함한 다양한 면역 질환의 치료 및 예방에 잠재적인 표적이 될 수 있음을 암시한다[4]. 이미 잘 알려진 바와 같이, JAK/STAT 경로는 수많은 cytokine 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 성장 호르몬(growth hormone), 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor)와 IFN 등을 포함한 성장 인자의 생산을 위한 고전적인 신호 전달 경로(classical signal transduction pathway)에 해당한다[15, 26]. 면역 반응 과정에서 STAT는 JAK의 다운스트림 표적(downstream targets) 중의 하나이다. STAT는 JAK의 cytokine 자극에 의해 인산화되고 핵으로 전위되어 표적 유전자의 발현을 조절한다[38]. 비록 SOCS 단백질 계열들이 면역계에서 상이적인 역할을 할 수도 있지만[1, 39], 본 연구의 결과는 SOCS1/3이 JAK-STAT 신호계와 함께 luthione의 면역 증강 작용에 관여하며, 이는 NF-κB와 함께 광범위한 세포 내 신호계의 조절을 통하여 이루어짐을 시사한다.

본 연구에서는 RAW 264.7 세포에서 환원형 GSH인 luthione의 면역증강 효능을 평가하였다. 본 연구의 결과에 의하면, luthione이 처리된 RAW 264.7 세포의 식세포 활성이 현저하게 증가되어 대식세포로의 분화가 유도되었음을 보여주었다. 이 과정에서 다수의 cytokine 및 chemokine과 면역 매개체 생성의 증가가 동반되었으며, 대표적인 M1형 대식세포의 표현형 마크의 발현 또한 증가되었다. 아울러, luthione의 면역 조절을 위한 표적 유전자로서 SOCS 매개 JAK/STAT 경로의 활성화가 관여하고 있음을 제시하였다(Fig. 6). 본 연구의 결과는 in vivo 모델에서의 luthione의 면역 증가 효능 평가와 함께 새로운 기전 연구의 수행을 위한 기초 자료로서 활용될 것이다.

Fig. 6. Schematic diagram showing the activation of macrophages by luthione.

감사의 글

본 연구는 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단에서 시행한 기초연구사업 지원(No. 2021R1A2C200954911)에 의해 수행되었습니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.