The Effects of 8-week Ketone Body Supplementation on Endurance Exercise Performance and Autophagy in the Skeletal Muscle of Mice

8주 케톤체 투여가 마우스 지구성 운동수행능력과 골격근의 자가포식에 미치는 영향

Abstract

The purpose of this study was to investigate the effects of 8-week β-hydroxybutyrate (β-HB) administration with and without endurance exercise training on endurance exercise performance and skeletal muscle protein synthesis and degradation using a mouse model. Forty-eight male wild-type ICR mice (8 weeks old) were randomly divided into four groups: sedentary control (Sed+Con), (Sed+Con), sedentary β-HB (Sed+β-HB), exercise control (Exe+Con), and exercise β-HB (Exe+β-HB). β-HB was dissolved in PBS (150 mg/ml) and injected subcutaneously daily (250 mg/kg) for 8 weeks. Mice performed 5 days/week of a 20 min treadmill running exercise for 8 weeks. The running exercise was carried out at a speed of 10 m/min at a 10° incline for 5 min, and then the speed was increased by 1 m/min for every 1 min of the remaining 15 min. Following 8 weeks of treatments, visceral fat mass and skeletal muscle mass, blood parameters, and the markers for autophagy and protein synthesis were analyzed. The data were analyzed with one-way ANOVA (p<0.05) using the SPSS 21 program. Eight weeks of Exe+β-HB treatment significantly lowered blood lactate levels compared with the other three groups (Sed+Con, Sed+β-HB, and Exe+β-HB) Exe+β-HB) (p<0.05). Eight weeks of Exe+β-HB significantly increased maximal running time (time to exhaustion) compared with the Sed+Con and Exe+Con groups (p<0.05). Eight weeks of β-HB administration significantly decreased autophagy flux and autophagy-related proteins in the skeletal muscle of mice (p<0.05). Conversely, the combined treatment of β-HB and endurance exercise training increased protein synthesis (mTOR signaling and translation) (p<0.05). The 8-week β-HB treatment and endurance exercise training had synergistic effects on the increase in endurance performance, increase in protein synthesis, and decrease in protein degradation in the skeletal muscle of mice.

마우스 모델을 사용하여, 8주 케톤체(베타-하이드록시뷰티레이트, β-HB)가 지구성 운동 수행능력과 골격근의 단백질 합성 및 분해에 미치는 영향을 조사하였다. 48마리의 수컷 ICR 마우스(8주령)를 무작위로 4개 그룹으로 나누었다: 비운동 통제군(Sed+Con), 비운동+베타-하이드록시뷰티레이트(Sed+β-HB), 운동 통제군(Exe+Con), 운동+베타-하이드록시뷰티레이트(Exe+β-.HB). β-HB 투여를 위해 β-HB를 PBS (150 mg/mL)에 용해시켜 8주 동안 매일 피하 주사(250 mg/kg)하였다. 운동 훈련을 위해 마우스는 8주 동안 20분 트레드밀 달리기 운동 훈련을 주 5일 수행하였다. 훈련은 10° 경사도에서 10 m/min 속도에서 5 min 동안 실시하고 나서, 매 1 min 마다 1 m/min의 속도를 나머지 15 min 동안 증가시켰다. 8주간의 처치 후, 내장 지방량과 골격근량, 혈액 매개변수, 자가포식 및 단백질 합성 마커가 분석되었다. 데이터는 SPSS 21 프로그램을 사용하여 ANOVA (p<0.05)로 분석되었다. Exe+β-HB 그룹의 혈중 젖산 수치는 모든 3개 그룹(Sed+Con, Sed+β-HB 및 Exe+β-HB)보다 유의하게 낮았다(p<0.05). Sed+Con 및 Exe+Con 그룹에 비해, 8주 Exe+β-HB 처치는 최대 달리기 수행 시간(탈진 시간)을 유의하게 증가시켰다(p<0.05). 8주 β-HB 투여는 마우스의 골격근에서 자가포식 유동과 자가포식 관련 단백질을 유의하게 감소시켰다(p<0.05). 반대로, β-HB와 지구력 운동 훈련의 조합된 처치는 단백질 합성(mTOR 신호 및 번역 속도)을 증가시켰다(p<0.05). 8주간의 β-HB 처치와 지구력 운동 훈련은 마우스 골격근에서 지구력 수행능력 증가, 단백질 합성 증가, 단백질 분해 감소 효과를 보여주었다.

서론

케톤체(ketone bodies)는 지질에서 유래한 유기 화합물로, 기아 또는 단식, 장시간 운동 중 조직의 순환에너지원으로 작용할 수 있다[16]. 에너지 결핍 상태에서, 지방산에서 유래된 아세틸-CoA (acetyl-CoA)의 일부는 간의 미토콘드리아에서 3단계의 효소 작용에 의해 케톤체로 전환된다(최대 ~150 g/day)[24]. 생성된 케톤체 아세토아세테이트(acetoacetate, AcAc)는 이후 효소 작용에 의해 베타-하이드록시뷰티레이트(beta-hydroxybutyrate, β-HB)로 전환되거나 훨씬 적은 양이지만 아세톤(acetone)으로 분해된다[16]. AcAc와 β-HB는 혈류를 통해 간이 아닌 다른 조직 즉, 뇌, 심장, 골격근과 같은 대사 요구가 높은 조직 세포의 미토콘드리아로 운반된 후, 다시 아세틸-CoA로 전환되어 구연산 회로(Kreb’s cycle)에 의해 대체 에너지원으로 사용된다[16]. 대체 에너지 기질 역할을 하는 것외에도, 케톤체는 골격근 기질 이용의 조절, 세포 내 신호 전달(signal transduction)과 전사 조절(transcriptional regulation)을 하는 중요한 역할을 한다[17].

에너지 능력 증진을 위한 탄수화물 로딩(carbohydrate loading) 식이요법이 오랫동안 운동선수들에게 권고되어 왔었다. 탄수화물 로딩은 골격근에 더 많은 연료(글리코겐)를 저장시켜 지구력 운동능력을 향상시킬 수 있다. 반면, 케톤 다이어트(ketogenic diet)로 불리는 고지방저탄수화물 식단(high-fat carbohydrate-restricted diet)이 지구력 운동선수들에게 유익할 수 있다는 연구들이 최근에 보고되었다[3, 20]. 그 근거는 케톤 식단이 운동 중 지방 산화를 증가시켜 케톤체 생성을 높이고 뇌와 골격근에 추가적인 에너지 기질을 제공하며 근육이나 간의 제한된 글리코겐 저장을 유지시키는데 도움이 될 수 있다는 주장이다. 최근 고지방 탄수화물 제한 식단과 같은 방법이 아닌 케톤체 보충제가 케톤증(ketosis)을 유도하는 대안 전략으로 떠오르고 있다. 한 연구에서 통제 그룹(총 칼로리의 60% glucose만 섭취)과 비교하여 케톤을 투여한 그룹(573 mg/kg 체중의 ketone-ester+glucose 투여)은 30분 사이클 테스트에서 ~2% 수행능력 향상과 ~50%의 감소된 혈중 젖산 농도를 보여주었다[3]. 연구자들은 이 결과를 운동 중 해당 과정(glycolysis) 사용의 감소와 지방대사(β-oxidation)의 증가에 의한 것이라고 하였다. 반면 다른 연구에서 엘리트 사이클 선수들을 대상으로 AcAc-diester를 투여하고 31-km 사이클링을 측정한 후 통제 그룹과 비교했을 때, 반대로 2%의 수행능력 감소, 3.7%의 근파워 감소를 보여 주었다[11]. Cox P, et al. [3] 연구와 마찬가지로 이 연구에서도, 케톤체 투여가 테스트 후 측정한 혈중 젖산을 35% 감소시켰다. 이 두 연구의 결과로 보아, 경기력과 상관없이 케톤체 투여가 운동 중 지방대사를 증가시키고 글루코스 사용을 감소시켰을 것으로 보인다. 케톤체 투여에 의한 운동 중 에너지 대사의 변화는 이론적으로 지구력 운동능력 향상에 도움을 줄 수 있는 조건이라고 할 수 있지만 현재 그 효과는 명확히 밝혀져 있지 않다. 또한 지속적인 케톤체 투여에 의해 적응된 골격근에서 단백질 대사에 관여하는 조절 기전에 대해서는 거의 연구되어 있지 않다.

세포 내 단백질 합성은 성장인자, 호르몬 등의 여러 요인들에 의해 mTOR로 이어지는 신호 전달 경로를 촉진시켜 증가된다[4]. mTOR는 PI3K와 관련된 단백질 인산화 효소군에 속하는 serine/threonine kinase로써 세포의 성장, 증식, 이동과 생존은 물론, 단백질 합성을 조절하는데 중요한 역할을 하고 있으며 골격근에서는 근육세포의 분화와 융합을 조절하고 새로운 근섬유를 형성하여 근육의 크기를 증가시키는 것으로 알려져 있다[5]. 반면, 골격근은 크게 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)과 자가포식(autophagy)의 2가지 단백질 분해 경로를 갖고 있다. 자가포식은 self-eating이라는 뜻으로 세포 내부에 필요 없는 물질이나 세포소기관을 이중막인 자가포식체(autophagosome)로 둘러싸서 리소솜(lysosome)에서 분해하며 세포의 항상성을 유지하고 대사 스트레스를 감소시키는 이화작용이다. 또한 다양한 조직에서 개체 발생, 세포분화 또는 조직 재형성을 조절한다[13]. 자가포식은 30개 이상의 autophagy-related genes (Atgs)에 의해 통제되고 조절되며, ATG12-ATG5 complex, Beclin-1/Atg6, LC3 (microtubule-associated protein1 light chains 3)는 초기 자가포식체막(autophagosomal membrane)의 형성에 관여하는 필수적인 단백질이다[27]. 자가포식이 유도되면 세포질에 있는 용해성 LC3-I이 자가포식소체의 세포막에 부착된 형태인 LC3-II의 형태로 전환된다. 자가포식이 활성화되면 LC3-II의 단백질 발현이 증가되고 자가포식에 의해 분해 또한 증가되기 때문에 자가포식의 유동(flux)을 측정하는데 중요한 지표로 이용된다.

현재 지속적인 케톤체 투여가 골격근의 단백질 합성과 단백질 분해 시스템 중의 하나인 자가포식에 미치는 효과에 대해 충분히 연구되어 있지 않다. 한 연구에서 글루코스를 결핍시켜 세포사멸을 유도시킨 신경세포에서 β-HB 처치는 자가포식을 활성화시켰다[1]. 하지만 다른 연구에서 랫에 β-HB를 주입했을 때, 뇌의 선조체(striatum) 조직에서 β-HB의 자가포식에 미치는 효과는 나타나지 않았다[14]. 최근 한 연구는 β-HB 투여가 당뇨 마우스의 망막의 자가포식을 감소시켰다[23]고 보고하였다. 현재 자가포식에 대한 β-HB의 효과는 불일치한 결과를 보여주며 이에 대한 연구가 필요할 것 같다. 또한, 훈련된 골격근에서 자가포식에 대한 β-HB의 효과는 현재 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 마우스 모델을 사용하여 β-HB를 지속적으로 투여하여 케톤증을 유발시키고 지구성 달리기 훈련을 병행한 후, 이에 적응된 동물들의 (1) 지구성 운동능력과 피로 물질의 변화를 평가하고, (2) 골격근에서 단백질 합성, 즉 단백질 번역(protein translation) 과정, (3) 자가포식에 미치는 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

실험동물

본 연구에서 사용된 실험동물은 생후 8 주령 male ICR 마우스(샘타코) 48마리로 1주간의 적응기를 마친 후, 각각 12마리씩 무작위로 임의 배정되었다. 초기 동물 그룹은다음과 같이 구분하였다: Sedentary+control (Sed+Con, n=12); Sedentary+β-HB, (Sed+β-HB, n=12); Exercise+control (Exe+Con, n=12); Exercise+β-HB (Exe+β-HB, n=12). 사육실의 온도는 22°C, 습도는 약 50%, 명암은 12시간 주기로 조절하였다. 사료와 물은 충분히 공급하고, 실험동물 취급법에 따라 실험하였으며, 수원대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실시하였다(승인번호 USW-IACUC-2020-004).

β-HB 처치와 지구성 운동훈련 프로그램

β-HB는 150 mg/ml의 농도로 PBS에 용해되어(pH 7.5), 250 mg/kg의 투여량으로 피하주사를 통해 마우스 등 부위에 매일 한차례, 8주 동안 투여되었다[26]. 통제 그룹 또한 같은 용량의 PBS가 주사되었다(Fig. 1A). 지구성 운동훈련 프로그램은 선행연구에서 실시되었던 방법을 활용하여 실시하였다[2]. 8주 실험 기간 동안 동물들은 전동 트레드밀 위에서 1주일에 5일(월, 화, 수, 목, 금) 훈련받았다. 훈련은 10° 경사도에서 10 m/min 속도에서 5 min 동안 실시하고 나서, 매 1 min 마다 1 m/min의 속도를 나머지15 min 동안 증가시켰다. 마지막 20분에서 동물들은 25 m/min의 속도로 달렸다.

Fig. 1. Procedures of experiments (A) and Experimental design of in vivo autophagic flux assay (B).

체중과 음식물 섭취량

체중은 1주일에 한 차례 측정하여 각 그룹의 평균값을 구하였다. 음식은 1주일에 두 차례 주었고 음식을 주기 전에 매번 무게를 기록하였고 다음 번 음식을 주기 전에 남아있는 음식 무게를 측정하여 동물 한 마리 당 그리고 매일 음식섭취량(daily food consumption)을 산출하였다.

조직 채취 및 혈액 분석

모든 그룹의 동물들은 CO₂ 흡입 마취 후 골격근(전경골근, 비복근 외)과 내장 지방(visceral fat)이 채취되었고, 채취된 조직들은 분석 전까지 -80℃에서 보관되었다. 내장 지방은 오른쪽과 왼쪽의 부고환(epididymal) 부위의 지방을 채취하여 무게가 측정되었다. 혈액은 희생시키기 전 꼬리의 끝 부분을 절단 후 정맥혈이 채취되었다. 동물을 12시간의 금식 후, 희생시키기 전 각 동물마다 혈액을 꼬리 정맥에서 채취하여 Accutrend Plus (Roche Diagnostics, Switzerland) 분석기를 사용하여 혈액 글루코스(glucose, mg/dL), 중성지방(triglycerides, mg/dL), 총 콜레스테롤(total cholesterol, mg/dL), 젖산염(lactate, mmol/L) 농도를 측정하였다.

지구력 평가

지구력 평가는 2주에 한 번씩(총 4회) 실시하였다. 지구력 달리기는 10°의 경사에서 처음 5 min 동안 10 m/min의 속도에서 시작하여 스피드가 점차적으로 증가되어 속도는 매 1 min 마다 1 m/min씩 증가시켜 15 min 동안 지속되었다. 동물들은 20 min이 지나고 나서 25 m/min의 속도를 유지하며 탈진될 때까지 달리기 운동을 하였다. 동물의 탈진은 연구자가 브러쉬로 쿡 찔러도 동물들이 20초 동안 전기충격 grid (1.5 mA, 150 V)에서 벗어나지 못하고 머물러 있는 경우로 설정하였다. 탈진된 동물들은 트레드밀에서 제거되어 전체 달리기 시간이 기록되었고 나중에 달리기 거리가 산출되었다.

SUnSET assay

골격근의 단백질 합성은 in vivo SUnSET (surface sensing of translation) 방법으로 측정되었다[7]. 단백질 합성률은 흔히 방사능 동위원소 추적자(radioactive isotopic tracers, eg., ³H-phenylalanine, ³⁵S-methionine, ¹⁵N-lysine, ¹³C-leucine 등)를 사용하여 레이블된 아미노산이 얼마나 많이근육 단백질에 통합되어 단백질로 변화는 가를 수량화하는 방법을 통해 측정되어 왔다. SUnSET assay는 최근에개발된 비방사성 비동위원소(puromycin)를 이용하는 in vivo에서 단백질 합성률을 Western blot 방식으로 측정할수 있는 기술이다. 먼저, 동물 마취를 시킨 후, 0.02 M PBS 용액에 용해된 puromycin을 동물 체중 1 g당 0.04 μmole을I.P.로 주사된 후 골격근 조직은 정확히 15분 후에 적출되었다. 나머지 과정은 Western blot 방법과 동일하며 조직세포의 단백질 합성은 mouse monoclonal anti-puromycin 항체(cat#MABE343, Millipore)를 사용하여 분석되었다.

In vivo autophagy flux assay

지구성 운동이 마우스 골격근의 자가포식 유동을 변화시키는 가를 조사하기 위해, in vitro autophagy flux assay를 동물모델에 적용시켜 개발된 “in vivo autophagometer” 방법을 사용하였다[8]. 미세소관 중합억제제(microtubule depolymerizing agent)인 colchicine (Col, 0.4 mg/kg/day, Sigma-Aldrich, #C9754)을 처치하는 그룹과 처치하지 않는 그룹을 포함시켜 LC3-II를 Western blot으로 측정하였다. 골격근에서 in vivo autophagy의 변화를 측정하기 위해 쥐를 희생시키기 전 이틀 동안 colchicine i.p.주사 그룹과 saline i.p. 주사 그룹을 포함시킨 총 8개의 그룹(n=6)을 적용시켰다(control+saline, control+colchicine, exercise+saline, exercise+colchicine) (Fig. 1B).

Western blotting 분석

마우스 골격근에의 단백질 측정은 선행연구에서 설명된 것처럼 Bio-Rad사의 Western blot 시스템을 사용하여 전형적인 형태의 전기영동법을 사용하여 특정한 단백질의 양을 분석하였다. 이 실험에서 사용된 Primary 항체: anti-phospho-p70S6 (ser235/236), anti-p70S6, anti-Atg5 (12994), anti-Beclin1 (3494), anti-phospho-mTOR (ser2448) (2971), anti-mTOR (2972) (Cell Signaling Technology), anti-p62(1842-1-AP), Proteintech, (Santa Cruz Biotechnology), anti-LC3 (L7543) and anti-β-actin (Sigma-Aldrich).

자료처리

측정된 자료는 SPSS 21.0 통계 프로그램을 이용하여 평균과 표준편차를 산출하고, 집단 간 평균차 검증은 일원변량분석(one-way ANOVA)을 적용하였다. 유의수준은 a=0.05로 설정하여 분석한 결과, 통계적으로 유의한 차이가 있을 경우 사후 검증(Fisher’s LSD)을 실시하였다.

결과

β-HB가 몸무게, 음식물 섭취량, 내장지방 무게에 미치는 영향

그룹 간 몸무게의 유의한 변화는 실험이 시작되고 3주까지는 나타나지 않았다. 4주가 되어 비운동 통제그룹(Sed+Con, Sed+β-HB)과 운동 그룹(Exe+Con, Exe+β-HB)간의 몸무게의 유의한 차이가 나타났고(p<0.05), 몸무게의 차이는 실험이 끝날 때(8주)까지 지속되었다. 하지만 PBS와 β-HB의 투여 그룹 간의 몸무게 차이는 8주 전체 실험 기간에 걸쳐 유의하게 나타나지 않았다(p>0.05, Fig. 2A). 본 연구에서 8주 달리기 운동은 마우스 몸무게를 유의하게 감소시켰지만, 8주 β-HB의 투여는 마우스 몸무게의 변화에 영향을 미치지 않았다. 일일 음식 섭취량은 첫주에 동물 마리 당 평균 약 4.6 g으로 3주째까지는 4 그룹간 일일 음식 섭취량의 차이는 나타나지 않았다. 4~8주 사이에 운동 그룹(Exe+Con과 Exe+β-HB)이 비운동 그룹(Sed+Con과 Sed+β-HB)에 비해 일일 음식섭취량은 유의하게 증가하였다. 하지만 β-HB의 투여 효과는 8주 전체 실험 기간에 걸쳐 일일 음식 섭취량에 유의한 영향을 미치지 않았다(p>0.05, Fig. 2B).

Fig. 2. Effects of 8-week β-HB treatment and running exercise training on body weight (A) and daily food consumption (B). Values are means±S.E. *p<.05 vs. Sed+Con, ^#p<.05 vs. Sed+β-HB. ■ Sed+Con; ◆ Sed+β-HB; ▲ Exe+Con; ● Exe+β-HB.

Table 1에서 보이는 것처럼, Sed+Con 그룹에 비해 Exe+Con 그룹과 Exe+β-HB 그룹은 8주간의 처치에 의해 부고환 주위 지방의 무게가 각각 약 37%, 46% 씩 유의하게 감소되었다(p<0.05). 또한 Sed+β-HB 그룹에 비해, Exe+Con 그룹과 Sed+β-HB 그룹은 부고환 주위 지방의 무게가 각각 약 35%, 45% 씩 유의하게 감소되었다(p<0.05). 하지만 Sed+Con 그룹과 Sed+β-HB 그룹 간 그리고 Exe+Con 그룹과 Sed+β-HB 그룹 간의 유의한 차이는 나타나지 않았다. 8주 운동 훈련은 내장지방의 무게를 유의하게 감소시켰지만 8주 β-HB 투여는 운동 유무와 상관없이 마우스 내장 지방의 무게를 변화시키지 않았다.

Table 1. Epididymal fat weight, wet skeletal muscle weight, weight-adjusted muscle weight, and blood parameters

Values are means ± S.E.; n=12/group.Epi fat weight: Epididymal fat weight; TA: tibialis anterior; Sol: soleus; BW: body weight. ＊p<0.05 vs. Sed+Con; ^#p<0.05 vs. Sed+β-HB.

β-HB가 혈액지표에 미치는 영향

8주 β-HB 처치에 의한 마우스 혈액의 케톤 수치(β-HB mmol/L)는 비 β-HB 처치 그룹(Sed+Con & Exe+Con)에 비해 β-HB 처치 그룹(Sed+β-HB & Exe+ β-HB)이 유의하게 증가되었다(p<0.05, Table 1). Sed+Con, Sed+β-HB, Exe+Con, Exe+β-HB, 4 그룹들 간의 혈액 글루코스와 총콜레스테롤의 수준은 유의한 차이가 나타나지 않았다. 하지만 혈액 젖산 농도는 Exe+β-HB 그룹에서 나머지 그룹들(Sed+Con, Sed+β-HB, Exe+Con)보다 통계적으로 유의하게 감소하였다. 3 그룹(Sed+Con, Sed+β-HB, Exe+Con)의 평균 혈액 젖산 농도는 약 3.77 mmol/l (3.6~3.9 mmol/l)이었고, Exe+β-HB 그룹의 혈액 젖산 농도는 2.7 mmol/l로 측정되었다. 혈액 중성지방인 triglyceride 농도는 Exe+con 그룹과 Exe+β-HB 그룹이 Sed+Con 그룹과 Sed+β-HB 그룹 보다 통계적으로 유의하게 감소되었다(p<0.05). Exe+Con 그룹과 Exe+β-HB 그룹 간의 차이가 나타나지 않는 것으로 보아 β-HB 투여에 의한 것이 아니라 운동훈련이 triglyceride 농도에 영향을 준 것임을 알 수 있다.

β-HB가 지구력 달리기 시간에 미치는 영향

마우스의 지구력은 트레드밀 위에서 최대 달리기 시간을 측정하여 평가되었다. 훈련 전과 2주에서 탈진 시까지 달리기 시간은 그룹 간의 차이가 나타나지 않았지만(P>0.05), 4주째에 Exe+Con 그룹(~35분)과 Exe+β-HB 그룹(~47분)은 Sed+Con 그룹(~24분)과 Sed+β-HB 그룹(~25분)에 비해 달리기 시간이 증가하였다(p<0.05, Fig. 3). 또한 6주와 8주째에도 운동 그룹(Exe+Con과 Exe+β-HB)의 달리기 시간은 비운동 그룹(Sed+Con과 Sed+β-HB)에 비해 유의한 증가가 유지되었다. 4주째에 Exe+β-HB 그룹은 Exe+Con 그룹 보다 약 12분 더 오래 달릴 수 있었고, 6주와 8주의 달리기 테스트에서도 Exe+β-HB 그룹의 달리기 시간이 Exe+Con 그룹에 비해 각각 약 22분과 약 31분씩 증가되었다(p<0.05, Fig. 3). 본 연구에서 지구성 훈련과 조합되었들 때, β-HB 투여 효과는 4주부터 나타났고, 마지막 주(8주)까지 지구력 달리기 수행능력을 향상시켰다. Sed+Con 그룹과 Sed+β-HB 그룹 간의 최대 달리기 시간은 8주 동안 4차례의 테스트에서 한 번도 유의한 차이가 나타나지 않았다(p>0.05).

Fig. 3. Endurance capacity was evaluated by total running time before exhaustion of mice treated with PBS or β-HB, with or without exercise training for 8 weeks (A). Values are means ± S.E. *p<0.05 vs. Sed+Con, ^#p<0.05 vs. Sed+β-HB, ^δp<0.05 vs. Exe+Con.

β-HB가 골격근의 자가포식 유동에 미치는 영향

골격근에서 8주 β-HB 투여와 지구성 운동훈련의 복합적 처치가 단백질 분해 기전의 하나인 자가포식에 미치는 영향을 조사하기 위해 각 그룹 동물의 골격근(전경골근)을 추출하여 자기포식 유동(autophagy flux)을 LC3 항체(antibody)를 사용하여 Western blot 분석 방법으로 측정하였다. 또한 자가포식과 관련된 p62, Atg5, Beclin-1 단백질 수준을 Western blot 방법으로 측정하였다. Colchicine을 처치하여 자가포식을 억제시킨 후 자가포식 유동 분석한 결과 Sed+Con 그룹에 비해 Sed+β-HB 그룹의 LC3-II 단백질 수준이 약 27% 유의하게 감소하였다. Sed+Con 그룹에 비해 Exe+β-HB 그룹의 LC3-II 단백질은 약 95% 유의하게 증가하였다(p<0.05, Fig. 4A, Fig. 4B). Exe+β-HB 그룹의 LC3-II 단백질 수준은 Exe+Con 그룹에 비해 약 28% 감소하였다. 본 연구에서 β-HB 처치는 지구성 운동훈련에 의해 증가된 골격근의 자가포식의 활성을 감소시켰다. LC3-II의 Western blot 결과로 보아 8주 β-HB 처치는 골격근에서 달리기 훈련을 하든지 훈련을 하지 않든지에 상관없이 비슷한 비율로 자가포식의 활성화를 억제시킨다는 것을 알 수 있다. p62 Western blot 결과를 보면, Sed+Con 그룹에 비해 Sed+β-HB 그룹의 p62 단백질 수준이 약 90% 증가하였다(p<0.05). 반면 Exe+β-HB 그룹의 p62 단백질 수준은 Sed+Con 그룹에 비해 약 55%의 감소하였다(p<0.05, Fig. 4C, Fig. 4D). p62 단백질은 자가포식이 활성화되었을 때 감소되며 반대로 자가포식이 억제되면 p62 단백질량은 세포 내에 축적되어 증가하게 된다. 또한 Sed+β-HB 그룹의 증가된 p62 단백질 수준은 8주 운동훈련에 의해 유의하게 감소하였다. 즉 β-HB 투여에 의해 감소된 자가포식은 8주 운동훈련에 의해 그 효과가 상쇄되었다. 유사하게, 자가포식-관련 단백질인 Atg5 (Fig. 4C, Fig. 4E)와 Beclin-1(Fig. 4C, Fig. 4F) 또한 8주 β-HB 처치에 의해 단백질 수준이 유의하게 감소하였다(p<0.05).

Fig. 4. The comparison of autophagy marker proteins and the effects of 8-week β-HB supplementation and endurance exercise on autophagy marker proteins in skeletal muscle of mice. Representative immunoblot images of LC3 or β-actin (A) and p62, Atg5, Beclin-1 or β-actin (C). LC3-II/β-actin (B), p62/β-actin (D), atg5/β-actin (E), Beclin-1/β-actin (F) were quantitated via densitometry from 6 mice per treatment conditions. Values are means ± SE; (n=6) *p<0.05 vs. sed+con+Col, ^#p<0.05 vs. sed+β-HB+Col, ^δp<0.05 vs. exe+Con+Col for in vivo autophagy flux assay A, B). *p<0.05 vs. sed+con, ^#p<0.05 vs. sed+β-HB, ^δp<0.05 vs. exe+Con for autophagy-related proteins (C, D, E, F).

β-HB가 골격근의 단백질 합성에 미치는 영향

8주 β-HB와 운동훈련이 골격근의 단백질 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 그룹 동물의 골격근(전경골근, TA)을 채취한 후 단백질 합성의 수준을 알아볼 수 있는 mTOR 인산화(phosphorylation, serine 2448)와 mTOR 하위인자(substrate)인 phospho-S6 ribosomal protein (p-S6 ser235/236) 인산화 그리고 puromycin 항체를 사용하여 Western blot 분석 방법을 통해 측정하였다. mTOR는 세포 내 단백질 합성을 조절하는 주요한 조절 인자이며, 이 단백질의 활성화가 되었을 때 세포 내 전체 단백질의 합성 과정이 증가하게 되고 mTOR의 활성화가 감소되면 세포 내 전체 단백질 수준은 감소하게 된다. Phospho-mTOR의 분석 결과를 보면 8주 β-HB 와/또는 운동훈련 처치 모두 mTOR의 인산화(ser2448)를 유의하게 증가시켰다(p<0.05, Fig. 5A, Fig. 5B). Sed+Con 그룹에 비해 Sed+β-HB, Exe+Con, Exe+β-HB 그룹의 mTOR 인산화는 각각 약 70%, 100%, 그리고 약 160% 유의하게 증가하였다. 즉, 8주 β-HB 와/또는 지구성 운동훈련은 골격근의 단백질 합성을 증가시켰다. Phospho-S6의 인산화 또한 mTOR 인산화 결과와 유사하게 나타났다. 8주 β-HB 와/또는 운동 훈련 모든 처치가 S6의 인산화(ser235/236)를 통계적으로 유의하게 증가시켰다(p<0.05, Fig. 5A, Fig. 5C). Sed+Con 그룹에 비해 Sed+β-HB, Exe+Con, Exe+β-HB 그룹의 S6 인산화는 각각 약 90%, 67%, 그리고 약 340% 유의하게 증가하였다. 특히 β-HB와 운동훈련의 복합적 처치가 골격근의 단백질 합성에 상당한 시너지한 효과가 보여주었다. Puromycin과 결합된 아미노산의 양을 측정하여 단백질 합성의 변화를 조사하는 분석방법인 in vivo SUnSET assay를 통해 8주 β-HB 와/또는 운동훈련의 효과를 조사한 결과, Sed+Con 그룹에 비해 Sed+β-HB, Exe+Con, Exe+β-HB 그룹의 mRNA로부터 합성된 아미노산과 결합한 puromycin의 양이 각각 약 56%, 110%, 그리고 약 210% 유의하게 증가하였다(p<0.05, Fig. 5D, Fig. 5E). 이 결과는 mTOR와 S6의 인산화의 결과와 유사하게 나타났으며, 8주 β-HB 처치와 지구성 운동훈련은 마우스 골격근의 단백질 합성을 증가시킨다는 것을 의미한다.

Fig. 5. Effects of 8-week β-HB supplementation and running exercise on phosphorylation of mTOR and S6 in skeletal muscle of mice. Representative immunoblot images of phosphor-mTOR (ser2448), total mTOR, phosphor-S6 (ser235/236), total S6 or actin (A). Phosphor-mTOR (ser2448)/total mTOR (B), phosphor-S6 (ser235/236)/total S6 (C) were quantitated via densitometry from 6 mice per treatment conditions. Representative immunoblot images of puromycin or actin (D). Puromycin/actin (E). Each bar represents the means±SE for muscles from 6 mice (n=6). *p<0.05 vs. Sed+Con, #p<0.05 vs. Sed+NaAC, ^δp<0.05 vs. Exe+Con.

고찰

고지방 탄수화물 제한 식단에 적응된 신체는 운동 중에 지방 산화를 증가시켜 신체의 제한된 글리코겐 저장을 보전하는데 도움이 될 수 있다[7]. 지방 위주의 에너지 공급 전략의 초점은 운동 중 지방 산화 능력을 향상시키며[11], 극단적인 탄수화물 제한(eg., <50 g/day)은 케톤체의 생산을 증가시켜 뇌와 골격근 조직에 추가적인 에너지 기질을 제공할 수도 있다[19, 25]. 하지만 운동선수들을 위한 이 식단은 고강도의 지구력 형태의 운동 중 골격근의 주요한 연료인 탄수화물을 사용할 수 있는 능력의 감소로 인하여 운동수행능력을 오히려 떨어뜨릴 수 있다.

케톤 다이어트의 문제를 극복하고 그 이점을 고통 없이 얻을 수 있는 β-HB 투여는 운동 중 글루코스 사용을 감소시키고 지방 대사를 증가시킴으로써 에너지 대사에 영향을 미칠 수 있다[12]. 지구력 능력을 결정짓는 주요 요인 중의 하나는 지방 산화(fat oxidation)의 증가이다. 증가된 지방 산화는 운동 중 골격근과 간의 글리코겐의 사용을 감소(glycogen sparing)시켜 준다[10]. 골격근의 미토콘드리아에서 베타-산화(β-oxidation)에 이은 세포 호흡(cellular respiration)은 지구력 운동 중에 근육 에너지를 위해 적절한 ATP를 생산하는데 필수적이다. 따라서 지방 산화를 증가시키고 탄수화물 소비를 감소시켜줄 수 있는 에너지 대사 조절 능력은 장시간 운동할 때 지구력을 향상시켜 줄 수 있다. 운동 중 지방 대사의 증가/글루코스 사용의 감소는 혈중 젖산 생성의 감소를 의미한다. 본 연구에서 지구성 트레드밀 달리기 후에 측정된 혈액 젖산 농도는 다른 3그룹에 비해 Exe+β-HB 그룹에서 약 30%가 유의하게 감소되었던 것은 이것을 설명해준다. 본 연구와 비슷하게, 운동 선수들을 대상으로 실행되었던 두 선행연구에서 케톤체 투여가 운동 중 혈액 젖산 농도를 각각 약 55%와 35% 만큼 감소시켰다[3, 11]. 하지만 이 두 연구는 케톤체 투여에 의한 운동 수행능력에 미치는 영향은 상반된 결과를 보여주었다. 또 다른 두 연구에서도 케톤체 투여가 운동 수행능력에 미치는 효과에 대해 불일치한 결과를 보여주었다. Rodger et al. (2017)은 엘리트 사이클 선수들(n=12)을 대상으로 90분 동안의 사이클 운동 전에 11.7 g의 β-HB를 투여하였을 때, 평균 4분 최대 사이클 파워(9 W) 발휘에서 약 2%가 증가된 것을 보여주었다[20]. 반면 O’Malley et al. (2017)은 일반 남성들(n=10)을 대상으로 0.3 g/kg을 투여한 후 time trial 수행능력을 평가하였다. β-HB 투여는 파워 발휘를 ~7% 감소시켰고, time trial을 완료하는 데 걸리는 시간은 대조군보다 ~8% 더 길었다[18]. 케톤체 투여에 의한 운동 중 에너지 대사의 변화는 이론적으로 지구력 운동능력 향상에 도움을 줄 수 있는 조건이라고 할 수 있지만, 현재 그 효과는 불분명하다. 본 연구에서 마우스에게 8주 동안, β-HB와 지구성 훈련을 병행(β-HB+Exe)하였을 때, 지구성 훈련만 한 그룹(Exe+Con)에 비해 탈진 시까지 달리기 시간이 4주(35%), 6주(41%), 8주(45%)에 유의한 증가를 보여주었다. 동물을 대상으로 수행되었던 본 연구에서는 8주 β-HB 투여는 지구성 달리기 수행능력을 증가시켰다. 본 연구에서 에너지 대사율이 측정되지 않았지만, Exe+β-HB 그룹만이 유일하게 운동 후 혈중 젖산 농도를 감소시킬 수 있었기 때문에, β-HB 투여가 탄수화물 대사를 감소시키고 대신 지방 산화를 증가시켜서 지구성 달리기 수행능력을 향상시켰을 것으로 추정된다.

케톤은 가지 사슬 아미노산(branched-chain amino acids)과 유사한 구조를 갖고 있기 때문에 근육량 증가나 근육의 단백질 손실을 막는데 주요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다. 한 연구에서 수술 후, 골격 외상, 심한 화상 및 패혈증을 포함한 이화 작용 조건에서 케톤체를 투여하였을 때 질소 균형(근육 단백질 전환을 반영)을 증가시켜서 단백질 절약(protein sparing) 또는 항이화작용(anti-catabolic) 효과를 보여주었다[22]. 또한, 다른 연구에서 β-HB의 동화작용 가능성(anabolic potential)이 확인되었다. 건강한 남성들(n=8)을 대상으로 β-HB-나트륨을 ~2 mM 주입하였을 때, 루신(leucine) 산화를 감소시켰고 단백질 합성을 약 10% 증가시켰다[15]. Thomsen et al. (2018)은 건강한 남성(n=10)에게 급성 염증과 근육량 감소를 유도하는 LPS(lipopolysaccharide)를 처치한 후, 표지된 추적자(labeled tracers)와 근생검(muscle biopsy)을 통해, 단백질 역학 및 세포내 신호 전달 경로를 조사하였다. β-HB 투여가 근육에서 페닐알라닌 유출(phenylalanine efflux)을 70% 감소시켰으며, 이것은 β-HB가 염증 유발 근육 위축 상태에서 항이화 효과를 발휘할 수 있음을 보여준 것이다[21]. 이들 연구들의 결과와 비슷하게, 본 연구에서도 β-HB 투여가 골격근의 단백질 분해(자가포식 유동 감소)를 감소시켰고, in vivo SUnSET 방법으로 측정한 결과 단백질의 합성을 유의하게 증가시켰다. 따라서 β-HB는 골격근에서 항이화 작용 또는 동화 작용에 기여하는 것으로 보인다. 하지만 본 연구에서 8주 β-HB 투여 후 실제 마우스 근질량의 변화를 반영시키지는 못하였다(Table 1). 두 결과의 불일치는 β-HB투여가 실제 근육량의 증가를 유도하는데 더 오랜 기간(즉, 8주 이상)이 필요할 수 있거나 또는 비록 β-HB 투여량(250 mg/kg)이 근육 단백질 증가를 위한 긍정적 신호체계의 효과에도 불구하고 실제 유의한 근육량의 증가까지 유발시키기 충분하지 않은 농도일 수 있다. 현재 β-HB 투여가 단백질 전환에 미치는 효과에 대한 연구는 초기 단계이며 추가적 연구가 필요할 것 같다. 또한 근육의 단백질 합성을 위해서는 mTOR pathway의 활성화가 필요하지만, mTOR가 활성화되면 대신 자가포식은 감소하게 된다. 자가포식은 근육 단백질 항상성에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에, mTOR 활성화의 증가(자가포식 활성의 감소)가 근육의 정적인 단백질 균형(positive protein balance)에 유익한가, 아니면 mTOR의 감소(자가포식 활성의 증가)가 근육의 단백질 항상성에 도움이 되는가, 또한 어떠한 조건이 실제 경기력 향상에 도움이 되는 가에 대한 근본적 의문의 해결이 미래의 연구에서 이루어져야 할 것 같다.

본 연구는 마우스 모델을 통해 8주 케톤체(β-HB) 투여가 마우스 골격근의 단백질 합성의 증가와 단백질 분해 과정의 하나인 자가포식은 억제시켰다. 또한 지구성 운동 수행능력을 향상시켰고 피로 물질인 혈중 젖산 농도를 감소시켰다. 따라서 본 연구는 β-HB가 운동수행능력 제고 보조물(ergogenic aids)로서의 가능성을 제시하고자 한다.

감사의 글

이 논문은 2020년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 연구되었음(2020S1A5A2A01040863).

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.