흰쥐의 풍시(風市)혈(GB31) 자극이 알콜성 근위축에 미치는 효과

The Protective Effects of Acupressure at Feng Shi against Chronic Alcohol-induced Muscle Atrophy in Rats

Abstract

Purpose : Excessive alcohol causes damage to skeletal muscles, leading to the development of a specific disease entity called alcoholic myopathy. Chronic inflammation is related as an underlying mechanism for the loss of muscle mass induced by alcohol. Pro-inflammatory cytokines such as TNF-α (tumor necrosis factor-α) and IL-6 (interleukin-6) play a role in this process. The acupuncture point Feng Shi (GB 31) is located on the midline of the lateral aspect of the thigh, above the transverse popliteal crease. This acupoint is used for the treatment of weakness, atrophy, numbness, and post-stroke symptoms of lower limbs. The purpose of this study was to investigate the effect of Feng Shi stimulation on muscle atrophy caused by chronic alcohol administration. Method : Young male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups of eight each: Normal, Control, and GB31. The rats in the Control and GB31 groups were orally given 25 % ethanol (5 ㎖/kg, body weight) daily for 4 weeks. The Normal group was similarly administered saline. The acupressure at Feng Shi was treated to rats in the GB31 group. After 4 weeks, the body weight, muscle weight and cross-sectional area of gastrocnemius were assessed and the histological changes in gastrocnemius muscle fiber were observed by hematoxylin and eosin staining. Moreover, TNF-α and IL-6 expressions were immunohistochemistrically evaluated. Results : Acupressure stimulation at Feng Shi had a protective effect on the weight reduction of the gastrocnemius muscle caused by alcohol intake, and had an effect of suppressing anatomical change in muscle fiber and decreasing the average cross-sectional area. Also, the immunoreactivities of TNF-α and IL-6 in the GB31 group were decreased. Conclusion : These results suggest that acupressure at Feng Shi has protective effects on chronic alcohol-induced muscle atrophy by inhibiting pre-inflammatory proteins such as TNF-α and IL-6.

Ⅰ. 서론

1. 연구의 배경 및 필요성

인체는 알콜에 과도하게 노출될 경우 뼈대근의 손상으로 근위축이 발생하고, 근위축으로 대표되는 알콜성 근병증(alcoholic myopathy)이라는 특정 질병을 유발한다(Simon 등, 2017). 알콜성 근위축은 인구 100,000명당 2,000명의 유병률을 보이는 가장 흔한 뼈대근 질환 중 하나로 주로 남성에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 근육량 감소, 근력손상, 보행 곤란, 경련 등의 증상을 동반한다(Simon 등, 2017). 만성적인 알콜 섭취는 인체 내 근육 단백질 합성 및 분해 조절작용에 영향을 주며, 이 과정에는 염증 반응, 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 등의 기전이 관여하는 것으로 알려져 있다(Alleyne J & Dopico AM, 2021). 특히, 알콜 섭취는 근육 내 염증 반응을 촉진시켜 조직손상을 일으키는데 이 과정에서 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 IL-6(interlukin-6) 등이 증가하게 된다(Levitt 등, 2020). 이렇게 증가된 cytokine들은 근육 내 단백질 분해를 증가시키고, 만성 염증 상태로 만들게 된다. 이렇듯 알콜로 인한 근위축은 근육뼈대계 질환 중에서 흔하게 발생하는 질병이며 인체 근육계통에 미치는 영향이 큼에도 불구하고 금주와 운동요법 외에 별다른 치료법이 제시되지 못하고 있는 실정이다.

경혈압박(acupressure)은 현재 세계적으로 여러 외과질환 및 내과질환을 치료하는 데 많이 사용되고 있는 치료법이다(Schlaeger 등, 2017; Yeganeh 등, 2017). 다리의 많은 경혈점 중 특히 풍시혈(風市, GB31)은 한의학의 족소양담경(足少陽膽經)에 속하는 경혈점으로써 넓적다리 가쪽면 엉덩정강근막띠(iliotibial tract) 뒤쪽의 오목한 곳에 위치한다. 주로 다리의 근력약화, 위축, 마비, 경련, 궁둥신경통 등의 질환에 사용되는 경혈점이다(Lim 등, 2016). 하지만, 풍시혈이 실제 임상에서 다리의 근력 약화 및 위축에 주로 사용되고 있음에도 불구하고, 이에 대한 실험적 연구는 전혀 시행된 바 없다.

2. 연구의 목적

본 연구에서는 만성 알콜 투여로 유발된 근위축 손상에 대한 풍시혈 자극이 미치는 영향을 살펴보기 위하여 4주간의 흰쥐에 EtOH를 경구 투여하고 풍시혈을 압박 자극한 후 체중변화, 근육의 무게, 근섬유 단면적의 변화 및 근위축과 관련된 염증성 단백질의 변화를 관찰하였다.

Ⅱ. 연구방법

1. 실험동물

본 연구는 동의대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 모든 과정이 진행되었다(A2022-027).

본 연구에 사용된 실험동물은 10주령, 약 250 g 전후의 male rat (Sprague-Dawley rat, Samtako, Korea) 24마리를 사용하였다. 흰쥐는 항상 일정한 온도(23∼24 ℃) 및 습도(40∼60 %)가 유지되는 항온항습실에서 사육, 관리되었다. 물와 사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였으며, 실험에 사용되기 전 실험실 환경에 1주 이상 적응시켰다.

2. 실험군 분리

실험동물을 무작위로 8마리씩 3군으로 나누었으며, 아무런 처치도 가하지 않은 Normal군, 4주간 EtOH을 경구 투여한 Control군, 그리고 EtOH 투여 후 풍시혈을 압박 자극한 GB31군으로 하였다.

3. 만성 알콜성 근위축 유발과 경혈자극

흰쥐에서의 만성 알콜성 손상은 25 %의 에탄올(EtOH, Sigma–Aldrich Chem. Co., St. Louis, USA) 용액을 5 ㎖/㎏, bw/day의 용량으로, 4주간 경구 투여함으로써 유발시켰다(Salisbury 등, 1992). Control군과 GB31군에는 매일 오전 일정한 시간에 에탄올을 경구 투여 하였으며, Normal군에는 같은 양의 생리식염수를 투여하였다. 에탄올 투여 30분 후에 GB31군에 풍시혈 자극을 시행하였다.

흰쥐의 왼쪽 다리의 풍시혈에 상응하는 위치는 신체 여러 부분의 표지점의 이용하여 등분으로 나누는 골도 분촌법을 사용하여 특정하였으며(Pan 등, 2018), 경혈 자극은 pressure needle (DBC-2, Dongbang Medical, Korea)을 부착하고, 30초 자극을 2회 1분간 압박하여 시행하였다. 이러한 압박은 오전, 오후로 나누어 4주간 매일 2회 시행하였다(Kim 등, 2008; Trentini 등, 2005)(Fig 1).

Fig 1. Location of Fengshi(GB31) in human and rat

4. 체중측정 및 근육 무게의 변화

실험동물의 체중은 주 1회 측정하였으며, 실험 개시일과 마지막 날의 체중 차이를 비교하였다. 실험 종료일에 실험동물에 에테르(ether)를 과흡입시켜 안락사시킨 후 왼쪽 장딴지근(gastrocnemius)을 채취하여 중량을 측정하고, 체중 100 g당 근육의 상대 무게를 계산하였다. 이후에 근육 조직의 중앙부분(mid-belly)을 약 5 ㎜ 정도 두께로 절편하여 –50 ℃의 dry ice-isophentan 용액으로 동결시키고 –80 ℃에서 보관하였다.

5. 근육 절단면의 해부조직학적 관찰 및 단면적 측정

동결 보관된 장딴지근 근육 조직의 중앙부분을 연속적으로 8 ㎛ 두께로 냉동 절편하여 H&E 염색법을 시행 후, 현미경 하에서 관찰하고 사진 촬영 후 영상분석용 Axiovision LE software (Carl Zeiss Vision, ver 4.2 USA)를 이용하여 근육 단면의 면적(cross sectional area)을 측정하였다. 근섬유의 평균 면적은 각 실험군에서 최소 30개 이상의 근섬유 단면적의 크기를 측정함으로써 계산하였다.

6. 면역화학조직염색(immunohistochemistry)

근육 조직 내의 단백질 변화를 관찰하기 위해 자유부유법(free-floating)의 방식으로 면역조직화학염색을 시행하였다. 일차 항체는 anti-TNF-α (AB6671, ABcam, Cambridge, UK), anti-IL-6 (SC28343, Santacruz, Texas, USA)를 사용하였다. 근육 조직을 PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석하여 4 ℃에서 12시간 반응시킨 후, PBS로 씻어내고, ABC Vectastain Kit (PK-6100, Vector labs, Newark, CA, USA)를 사용하여 abidin-biotin immunoperoxidase 방법으로 각각 1시간씩 반응시켰다.

면역 반응의 결과는 정량화를 위해 현미경 하에서 동일면적 내 면역 양성반응을 보인 세포수를 측정하여 수치화하였다.

7. 통계학적 분석

모든 자료는 ANOVA 분석으로 유의성 여부를 확인한 후, student's t-test를 통해 p<.05의 유의수준으로 검증하였다. 모든 결과는 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표시하였다.

Ⅲ. 결과

1. 체중의 변화

최초 각 군별 흰쥐의 평균 체중은 Normal군이 246.13±4.82 g, Control군이 248.38±6.93 g, GB31군이 246.38±5.88 g으로 서로 차이가 없었으나, 4주 후 마지막으로 측정된 체중은 Normal군에서 419.38±32.24 g, Control군에서 377.50±24.93 g, GB31군에서는 382.75±24.98 g으로 측정되어 Control군과 GB31군에서 Normal군에 비해 체중의 유의성 있는 감소가 관찰되었다(p<.05). Control군과 GB31군 사이에는 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다.

2. 근육 중량의 변화

각 실험군의 장딴지근을 적출하여 무게를 측정한 후, 체중 100 g당 상대 중량을 환산하여 비교한 결과에서 Normal군에서 555.20±11.44 ㎎/100g, Control군에서는 514.81±12.51 ㎎/100g, GB31군에서는 532.03±11.07 ㎎/100g으로 측정되어 GB31군과 Control군에서 모두 Normal군에 비해 gastrocnemius의 상대 중량이 유의성 있게 감소하였다(p<.01, Table 1). GB31군과 Control군의 비교에서는 GB31군에서 Control군에 비해 근육 중량 감소의 유의성 있는 억제가 관찰되었다(p<.05, Table 1).

Table 1. Muscle weights of gastrocnemius in rats (unit: ㎎/100g body weight)

^##p<.01 compared with normal group, * p<.05 compared with control group

3. 해부조직학적 변화

장딴지근의 중앙부분을 8 ㎛ 두께로 냉동 절편하고 H&E 염색법을 사용하여 현미경으로 관찰한 결과, Normal군과 비교하여 Control군에서 근섬유의 위축이 뚜렷이 관찰되었다. 또한, 근섬유 주변의 핵(nucleus)의 응집도 관찰되었다. GB31군에서도 이와 비슷하게 관찰되었으나, Control군에 비해 근섬유의 위축이 상대적으로 적은 편이었으며, 핵응집도 약하게 관찰되었다(Fig 2).

Fig 2. Representative hematoxylin & eosin stained of gastrocnemius muscle in rats of normal, control and GB31 groups

4. 근섬유의 단면적 변화

각 실험군의 장딴지근 단면적을 비교한 결과, Normal군은 5,949.50±208.07 ㎛², Control군은 5,188.88±233.96 ㎛², GB31군에서는 5,485.75±252.20 ㎛²로 측정되어, GB31군과 Control군 모두에서 Normal군에 비해 장딴지 근 근섬유의 평균 단면적이 감소하였다(p<.01, Table 2). 한편, GB31군과 Control군의 비교에서는 GB31군이 Control군에 비해 근섬유 단면적 감소에 유의성 있는 억제가 관찰되었다(p<.05, Table 2).

Table 2. Cross sectional areas of gastrocnemius in rats (unit: ㎛2)

^##p<.01 compared with normal group, * p<.05 compared with EtOH group

5. TNF-α와 IL-6 단백질의 발현 변화

TNF-α의 발현은 Normal군에서 드물게 발견된 반면, 알콜 섭취로 근위축을 유발된 Control군에서는 Normal군에 비해 단백질 발현이 뚜렷이 증가된 것이 관찰되었다. 근위축 유발 후 풍시혈을 자극한 GB31군에서도 Control 군과 유사하게 단백질 발현의 증가가 관찰되었으나 Control군과 비교하면 상대적으로 발현이 감소되었다(Fig 3).

Fig 3. Representative photos of TNF-α immunoactivities of gastrocnemius muscles in rats

IL-6 단백질의 발현도 Normal군에서는 TNF-α에서와 마찬가지로 드물게 관찰되었다. 하지만 근위축을 유발된 Control군에서는 Normal군에 비해 단백질 발현이 뚜렷이 증가된 것이 관찰되었으며, 근위축 유발 후 풍시혈을 자극한 GB31군에서는 Control군과 비교했을 때 상대적으로 발현이 감소되는 것으로 관찰되었다(Fig 4).

Fig 4. Representative photos of IL-6 immunoactivities of gastrocnemius muscles in rats

10⁵ ㎛²의 일정한 동일면적 내의 면역 양성반응 세포수를 측정하여 면역반응을 정량화한 결과에서도 TNF-α의 경우 Normal군은 1.50±1.20개, Control군은 24.75±2.96개, GB31군에서는 20.75±3.62개로 측정되었고, IL-6의 경우에는 Normal군에서 1.63±0.74개, Control군은 21.25±2.25개, GB31군에서는 17.63±3.42개로 측정되어, GB31군과 Control군 모두에서 Normal군에 비해 TNF-α와 IL-6의 발현이 유의성 있게 증가하였다(p<.01, Table 3). 하지만, GB31군과 Control군의 비교에서는 TNF-α와 IL-6의 발현 모두 GB31군이 Control군에 비해 유의성 있는 감소가 관찰되었다(p<.05, Table 3).

Table 3. The immunoactivities TNF-α & IL-6 of gastrocnemius muscles in rats (unit: count/10⁵ ㎛²)

^##p<.01 compared with Normal group, * p<.05 compared with EtOH group

Ⅳ. 고찰

만성적인 알콜 섭취는 인체의 위장관, 뼈대근, 심장 및 뇌 등의 장기에 영향을 미쳐서 다양한 병리적인 반응을 유발한다. 특히 알콜성 근위축은 만성 알콜중독 환자의 40~60 %에 영향을 미치는 근골격계 질환 중 가장 흔한 질병 중 하나이다(Urbano 등, 2022; Wen 등, 2022).

본 연구에서는 흰쥐에 4주간 에탄올을 경구 투여함으로써 근위축을 유발하였는데, 알콜을 투여한 Control군과 GB31군에서 모두 Normal군에 비해 체중증가가 유의성 있게 감소되었다. 이러한 체중감소의 원인은 알콜 섭취로 인한 영양불균형 때문인 것으로 생각되며, GB31군에서 Control군에 비해서는 체중감소가 다소 회복되었으나 유의성 있는 변화는 아니었다. 따라서 풍시혈 자극은 알콜 섭취로 인한 체중감소에는 별다른 효과를 나타내지 않는 것으로 보인다.

알콜 섭취로 유발되는 근위축은 type I 근섬유보다는 상대적으로 type II 근섬유에 선택적으로 더 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Caceres-Ayala 등, 2022; Shenkman 등, 2019). 따라서 본 연구에서는 다리의 근육 중 type II의 비율이 높은 장딴지근을 이용하여 알콜성 근위축에 대한 풍시혈 압박 자극의 효과를 검증하였다. 4주간의 알콜 투여 후 장딴지근의 무게를 측정하여 비교한 결과, Control군과 GB31군에서 모두 Normal군에 비해 장딴지근의 상대 중량이 유의성 있게 감소되었다(p<.01). 이러한 결과는 알콜 섭취로 인한 단백질 합성 저하로 인한 근육량의 감소했기 때문인 것으로 보이며, 특히 상대적으로 Type II 근섬유가 다량 존재하는 장딴지 근육에 더 큰 영향을 미쳤기 때문인 것으로 보인다. 하지만, 근육 무게 감소가 나타난 GB31군과 Control군과의 비교에서는 GB31군에서 Control군에 비해 근육 감소가 유의성 있게 억제되었는데(p<.05), 이러한 결과는 풍시혈 자극이 알콜 섭취로 인한 근육량 감소에 대해 보호효과를 가지고 있음을 나타내는 것이라 할 수 있다.

더 나아가, 장딴지근 근섬유의 변화를 측정하기 위해 H&E 염색 후 현미경 하에서 관찰한 결과에서는 Control군과 GB31군에서 모두 Normal군 비해 유의성 있는 근섬유의 위축이 관찰되었으며, 근섬유 주변에 핵(nucleus)의 응집도 관찰되었다. 이러한 결과는 앞서 언급한 장딴지 근 무게의 감소와도 관련이 있는 것이다. 하지만, GB31군에서 이러한 변화가 Control군에 비해 상대적으로 줄어드는 것으로 확인되었다. 즉 근섬유의 위축변화가 억제되었으며 핵응집도 감소되는 것으로 관찰되었다.

실제 장딴지근 근섬유의 평균 단면적을 측정한 결과에서도 Control군과 GB31군에서 Normal군에 비해 평균 단면적이 감소하는 것으로 나타났다(p<.01). 하지만, GB31군과 Control군과의 비교에서는 GB31군에서 Control군에 비해 근육의 단면적 감소가 억제되어, 유의성 있는 회복이 관찰되었다(p<.05). 이러한 결과는 풍시혈 자극이 만성적인 알콜 섭취로 인한 장딴지 근섬유 위축에 유의한 방어 효과가 있음을 나타내는 것이라 할 수 있다.

근섬유 조직 내에서의 TNF-α와 IL-6 단백질의 발현을 관찰한 결과에서는 Normal군에서는 모두 발현이 드물게 관찰되었다. 하지만 근위축을 유발된 Control군에서는 Normal군에 비해 단백질 발현이 뚜렷이 증가된 것이 관찰되었다. 이는 TNF-α, IL-6와 같은 염증성 사이토카인들이 만성 알코올 섭취로 인한 근육 조직 손상을 일으키는 염증 환경을 촉진하기 때문인 것으로 보인다. 한편, 근위축 유발 후 풍시혈을 자극한 GB31군에서는 Control군과 비교했을 때는 상대적으로 TNF-α와 IL-6 단백질의 발현이 감소되는 것으로 관찰되었다. 실제 일정한 단위면적당 발현 세포수를 측정한 결과에서도 유의성 있는 감소가 확인되었다. 이러한 결과는 4주간의 알콜 섭취로 인해 근육 내 염증 반응을 유발되는 과정에서 풍시혈 자극이 염증성 사이토카인들의 변화를 일으켜 염증을 촉진하는 TNF-α와 IL-6 단백질의 발현을 억제시키고 이를 통해 근섬유의 감소와 근육 무게 감소를 억제시켜 결과적으로 근위축에 방어효과를 나타내고 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

본 연구의 결과들을 종합하면 풍시혈 압박 자극은 장딴지근 위축으로 대표되는 알콜성 근위축에 유의한 방어 효과가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 실제 임상에 활용하여 만성적인 알콜 섭취로 인한 근위축 환자의 재활에 있어서 각종 다양한 물리요법과 더불어 풍시혈에 대한 지압 등의 압박 자극을 시행한다면 더욱 효과적인 치료결과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다. 다만, 이번 연구에서는 풍시혈과 알콜성 근위축과의 관련성을 검증하였으나, 앞으로 후속 연구를 통해 풍시혈과 다른 원인에 의한 근위축 및 풍시혈 외에 다른 경혈점과 근위축과의 관련성에 대해서도 지속적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.

Ⅴ. 결론

본 연구는 만성적인 알콜 섭취로 유발된 근위축에 풍시혈 자극이 미치는 보호 효과를 관찰한 것으로, 이를 위한 흰쥐에 4주간 에탄올을 경구 투여한 후 풍시혈 압박 자극을 시행하고, 체중 변화, 장딴지근의 무게, 근섬유 단면적 변화 및 염증관련 단백질의 변화를 측정한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.

풍시혈 압박 자극은 알콜 섭취로 유발된 장딴지근 무게 감소에 보호 효과가 있었으며, 근섬유의 해부조직학적 변화와 평균 단면적 감소를 억제시켜 주는 효과가 있었다. 이와 같은 결과는 TNF-α와 IL-6 등의 염증성 단백질의 억제기전 때문인 것으로 보인다. 따라서 풍시혈 자극은 알콜성 근위축에 유의한 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.