2021년 서해권역 실내 바이오플락 양식기술(Bioflocs Technology)로 사육한 흰다리새우(Litopenaeus vannamei) 병원체 모니터링

Monitoring of Pacific Whiteleg Shrimp Litopenaeus vannamei Pathogens Cultured with Biofloc Technology on the West Coast of Korea, 2021

Abstract

The advantage of biofloc technology (BFT) in aquaculture is in the prevention of pathogenic transmission. In this study, we performed an investigation on viral, bacterial, and microsporidian parasite infections targeting a total of 194 whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei reared in seven BFT-farms on the west coast of Korea in 2021. Hepatopancreatic and cuticular epithelium and pereiopods tissues of shrimp were tested for the four pathogens, Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), Vibrio parahaemolyticus causing Acute Hepatopancreatic necrosis disease (VP_AHPND), white spot syndrome virus (WSSV), and hepatopancreatic parvovirus (HPV). The microsporidian parasite EHP was detected in the hepatopancreatic tissue of BFT whiteleg shrimp in the Ganghwa region, whereas no other pathogenic bacteria or virus was detected on the shrimp in the seven BFT-farms. As a result of bacterial flora in the rearing water of BFT whiteleg shrimp using DNA microbiome technology, V. chemaguriensis and V. alfacsensis were contained at 0.05% and 0.01%, respectively, but no VP_AHPND was detected. These findings will serve as a basis for supporting safe BFT-aquaculture of whiteleg shrimp.

서론

우리나라의 새우 양식업은 대하(Fenneropenaeus chinensis)에 흰반점병(white spot disease, WSD) 발병으로 대량폐사가 발생하여, 양식산업에 큰 피해를 끼쳤다. 2003년 국립수산과학원이 성장이 빠르고 환경 적응이 높은 흰다리새우(Litopenaeus vannamei)를 미국에서 이식하여 인공 종자를 생산하였으며 이후 대부분 흰다리새우로 대체하여 양식되고 있다. 현재 국내 흰다리새우 양식 생산량은 2018년 5,492톤, 2020년 8,124톤으로 국내 소비자들의 수요 증가로 생산량도 늘어나고 있는 추세이나(KOSIS, 2021) 바이러스 등 질병 발생으로 양식어가 경제적 손실이 막대하다(NIFS, 2018). 이에 국립수산과학원 서해수산 연구소는 질병에 대한 효과적인 대안으로 바이오플락(biofloc)을 적용한 양식기술을 개발 보급하였다. 바이오플락이란 식물 플랑크톤, 사육생물 배설물, 사료찌꺼기, 원생동물 및 세균성 미생물 등이 결합된 미세집합체이다. 바이오플락은 양식활동에서 발생되는 독성의 암모니아를 제거하여 수질을 향상시키며 양식생물에게 영양공급 역할도 수행한다(Jang, 2016). BFT (biofloc technology) 양식기술의 장점은 사육수의 교환을 최소화하여 배출수에 의한 환경오염 방지 및 흰다리새우 병원체 전염의 차단이 가능하다. 또한 고밀도 사육이 가능하여 양식생산성이 향상되고 양식생물에게 영양공급도 가능하여 사료효율도 향상된다(Kim et al., 2014). 흰다리새우에 큰 피해를 입히는 질병은 바이러스성 질병으로 WSD, 타우라증후군(taura syndrome), 노랑머리병(yellow head disease) 등이 있다(WOAH, 2021). 또한 세균성 질병인 비브리오증도 흰다리새우에 큰 피해를 주는 질병 중에 하나이다(Kumar et al., 2017). 비브리오증의 원인균으로는 Vibrio alginolyticus, V. campbelli, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. penaeicida, V. vulnificus 등의 병원체가 보고되고 있지만(Stam and Smiley, 2014), 이들은 수계에 상주하고 있는 기회성 병원체이다(Vezzulli et al., 2013). 본 연구에서는 2021년 서해권역에서 실내 BFT 양식기술을 이용한 흰다리새우의 치명적인 병원체인 PirA, PirB 독소유전자를 보유한 V. parahaemolyticus [급성간췌장괴사병(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 원인균, VP_AHPND], white spot syndrome virus (WSD의 원인 바이러스)와 흰다리새우의 대량 폐사를 유발시키지 않으나 성장지연으로 막대한 경제적 피해를 일으키는(Tang et al., 2015) Enterocytozoon hepatopenaei [간췌장미포자충병(hepatopancreatic microsporidiosis, HPM)의 원인 기생충] 및 hepatopancreatic parvovirus [파보바이러스병(hepatopancreatic parvovirus disease, HPVD)의 원인 바이러스]에 대한 병원체 모니터링을 실시하였다. 또한, 서해권역 실내 BFT 흰다리새우 사육수의 세균총을 마이크로바이옴(microbiome) 기술을 이용하여 모니터링하고, 흰다리새우의 병원체인 비브리오속 세균의 분포 비율의 변화에 대해서도 검토하였다.

재료 및 방법

시료 채집

2021년 4월부터 같은 해 11월까지 국내 서해권역의 주요 실내 BFT 양식산지인 충청남도 태안과 아산, 인천광역시 강화, 경기도 평택 BFT 흰다리새우 양식장 7개소를 대상으로 흰다리새우 194마리를 무작위로 채집하여(Table 1) 병원체 모니터링을 실시하였다.

Table 1. Sampling location and date of whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei used in this study

¹Enterocytozoon hepatopnaei (EHP) for hepatopancreatic microsporidiosis (HPM). ²Vibrio parahaemolyticus for acute hepatopancreatic necrosis disease (VP_AHPND). ³White spot syndrome virus (WSSV) for WSSV disease. ⁴Hepatopancreatic parvovirus (HPV) for HPV disease.

흰다리새우의 병원체

미포자충 질병으로 간췌장미포자충병(HPM), 세균성 질병으로 급성간췌장괴사병(AHPND), 바이러스성 질병으로 WSD 및 간췌장파보바이러스병(HPVD)을 대상으로 병원체 검사를 실시하였다. 또한 실내 BFT 양식환경수는 마이크로바이옴 기술을 이용하여 비브리오균의 현황을 확인하였다.

PCR을 통한 병원체 검사

미포자충 질병인 HPM와 세균성 질병인 AHPND 및 바이러스성 질병 HPVD 병원체 분석을 위하여 흰다리새우의 간췌장을 무균적으로 적출하였고, WSD 분석을 위하여 흰다리새우의 근육 및 두흉갑에 붙어있는 가슴다리를 무균적으로 적출하여 Lysing kit (Percellys, France)를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄 후 Patho gene-spin DNA/RNA extraction kit (Intron, Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후 PCR를 수행하였다. PCR 검사시 SSU rRNA(small subunit ribosomal RNA) target gene을 이용한 nested PCR법을 이용하였다. PCR 검사를 위해 primer는 1^st PCR 반응시 ENF779와 ENR779 (779 bp)를 이용하였고 2^nd PCR 반응시 ENF176과 ENR176 (176 bp)를 이용하여 nested PCR을 진행하였다. PCR primer 및 조건은 Table 2에 표기하였으며 PCR 산물의 유무 및 크기는 전기영동을 통해 확인하였다. 이후 증폭된 시료로 염기서열을 분석하고 MEGA X program를 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 통해 기존에 등록된 유전자와의 상동성을 확인 후 각 유전자의 계통발생학적 분석을 위하여 Clustal W에서 multiple alignment 방법으로 염기서열을 정렬하였다. MEGA X의 neighbor-joining을 이용하여 계통수를 작성하였으며, 계통수의 branch는 1,000 bootstrap resampling을 통해 결정하였다.

Table 2. PCR primer sets and amplification profiles used in this study

HPM, Hepatopancreatic microsporidiosis; AHPND, Acute hepatopancreatic necrosis disease; WSSV, White spot syndrome virus; WSD, WSSV disease; HPVD, Hepatopancreatic parvovirus disease.

양식환경수의 세균상 DNA 마이크로바이옴 분석

실내 BFT 흰다리새우 양식장 1개소(태안)를 선정하여 7월부터 9월까지 양식환경수(사육수)의 비브리오속 세균의 DNA Metabarcoding 기술을 이용하여 분석하였다. 분석은 아쿠아진텍㈜ (Busan, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. 시료를 나이트로셀룰로스 막여과지(Mixed Cellulose Ester Circle WME Range; Cytiva Whatman, Loughborough, UK)을 이용하여 농축하여 DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 대상으로 AccuPower Pfu PCR Master Mix (Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 1차 PCR 증폭반응을 수행하였다(Table 2). 생산된 PCR 증폭산물은 AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer Co.)의 사용자 설명서에 따라 정제하였다. 성공적인 PCR 증폭 반응이 일어난 시료의 PCR 증폭산물을 대상으로 2차 PCR 증폭반응을 수행하여 DNA Metabarcoding 분석용 NGS (next generation sequencing) 라이브러리를 제작하였다. PCR 증폭산물로부터 제작된 NGS 라이브러리를 대상으로 생물정보학적 분석을 진행하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 2021년 4월부터 11월까지 인천광역시 강화와 충남 태안 및 아산의 7개소의 실내 BFT 흰다리새우 양식장에서 임상증상 유무에 관계없이 무작위로 채취한 총 194마리에 대해 HPM와 AHPND 및 WSD, HPVD 병원체 모니터링을 실시하였다. 시료를 채집한 모든 양식장의 경우 1년 내내 평균 수온 27–31°C를 유지하고 있었으며, BFT 사육수는 자연해수(염분 32 psu)를 대상으로 BFT 물만들기 후에 사용하였다(Jang, 2016). 또한 흰다리새우 종묘생산을 위하여 미국 하와이에서 SPF 어미새우를 수입한 후 국내 검역기관을 통한 수산생물전염병[전염성피하 및 조혈기괴사증(infectious hematopietic necrosis), 전염성근괴사증(IMN), 타우라증후군(taura syndrome), WSD, 흰꼬리병(white tail disease), 노랑머리병 (yellow head disease), 괴사성간췌장염(necrotizing hepatopancratitis), 십각류무지개바이러스병(infection with decapod iridescent virus-1), 급성간췌장괴사병(acute hepatopancreatic necrosis disease)]에 대한 검역을 실시하여 병원체 검사 후 입식하였다. 채집한 시료 모두 질병에 의한 뚜렷한 임상증상은 관찰되지 않았다. 우선 미포자충 검사 결과 인천 강화소재 실내 BFT 흰다리새우 양식장(1개소)에서 대랑폐사는 관찰되지 않았지만 2021년 10월에 채집한 흰다리새우 10마리 중 7마리의 간췌장에서 간췌장미포자충(EHP)이 검출되었고 다른 표본은 음성으로 확인되었다(Table 1). 검출률은 전체 조사 시료의 3.6%로 확인되었다(Table 1). PCR 검사결과 흰다리새우의 간췌장에서 176 bp 크기의 밴드가 확인되었다(Fig. 1). 176 bp 크기의 밴드가 확인된 PCR 산물의 부분 염기서열을 MEGA X program 의 근린결합분석(Neighbor-joining analysis, 1,000 rounds of bootstrap)을 이용하여 계통수 분석을 실시하였다. 본 연구에서 분리된 EHP 유전자 염기서열을 GenBank에 기존에 등록되어 있는 EHP속 유전자 9종과 비교분석 결과 2021년 국내 흰다리 새우(GenBank Nos. MZ819965.1)에서 분리한 유전자와도 근연한 것으로 확인되었다(Fig. 2) (Kim et al., 2021). 간췌장미포자충병의 원인체는 EHP로 흰다리새우의 간췌장을 감염시키고 소화와 흡수 기능에 영향을 끼쳐 성장지연 등의 임상증상이 나타난다(Tang et al., 2015). 본 연구에서는 2021년 인천 강화 소재의 흰다리새우에서 간췌장미포자충병이 의심되어 PCR 분석 결과를 바탕으로 병원체 유전자가 확인되었다. EHP가 검출된 시료의 임상증상을 관찰해본 결과, 2021년 10월에 강화 소재의 EHP 검출 및 미검출된 인근 양식장 2개소(‘21년 4월 입식) 흰다리새우의 평균 성장률(정상성장 BFT흰다리새우의 평균 성장률, 1 g/week)을 비교하였다. 그 결과, EHP 미검출 양식장 흰다리새우 평균 무게는 15–28 g이고 전장은 11–17 cm로 평균 성장률이 일주일에 0.87 g인 반면, EHP가 검출된 양식장의 흰다리새우의 평균 무게는 11–12 g이고 전장은 8–15 cm로 평균 성장률이 일주일에 0.45 g으로 확인되어 본 연구에서 상기의 임상증상이 확인되었다(Fig. 3). 추후 지속적인 병원체 모니터링을 통하여 흰다리새우의 성장지연 등의 임상증상과 간췌장미포자 충병 발병 관계에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 1. PCR products amplified from Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei reared at BFT-farms in Ganghwa of Korea. PCR using a primer set, ENF176 (the amplicon size, 176 bp); Lane M, 1 kb DNA ladder; Lane S1-S10, PCR products from hepatopancreas of whiteleg shrimp; Lane N, Negative control; P, Positive control.

Fig. 2. The phylogenetic tree constructed using the neighborjoining method, using of MEGA software (version X; http://www.megasoftware.net). All reference sequences were acquired from the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). The numbers indicate the percentages of bootstrap support from 1000 replicates. Bar, 0.50 substitutions per site.

Fig. 3. Comparison of the decline in the growth of whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei reared at BFT-farms in Korea. A, Whiteleg shrimp with normal growth (15-28 g/11-17 cm); B, Whiteleg shrimp with delayed growth (11-12 g/8-15 cm).

급성간췌장괴사병 분석을 위하여 시료 총 194 개체를 분석하였으나 모두 음성이였다(Table 1). 급성간췌장괴사병은 원인균인 V. parahaemolyticus가 갖는 독성 플라스미드(Pir A, Pir B)에 기인한다(Han et al., 2015). 2010년과 2016년 사이에 중국, 말레이시아, 멕시코, 태국, 베트남 등에서 급성간췌장괴사병에 의한 대량폐사가 보고되었다(Tang and Bondad-Reantaso, 2019). 국내에서는 2016년에 최초로 발생하였으며, 최근 2021년에도 흰다리새우에 발병하였지만(NFQS, 2021), 본 연구에서 조사한 실내 BFT 흰다리새우 양식장에서는 모두 음성으로 확인되었다. 또한 VP_AHPND와 EHP의 복합 감염에 대해서 도 보고되었다(Jeon et al., 2021). EHP에 감염된 새우는 면역력이 저하되기 때문에 2차적으로 V. parahaemolyticus에 감염되어 AHPND가 발병된다(Aranguren et al., 2017; Tang et al., 2017; Thamizhvanan et al., 2019; Han et al., 2020; Jithendran et al., 2021). 따라서 효율적인 흰다리새우의 질병 관리를 위해 VP_AHPND와 EHP의 동시 감염 모니터링도 필요하다고 생각한다.

한편, WSD과 간췌장파보바이러스병 분석을 위하여 시료 총 194 개체를 분석하였으나 모두 음성이였다(Table 1).

WSD은 white spot syndrome virus (WSSV)에 의한 바이러스성 질병으로 세계적인 새우 양식산업에 큰 피해를 준다 (Lightner, 1996; Wang et al., 1998). 국내에서도 1993년에 최초로 보고된 이래(Kim et al., 1997; Heo et al., 2000) 현재도 많은 흰다리새우 양식장에 큰 피해를 주고 있다. 본 연구에서 조사한 실내 BFT 흰다리새우의 대상 모두 음성으로 확인되었지만 (Table 1), 흰다리새우에 큰 피해를 입히는 WSD에 대한 지속적인 모니터링이 필요하다.

또한, 간췌장파보바이러스병은 hepatopancreatic parvovirus (HPV)에 의한 바이러스성 질병으로 1984년 싱가폴의 야생 새우류(F. merguiensis)처음 보고되었다(Chong and Loh, 1984). 국내에서는 1991년 새우류(F. chinensis)에서 처음 보고되었다 (Park, 1992). 국내에서 흰다리새우의 HPV 발생이 보고되어 있다(Jang et al., 2008). 본 연구에서 조사한 실내 BFT 흰다리새우 대상 모두 음성으로 확인되었다(Table 1). HPV는 양식 흰다리새우에 심각한 폐사를 유발하지는 않지만 성장저하를 유발하기 때문에 앞으로 지속적인 모니터링이 필요하다.

마지막으로 실내 BFT 양식장의 흰다리새우 사육수를 2021년 7월부터 9월까지 3회 채수하여 세균총을 DNA Metabarcoding을 통해 분석하였다(Fig. 4). 그 결과, 채수 시기별 세균총에 유의적인 변화가 관찰되었다. 전체 사육수의 세균총을 분석하면, 일반 해양세균인 Paracoccus aurantiacus (13.4%), Thermoanaerobaculum aquaticum (6.4%), Stenotrophobacter terrae (6.2%), Litorilinea aerophile (4.7%)이 높은 빈도로 검출되었다. 또한, Vibrio속 세균은 V. chemaguriensis 및 V. alfacsensis가 각각 0.05% 및 0.01% 검출되었으며, AHPND 원인균인 V. parahaemolyticus는 검출되지 않았다(Fig. 4).

Fig. 4. Bacteria flora composition of whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei rearing water in a BFT-farm in Tae-an, Korea. BFT, Bioflocs technology.

이러한 결과는 BFT 양식기술을 이용한 양식 Brine shrimp (Crab et al., 2010), White shrimp (Deng et al., 2019), Penaeus vannamei (Souza Valente et al., 2020)에서 비브리오증의 발병횟수가 감소된다는 보고를 뒷받침해주는 결과이다. 추후에 실내 BFT 양식기술과 양식 새우의 비브리오증과의 연관성을 지속적인 모니터링을 통해 연구해볼 필요가 있다고 생각한다.

이상의 결과를 정리하면, 본 연구에서는 2021년 서해권역 소재지 7개소의 실내 BFT양식기술을 이용한 흰다리새우 양식장을 대상으로 HPM, AHPND, WSD, HPVD 질병현황을 조사한 결과, AHPND 및 WSD와 HPVD 질병 대상 모두 음성으로 확인되었고 강화 소재의 1개소 실내 BFT 흰다리새우 양식장에서 10마리 중 7마리에서 EHP가 검출되었지만 검출 인근 BFT 실내 양식장의 흰다리새우 표본에서는 관찰되지 않았다.

한편, EHP 유병률과 암모니아와 아질산염 농도와의 유의적인 상관관계가 보고되어 있다. 즉, 암모니아와 아질산염이 증가할수록 EHP 유병률의 증가가 관찰되었으며 농도 1 mg/L 이상의 암모니아와 아질산염은 EHP의 직접적인 감염에 영향을 미친다고 보고되어 있다(Nkuba et al., 2021). 일반적으로 BFT 양식 사육수의 경우 암모니아와 아질산의 조절이 가장 중요하다. 바이오플락 물 만들기의 경우 암모니아와 아질산염 농도는 입식후 1주일부터 급격히 상승하는데 이 시기에 사육수 관리를 제대로 하지 못하면 흰다리새우의 폐사에 큰 영향을 미친다(NIFS, 2018). 따라서 본 연구에서 EHP가 검출된 양식장의 BFT 사육수가 적절히 관리되지 않아 EHP가 검출된 것으로 시사되며 EHP의 감염을 예방하기 위해서는 사육수의 암모니아 및 아질산염의 농도의 철저한 관리가 요구된다.

또한 흰다리새우 사육수의 세균총 마이크로바이옴을 실시한 결과, V. chemaguriensis와 V. alfacsensis가 각각 전체 세균상 DNA의 0.05%, 0.01%로 확인되었지만 이는 수계에 상재하고 있는 비브리오균주이다. 한편 흰다리새우의 병원성을 나타내는 VP_AHPND 유전자는 검출되지 않았다. 향후 지속적인 병원체 모니터링을 통해 실내 및 축제식 BFT양식기술을 이용한 흰다리새우의 안전한 양식생산을 위한 연구를 수행하고자 한다.