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Application of Primary Rat Corneal Epithelial Cells to Evaluate Toxicity of Particulate Matter 2.5 to the Eyes

눈에 대한 미세먼지의 독성 평가를 위한 쥐 각막 상피 세포의 적용

  • Kim, Da Hye (Anti-Aging Research Center, Dong-eui University) ;
  • Hwangbo, Hyun (Anti-Aging Research Center, Dong-eui University) ;
  • Lee, Hyesook (Department of Convergence Medicine, Pusan National University School of Medicine) ;
  • Cheong, Jaehun (Department of Molecular Biology, Pusan National University) ;
  • Choi, Yung Hyun (Anti-Aging Research Center, Dong-eui University)
  • 김다혜 (동의대학교 항노화연구소) ;
  • 황보현 (동의대학교 항노화연구소) ;
  • 이혜숙 (부산대학교 의과대학 융합의학교실) ;
  • 정재훈 (부산대학교 분자생물학과) ;
  • 최영현 (동의대학교 항노화연구소)
  • Received : 2022.06.17
  • Accepted : 2022.09.23
  • Published : 2022.09.30
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Abstract

The purpose of this study was to investigate the efficacy of rat corneal-derived epithelial cells as an in vitro model to evaluate the harmfulness of the cornea caused by particulate matter 2.5 (PM2.5). To establish an experimental model for the effect of PM2.5 on corneal epithelial cells, it was confirmed that primary cultured cells isolated from rat eyes were corneal epithelial cells through pan-cytokeratin staining. Our results showed that PM2.5 treatment reduced cell viability of primary rat corneal epithelial (RCE) cells, which was associated with the induction of apoptosis. PM2.5 treatment also increased the generation of reactive oxygen species due to mitochondrial dysfunction. In addition, the production of nitric oxide and inflammatory cytokines was increased in PM2.5-treated RCE cells. Furthermore, through heatmap analysis showing various expression profiling between PM2.5-exposed and unexposed RCE cells, we proposed five genes, including BLNK, IL-1RA, Itga2b, ABCb1a and Ptgs2, as potential targets for clinical treatment of PM-related ocular diseases. These findings indicate that the primary RCE cell line is a useful in vitro model system for the study of PM2.5-mediated pathological mechanisms and that PM2.5-induced oxidative and inflammatory responses are key factors in PM2.5-induced ocular surface disorders.

비록 PM2.5 노출과 다양한 안구 표면 질환과 관련성이 많은 선행 연구에서 알려졌지만, PM2.5 가 각막에 미치는 세포 독성에 대한 연구는 거의 수행되지 않았다. 본 연구의 목적은 PM에 의한 각막 상피세포의 유해성을 평가하기 위한 in vitro 모델로서 쥐의 각막유래 상피세포(primary rat corneal epithelial cells, RCE cells)의 효능을 조사하는 것이다. 이를 위하여 쥐의 눈에서 분리한 1차 배양 세포가 각막 상피세포임을 pan-cytokeratin 염색을 통하여 확인하였으며, PM2.처리에 의한 각막 상피세포의 형태학적 변화를 동반한 생존율의 억제는 세포사멸 유도와 관련이 있었다. 또한 PM2.가 처리된 각막 상피세포에서는 ROS의 생성이 증가되었으며, 이는 미토콘드리아 기능 장애와 연관성이 있었다. 이와 함께 PM2.는 각막 상피세포에서 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 포함한 염증 매개인자 및 사이토카인의 생성을 증가시켰다. 아울러 heatmap 분석을 통해 BLNK, IL-1RA, Itga2b, ABCb1a 및 Ptgs2가 미세먼지 유도 안구 질환의 임상 치료를 위한 잠재적인 표적 유전자로서 제시하였다. 결론적으로 본 연구의 결과는 1차 쥐의 각막 상피세포가 PM2.에 의한 각막 상피세포 병리기전 연구에 유용한 모델일 수 있으며, 산화적 및 염증성 반응이 PM2.유발 안구 표면 장애 유도에 핵심적인 역할을 함을 알 수 있었다.

Keywords

서론

최근 대기 중 미세먼지의 농도가 점차 높아져 그에 대한 유해성에 대한 인식이 증가하고 있으며, 코와 기관지의 점막에서 여과되어 배출되는 일반 먼지와는 달리 미세먼지(particulate matter, PM)는 매우 작아 걸러낼 수 없어 호흡과 체표면을 통해 체내 세포와 조직으로 흡수될 수 있다[1,30]. 미세먼지는 일반적으로 직경 10 μm 미만인 PM10과 2.5 μm 미만인 PM2.5로 분류되며, 크기가 작을수록 체내 침투가 증가한다. 미세먼지는 생물학적 유기체에 독성을 유발하며 암, 호흡기 질환, 신경계 장애, 피부 질환 및 심혈관 질환을 포함한 다양한 질병의 발병에 관여하며[12,15,16,30], 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer)에서는 2013년 미세먼지를 1급 발암물질로 지정한 바 있다[19].

눈은 미세먼지를 비롯한 대기 오염물질에 아무런 보호 장치 없이 자연스럽고 직접적으로 노출되어 있다. 눈의 표면은 다양한 요인에 의해 손상되며 미세먼지에 의한 각막질환은 실명의 주요 원인이 되고 있다[2]. 아울러 외상이나 미세먼지를 포함한 이물질에 의한 감염은 안구의 가려움과 통증을 유발하여 알레르기성 각막염, 결막염, 안구건조증 등 다양한 안구표면질환을 유발할 수 있다[10,13]. 이와 관련하여 여러 연구에서 미세먼지 농도의 증가는 알레르기성 각막염 및 결막염을 동반한 안과 외래 환자의 증가와 밀접한 관련이 있다고 보고되고 있다[4,8]. 예를 들어, PM2.5에 노출된 피험자에서 눈물층의 불안정성과 눈물 양의 억제를 초래할 수 있음을 시사된 바 있으며[25], 이에 따른 안구 표면 손상의 병리학적 기전으로 각막 상피의 박리, 눈물막의 파괴, 눈물샘의 염증 등이 제안된 바 있다[34]. 특히 PM2.5는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성의 증가로 인한 DNA의 산화적 손상과 세포사멸(apoptosis) 유도를 통한 각막 상피세포에 심각한 세포독성 효과를 유발할 수 있다[4]. 최근 PM2.5를 포함한 미세먼지 노출이 눈에 미치는 영향에 대한 관심이 증가하고 있지만 근본적인 병리학적 기전은 여전히 불분명하다. 특히, 각막 상피세포에서 미세먼지에 의한 세포독성의 평가와 이에 대응하기 위한 치료제의 발굴 및 효능 평가를 위한 연구 모델이 미비한 실정이다. 따라서 본 연구의 목적은 PM2.5의 병리학적 효과와 관련된 기전 연구를 위한 1차 쥐의 각막 상피세포(primary rat corneal epithelial cells, RCE cells)의 in vitro 모델을 설정하고, 표적 바이오 마크를 제시하는 것이다.

재료 및 방법

쥐의 각막 상피세포 분리 및 배양

본 연구에서 사용한 6주령의 Sprague-Dawley 암컷 쥐는 Samtako Bio Korea (Osan, Republic of Korea)에서 구입하여 1주일 동안 사육장에서 적응시켰다. 쥐의 각막 상피세포는 선행 연구를 일부 수정한 방법을 사용하여 외과적 절제 후 분리하였으며[14], 이는 안과 및 시력 연구를 위한 동물사용지침에 따라 동의대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다(승인번호 R2019-005). 이를 위하여 쥐의 눈에서 각막이식편(corneal buttons)을 절단하여 제거한 후, 상피가 위로 향하게 하여 6 well plate에 평평하게 도말하였다. 이식편을 plate에 부착하기 위해 1.2 U dispase® II (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)가 함유된 Mg2+ 및 Ca2+가 없는 Hank's Balanced Salt Solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 각막 상피(corneal epithelium)는 위상차현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 각막이식편에서 분리하였고 37℃, 습도 95 % 및 5% CO2 조건에서 25 mg 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract)과 2.5 μg 인간 재조합 표피성장인자(human recombinant epidermal growth factor)를 함유한 각질세포 무혈청 배지(keratocyte serum-free medium, KSFM; Invitrogen-Gibco)을 이용하여 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였으며, 약 10일 후, 이식편을 새 plate로 옮겼다. 쥐 각막 상피세포는 sub-confluence에 도달한 후 1:3의 분할 비율로 TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 계대 배양하였다. 이들 세포를 KSFM 및 10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific)이 함유된 Dulbecco's odified Eagle's Medium/F12 (Thermo Fisher Scientific)가 1:1 비율로 혼합된 배지에서 배양하였으며, 5번째와 10번째 계대 사이의 세포를 모든 실험에 사용되었다.

면역 형광 분석

분리된 세포가 각막 상피세포임을 확인하기 위하여 pan-cytokeratin (CK) 항체를 이용하여 면역 형광 염색을 실시하였다[33]. PM2.5처리에 따른 세포 내 ROS 수준을 조사하기 위해서는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA; Thermo Fisher Scientific)를 이용하였으며, 미토콘드리아 활성 변화를 측정하기 위해 MitoTracker® Red 염색법(Thermo Fisher Scientific)을 적용하였다. 또한 mitochondrial membrane potential (MMP)을 조사하기 위해서는 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 각 제조사의 지침에 준하여 염색이 끝난 세포들은 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하여 핵을 대조 염색하고 phosphate buffer saline (PBS)로 2회 세척한 후 형광현미경(Carl Zeiss) 하에서 관찰하였다.

미세먼지의 처리 및 세포독성 평가

본 연구에 사용된 미세먼지(PM2.5, SRM 1650b)는 National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO; Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA)에 녹여 25 mg/ml의 stock solution으로 제조 후, 처리 직전에 배양액 또는 생리식염수에 희석하였다. 쥐의 각막 상피세포에서 PM2.5의 세포 독성을 평가하기 위해 다양한 농도의 PM2.5를 24시간 처리한 후 CCK-8 assay kit (Abcam Inc., Cambridge, UK)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 세포 생존율을 조사하였다.

단백질의 분리 및 immunoblotting

PM2.5 처리에 따른 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 발현 변화를 조사하기 위하여 24시간 동안 다양한 농도의 PM2.5가 처리된 세포를 모아 PBS로 세척하였다. 준비된 세포로부터 총 단백질을 추출하기 위하여 protein extraction solution (Intron Biotechnology, Sungnam, Republic of Korea)을 사용하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용한 전기영동으로 분리한 후, Immun-Blot® polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane에 PARP 대한 항체 및 2차 항체를 반응시킨 후, enhanced chemiluminescence detection kit (Thermo Fisher Scientific) 및 Chemi-Smart (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 단백질의 발현을 시각화하였다.

염증성 지표 인자의 정량적 분석

염증성 반응에 미치는 PM2.5의 영향을 조사하기 위하여 대표적인 염증성 매개인자인 nitric oxide (NO)와 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 생성 양을 조사하였다. 이를 위하여 대조군 및 PM2.5가 24시간 동안 처리된 세포를 대상으로 Griess reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 NO의 생성 양을 측정하였으며, 사이토카인의 생성 양은 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용하여 제조사의 지침에 준하여 조사하였다.

NanoString nCounter® 분석

Microarray 유전자 발현은 nCounter Sprint platform(NanoString Technologies, Inc., Seattle, WA, USA)을 사용하여 분석하였다[9]. 이를 위하여 대조군 및 PM2.5가 24시간 동안 처리된 세포에서 총 RNA를 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분리하였다. PM2.5 처리에 따른 면역 및 신호전달계 포함한 유전자들의 발현 변화를 조사하기 위하여 분리된 RNA를 AATI fragment analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 및 DS-11 spectrophotometer (DeNovix Inc., Wilmington, DE, USA)를 사용하여 품질 평가 및 정량 분석을 수행하였다. 표적 mRNA와 reporter-capture probe pairs를 solution-phase hybridization 후, probe/target complexes를 nCounter cartridge (NCT-120)에 정렬하고 고정화한 다음 디지털 분석기(digital analyzer)를 이용하여 이미지 수집 및 데이터 처리를 수행하였다. 디지털 분석 후 얻은 결과를 housekeeping 유전자에 대한 각각의 유전자 발현 변화는 대조군 세포와 비교하여 log2배 변화 값으로 표현하였다.

통계 처리

통계 처리를 위한 실험은 최소 세 번 수행되었으며, 결과는 평균±표준 편차(standard deviation, SD)로 제시하였다. 통계 분석에는 GraphPad Prism 5.03 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하였으며, 유의미한 차이는 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 테스트를 사용하여 분석하였고, p<0.05의 확률 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

각막 상피세포의 분리 및 PM2.5에 대한 세포독성 평가

쥐의 눈에서 각막 상피세포를 분리하기 위하여 제거된 각막이식편을 세포배양 plate에 부착하고 각막 상피를 분리하여 배양하였다. 초기 계대(14]. 그러나 계대 수가 15 이상인 세포에서는 노화가 진행된 듯한 형태학적 변화를 보여 추후 모든 실험에서는 5에서 10 사이의 계대번호를 가진 안정한 세포를 사용하였다. 배양된 각막 상피세포가 각막에서 유래한 상피세포의 특성을 가지고 있는지 확인하기 위해 pan-CK 항체를 사용하여 염색을 하였다. Fig. 1A에 나타낸 바와 같이, 각막 상피세포에 대한 양성 마커인 pan-CK가 세포질 전체에 걸쳐 광범위하게 발현되어[21,33] 본 연구에 분리 배양한 세포가 각막에서 유래되었음을 알 수 의미한다.

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Fig. 1. Effects of PM2.5 on proliferation of primary rat corneal epithelial (RCE) cells. (A) For characterization of cultured primary RCE cells, immunostaining was performed using pan-CK antibody, and the location of the nuclei were counterstained with DAPI (magnification: X100). (B-D) RCE cells were treated with the indicated concentrations of PM2.5 for 24 hr. (B) Cell viability was determined by the CCK-8 assay. The data are expressed as the means ± SD (*p<0.05 and ***p<0.001 compared to untreated cells). (C) After PM2.5 treatment, images of representative morphological changes of cells were taken with an inverted microscope are presented (magnification: X100). (D) After isolation of total protein, the expression level of PARP protein was investigated by immunoblotting, and β-actin was used as a loading control.

1차 배양 각막 상피세포에 대한 PM2.5의 세포독성은 24시간 동안 다양한 농도의 PM2.5가 함유된 배지에서 배양된 세포를 대상으로 CCK-8 assay kit를 사용하여 평가하였다. Fig. 1B에서 알 수 있듯이 50 μg/ml의 PM2.5 농도에서는 유의적인 세포독성이 관찰되지 않았지만, 100 μg/ml 이상의 농도에서는 처리 농도의 증가에 따라 각막 상피세포의 생존율이 유의적으로 감소하였다. 또한 형태적 변화의 관찰에서, 미세먼지가 각막에 침투하여 각막 상피세포에 손상을 일으킨다는 선행 보고[28]와 잘 일치되게 PM2.5 처리 농도의 증가에 따라 세포 내 PM2.5의 침착이 증가하였고, 세포막 붕괴 및 응집을 포함한 형태학적 변화가 나타났다(Fig. 1C). PM2.5 처리에 따른 세포 생존율의 감소가 세포사멸과 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 세포사멸이 유발된 세포에서 관찰되는 PARP의 단편화 여부를 조사하였다. Fig. 1D에 제시한 결과에 의하면, PM2.5의 처리 농도 증가에 따라 단편화된 PARP (c-PARP)의 발현이 증가하여, 각막 상피세포에서 PM2.5에 의한 세포독성은 세포사멸 유도와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 한편, 전형적인 세포사멸 유도 과정은 caspase-cascade의 활성 의존적이며, 이 경로에 의해 최종적으로 활성화된 caspase-3은 PARP를 포함한 세포 생존에 필수적인 기질 단백질들을 분해하여 세포사멸을 종결한다. 본 연구에서 사용한 PM2.5 와는 다른 종류의 미세먼지가 처리된 각막 상피세포에의 세포사멸 유도에 이 경로가 활성화되었다는 선행 보고를 고려할 경우[28], 본 연구의 결과는 PM2.5 처리에 의한 각막 상피세포의 세포사멸은 caspase 활성 의존적으로 유발될 수 있음을 의미하며, 1차 배양 각막 상피세포에서도 재현되었음을 시사한다.

각막 상피세포에서 PM2.5에 의한 산화적 스트레스 유발

PM2.5에 의한 각막 상피세포에서의 세포독성 유발이 산화적 스트레스와 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 산화적 스트레스의 지표인 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위하여 대조군 및 100 μg/ml의 PM2.5가 처리된 세포를 대상으로 DCF-DA 염색을 실시하였다. Fig. 2A에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이, 대조군 세포에 비하여 PM2.5가 처리된 세포에서 ROS의 생성을 의미하는 녹색 형광 강도가 매우 강하게 관찰되어, PM2.5는 각막 상피세포에서 산화적 스트레스를 유도하였음을 알 수 있었다. PM2.5에 의한 이러한 결과는 선행 연구결과들과 매우 잘 일치되며[5,26], 담배연기 또는 집먼지에 의한 각막 상피 세포의 손상 또한 산화적 스트레스와 밀접한 연관성이 가진다[24,37]. 아울러 각막 상피세포에서 뿐만 아니라 인체를 구성하는 대부분의 세포에서도 ROS의 생성은 미세먼지에 의한 공통적인 현상이다[17,29,35]. 세포 내에서 ROS의 생성은 다양한 요인에 의하여 발생할 수 있지만, 미토콘드리아의 기능 손상에 의한 전자전달계의 교란이 주 인원이 될 수 있다. 따라서 DCF-DA 염색에 의하여 나타난 ROS의 축적이 미토콘드리아 기능 저하와 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 동일한 조건에서 배양된 각막 상피세포를 대상으로 MitoTracker® Red 염색을 실시하였다. Fig. 2B에 제시한 결과에서 알 수 있듯이, 정상적인 기능을 수행하는 미토콘드리아를 나타내는 적색 형광이 대조군 세포에서 관찰되었지만, PM2.5가 처리된 세포에서는 매우 감소하였다. 또한 건강한 미토콘드리아 기질에서 JC-1이 polymer로 응집되어 나타나는 붉은 형광의 강도가 대조군에서는 강하게 발현된 반면, MMP의 소실을 의미하는 monomer 형태인 녹색 형광은 PM2.5가 처리된 세포에서 강하게 발현되었다(Fig. 2C). MitoTracker®의 적색 형광의 감소와 함께 MMP의 소실은 미토콘드리아의 기능이 정상적으로 이루어지지 않음을 나타내는 지표이므로, 이 결과는 PM2.5가 처리된 세포에서 미토콘드리아의 기능이 소실되었음을 보여주는 것이다. 따라서 각막 상피세포에서 PM2.5 처리에 의한 ROS 생성의 증가는 미토콘드리아의 기능 소실과 연관되었을 알 수 있다. 이는 인간 각막 상피세포에서 미세먼지에 의한 ROS의 생성 증가가 미토콘드리아 부피를 감소시키고 ATP 생성을 억제하였다는 결과와 잘 일치된다[28]. 아울러 본 연구의 결과는 많은 실험 모델에서 제시된 미토콘드리아 기능 장애가 미세먼지를 포함한 대기 오염과 관련된 다양한 질환의 발병에 핵심적인 역할을 한다는 사실을 잘 지지해 주며[3,22], 이 또한 1차 배양 각막 상피세포에 재현되었음을 알 수 있다.

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Fig. 2. Induction of ROS generation and mitochondrial impairment by PM2.5 treatment in RCE cells. RCE cells were treated with 100 μg/ml PM2.5 for 1 hr (A and B) or 24 hr (C). (A and B) PM2.5-treated cells were stained with 10 μM DCF-DA (A, green) and 100 nM MitoTracker® (B, red) dye for 10 min. Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Representative immunofluorescence images observed under a fluorescence microscope were shown. (C) Changes in MMP were investigated as changes in JC-1 derived fluorescence. After staining, representative images of JC-1 aggregates (red, indicating high potential) and monomers (green, indicating low potential) of cells of each treatment group were captured using a fluorescence microscope.

각막 상피세포에서 PM2.5에 의한 염증성 반응의 유발

최근 연구들에 의하면, PM2.5에 의한 안구 질환의 유발에는 산화적 스트레스에 동반된 염증 반응의 증가가 주요 요인으로 작용함이 밝혀졌다[16,26]. 특히 PM2.5에 노출되면 각막 상피세포가 손상된 부위로 이동하는 것이 억제되어 각막 상처 치유 능력이 제한되며, 이는 ROS 생성 및 염증 반응 증가에 의한 각막 상피세포의 세포사멸 촉진에 따른 노화와 연계된다[5]. 예를 들어, PM2.5에 노출된 야외 작업자의 눈물에서 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokines)인 IL-5 및 IL-10의 수치가 감소하였으며 이는 안구 표면 면역반응 저하에 기여하는 것으로 나타났다[23]. 반면, PM2.5에 노출된 포함한 각막 상피세포에서 염증성 매개인자인 NO와 전염증성 사이토카인인 IL-8의 생성이 증가하였으며[26], 결막 상피세포(conjunctival epithelial cells)에서도 TNF-α 및IL-6의 수치가 상승하였고[7], 이는 산화적 스트레스 유발을 동반하였다. 또한 Niu et al. [26]의 연구에 의하면 PM2.5가 처리된 각막 상피세포에서 nod-like receptor family pyrin domain containing three (NLRP3) inflammasome 활성과 연관된 pyroptosis가 PM2.5에 의한 각막 독성에 직접적인 연관성이 있었다. 따라서 1차 배양 쥐 각막 상피세포에도 이러한 현상이 동반되는 지를 조사한 결과, NO의 생성이 대조군에 비하여 PM2.5가 처리된 세포에서 4.5배 정도 증가하였으며, TNF-α, IL-β 및 IL-6의 생성 또한 PM2.5 처리에 의하여 증가하였다(Fig. 3). 그러나 IL-10과 같은 대표적인 항염증성 사이토카인은 유의적인 변화가 관찰되지 않았다(Data not shown). 따라서 쥐의 1차 배양 각막 상피세포에서 PM2.5가 산화적 스트레스와 함께 염증반응을 상승시키는 것은 본 연구에서 사용된 1차 배양 각막 상피세포를 포함한 거의 모든 세포에서 관찰되는 공통적인 현상임을 알 수 있다.

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Fig. 3. Increased secretion of inflammatory mediator, NO, and cytokines in PM2.5-treated RCE cells. (A) After treatment with 100 μg/ml PM2.5 for 24 hr, amounts of NO production in culture media were determined by Greiss reaction. (B-D) The levels of TNF-α (B), IL-1β (C) and IL-6 (C) in medium were evaluated using the corresponding commercial ELISA kits. The data are expressed as the means ± SD (**p<0.01 and ***p<0.001 compared to untreated cells).

각막 상피세포에서 PM2.5 유행성 관련 표적 유전자 발굴

최근 Lyu et al. [20]은 PM2.5에 노출된 인간 각막 상피세포의 전사체 프로파일링을 보고한 바 있다. 그들은 PM2.5에 의하여 증가하거나 감소된 유전자들을 중심으로 미세먼지 관련 안구 표면 질환의 치료에 적용 가능한 유전자로서 plasminogen activator inhibitor type-2 (PAI-2)를 제시하였다. 다양한 유전자들 중에서 이를 선택한 근거로서 PAI-2는 PM2.5에 노출된 인간 기관지 상피 세포(human bronchial epithelial cells)의 epithelial-mesenchymal transition (EMT) 과정과 관련이 있었기 때문이었다[18]. 본 연구실의 선행 결과에서도 PM2.5는 인간 망막 상피세포에서 EMT를 촉진시켰음을 보고한 바 있으며, 이는 산화적 스트레스 유도 의존적이었다[15]. 본 연구에서도 1차 배양 쥐 각막 상피세포에서 다양한 유전자 발현 프로파일링을 보여주는 heatmap 분석을 통하여 PM2.5의 새로운 표적 유전자의 발굴을 시도하였다. 조사된 면역 및 신호전달계를 포함한 유전자 중에서 PM2.5에 의하여 2배 이상 증가(붉은색)하였거나 감소(파란색)한 유전자를 Fig. 4A에 제시하였으며, 각 유전자의 핵심적인 기능은 Fig. 4B에 제시하였다. 특히 PM2.5 처리에 의하여 3배 이상 감소하였거나 증가한 유전자들을 PM2.5 처리에 의한 표적 유전자로 선발하였으며, 감소한 대표적인 유전자로는 B-cell-linker-protein (BLNK) 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1RA)이며, 증가한 유전자로는 integrin alpha-IIb(Itga2b), ATP binding cassette subfamily B member 1A(ABCb1a) 및 prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (Ptgs2)였다. B 세포 수용체 신호전달계 핵심 linker 단백질인 BLNK의 기능적 상실은 B 세포의 항상성을 파괴하고 B세포의 발달 및 성숙에 영향을 미쳐 B 세포 관련 면역 질병의 발생으로 이어질 수 있다[18]. 면역 세포를 포함한 다양한 세포에서 IL-1RA은 IL-1 수용체(IL-1 receptor, IL-1R)에 부착하여 IL-1 계열 사이토카인의 염증성 반응의 억제에 관여한다[32]. 따라서 각막 상피세포에서 이 두 유전자가 PM2.5의 처리에 의하여 감소되었음을 면역 기능의 저하 및 염증반응의 상승 효과에 최소한 기여할 수 있을 것으로 추정된다. 한편 CD41로도 알려진 Itga2b는 혈소판 수용체로 작용하는 혈소판 당단백질의 형성에 기여하며[27], 당 단백질의 일종으로 ABC transporter인 Abcb1a는 특정 약물의 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과성에 중요한 역할을 한다[6]. 잘 알려진 바와 같이 PM2.5는 태반과 태아의 BBB를 가로질러 배아 발달의 신경독성을 유발할 수 있다[39]. Ptgs2는 arachidonic acid를 prostaglandins로의 전환에 관여하는 cyclooxygenase-2로서 염증 반응에 관여하는 prostaglandin 계열 물질의 생성이 핵심적인 역할을 하면, 미세먼지 노출에 대응하여 그 발현과 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다[31]. 특히 PM2.5는 인간 배아 줄기세포 유래 망막 organoid 모델에서 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 촉진하여 비정상적인 인간 망막 발달에 기여한다고 보고된 바 있다[38]. 그러나 Ptgs2를 제외하고는 각막 상피세포에서 미세먼지에 의한 이들 유전자들의 역할은 전혀 알려진 바 없다.

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Fig. 4. Heatmap of candidate gene expression using NanoString nCounter® expression assay in PM2.5-stimulated RCECs. Cells were treated with 200 μg/ml of PM2.5 for 24 hr. Total RNA was collected, and hybridization was performed using reporter probes and capture probes. After digital analysis through nCounter nanostring assay, the raw data was normalized using the housekeeping gene, and the gene expression change was represented by the fold change value. (A) Heatmap representing differentially expressed genes with fold-change cutoff of 0.5 and 2 (red and green, respectively). (B) A summary of the main functions of genes that were reduced or increased by more than two-fold by PM2.5 treatment was presented. (C) Expression of each gene was indicated as fold change compared with control. Dotted lines were displayed to distinguish genes that were decreased by more than 3-fold (blue) or increased by more than 3-fold (red).

본 연구에서는 미세먼지에 의한 각막 상피세포의 유해성을 평가하기 위한 in vitro 모델로서 쥐의 각막 유래 상피 세포의 활용성을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, 1차 배양 쥐 각막 상피세포에서 PM2.5에 의한 세포독성은 세포사멸 유도와 연관성이 있었으며, 이는 미토콘드리아 기능 장애에 따른 ROS의 생성 증가에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한 PM2.5는 각막 상피세포에서 염증성 반응을 증가시켰으며, 이는 PM2.5의 침투에 따른 면역계의 교란과 연계성이 있을 것으로 추정된다. 아울러 본 연구에서 발굴된 BLNK, IL-1RA, Itga2b, ABCb1a및 Ptgs2는 향후 미세먼지의 유해성과 연관된 각막 상피세포의 병리적인 기전 연구와 방호 물질의 발굴을 위한 표적 유전자로 제안한다.

감사의 글

이 논문은 2022학년도 동의대학교 교내연구비(과제번호: 202201590001) 및 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단에서 시행한 기초연구사업(No. 2021R1A2C2009549) 연구비 지원으로 수행되었다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.

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