Exploration of Beneficial Herbal Medicines to Attenuate Particulate Matter-induced Cellular Injury in Human Corneal Epithelial Cells

인간 각막상피세포에서 미세먼지로 인한 세포 손상을 완화할 수 있는 유익한 한약재의 탐색

Abstract

Particulate matter (PM) is known to be involved in the onset and progression of various diseases by promoting oxidative and inflammatory reactions as air pollutants containing various small particles that are harmful. In this study, the protective efficacy of herbal medicines was evaluated in human corneal epithelial cells (hCECs) to select natural products that can protect the eye, the primary organ directly exposed to external pollutants from PM. As a result, five candid ate herbal medicines [Cheonmundong, Asparagus Rhizome; Seokchangpo, Aciru Gramineri Rhizoma; Hwangryeon, Coptidis Rhizoma; Gamgug, Chrysanthemi Indici Flos; and Geumjanhwa (Marigold flower petals)] which showed inhibitory efficacy on PM_2.5-induced cytotoxicity, were selected from among 12 candidate herbal medicines. To evaluate the antioxidant activity of these candidate substances, the reactive oxygen species (ROS) scavenging ability was investigated, and it was found that the extracts of Seokchangpo, Cheonmundong and Hwangryeon showed a significant inhibitory effect on PM_2.5-induced ROS production, which was correlated with the preservation of mitochondrial activity. In addition, it was confirmed that they could block DNA damage caused by PM_2.5 through analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine generation and phosphorylated-H2A histone family member X (γ- H2AX) expression. Furthermore, the increase in inflammasome activity and inflammatory response in PM_2.5-treated hCECs was also canceled in the presence of these extracts. Although additional studies are needed, the results of this study will be used as primary data to find novel natural compounds that protect hCECs from PM.

미세먼지는 유해한 다양한 작은 입자를 가진 대기오염 물질로서 산화적 및 염증성 반응을 촉진하여 다양한 질환의 발병과 진행에 관여하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 외부 오염물질에 직접적으로 노출되는 1차 노출 기관인 안구를 미세먼지로부터 보호할 수 있는 약재를 선정하기 위해, 인간 각막상피세포에서 후보 약물들의 방어 효능을 평가했습니다. 그 결과, 12종의 후보 약재 중 PM_2.5에 의한 세포 독성 억제효능을 보인 후보 약재 5가지(천문동, 석창포, 황련, 감국 및 금잔화)를 선별하였다. 이들 후보 물질들의 항산화 활성을 평가하기 위하여 ROS 소거능을 조사한 결과, 석창포, 천문동 및 황련 추출물이 유의한 효과를 나타내었으며, 이는 미토콘드리아 활성 보존 효능과 다소 연관성이 있었다. 또한, 이들은 PM_2.5에 의한 DNA 손상을 차단할 수 있었음을 8-OHdG 생성 및 γ-H2AX 발현 분석을 통하여 확인하였다. 본 연구의 결과는 PM_2.5에 대한 각막상피세포의 보호 신규 천연물의 탐색을 위한 자료로 활용될 것이다.

서론

미세먼지(particulate matter, PM)는 대기 중에 떠다니는 입자상 물질로 이산화황, 질소 산화물, 납, 오존 및 일산화탄소 등으로 구성된다. 미세먼지는 일반적으로 직경이 10 μm 미만의 경우는 PM₁₀ , 2.5 μm 미만의 경우 PM_2.5 로 분류되며, 크기가 작을수록 기관지와 피부를 통해 체내로 흡수되어 장기나 세포에 더욱 깊숙이 침투할 수 있다[38, 48]. 최근 미세먼지는 1급 발암 물질로 규정이 된 바 있으며, 안과 질환을 포함한 다양한 장기 손상의 원인 물질로 작용한다[37, 45]. 눈은 외부 환경에 직접 노출되어 있어 미세먼지를 비롯한 대기 오염물질에 취약하며, 외상 또는이물질에 의한 감염은 알레르기성 각막염(allergic kerati- tis), 결막염(conjunctivitis), 안구건조증(dry eye) 등 다양한 안구표면 장애를 유발할 수 있다[16, 20]. 본 연구실의 선행 연구결과에 의하면, PM_2.5 는 인간 망막색소상피(retinal pigment epithelial cells)의 표현형을 상피(epithelium)에서 섬유아세포(fibroblasts)와 유사한 중간엽으로 변경(epithelial- mesenchymal transition)시키고 세포의 이동성을 증가시켰으며, 이는 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreor- etinopathy)의 원인이 될 수 있음을 최초로 보고하였다[22]. 또한, 망막색소상피에서 PM_2.5 에 의한 DNA 손상과 미토콘드리아 기능 장애 유발을 동반한 세포괴사(necrosis)와자가포식(autophagy)이 망막 장애 유도의 원인이 됨을 밝힌 바 있다[23]. 아울러 두 현상은 모두 산화적 스트레스연관 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 증가가 주요 요인으로 작용함을 제시하였으며, 미세먼지에 의한 안구 세포의 손상은 ROS 생성을 억제함으로써 개선될 수 있음을 제안한 바 있다[22-24].

미세먼지에 노출된 인간 각막상피세포(corneal epithelial cells, hCECs)의 손상 유발 원인 또한 산화적 스트레스가 주요인으로 작용하며, 세포괴사와 함께 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 생성의 증가와 뮤신(mucin) 발현의 감소로 인해 안구건조증을 유발할 수 있다[15, 31, 40]. 특히 PM_2.5 에 의한 각막상피세포에서 nod-like receptor family pyrin domain containing three (NLRP3) 인플라마솜 (inflammasome) 매개 pyroptosis를 활성화하여 각막 독성을 유발하였다[32]. 이러한 안구건조증의 증가는 in vitro 및 in vivo 실험모델에서 각막상피의 손상, 결막상피세포 (conjunctival epithelial cells)의 세포사멸(apoptosis) 및 결막 잔세포(conjunctival goblet cells)의 저형성(hypoplasia)과 함께 궁극적으로 눈물 분비 및 눈물막의 파괴에 의한 것임이 밝혀졌고[5, 42, 46], 이는 선행 임상연구의 결과를 잘 뒷받침하여 준다[9].

염증성 반응을 동반한 산화적 스트레스가 미세먼지에 의한 안구 세포 손상의 원인으로 작용한다는 점은 다양한 종류의 다른 세포에서 나타나는 공통적인 현상이다[3, 12, 29, 43]. 안구 건강을 위해 현재 사용 중인 약품의 약 80% 가 천연물에서 유래되었으며[8], 미세먼지에 의한 세포 손상을 차단할 수 있는 후보 물질로서 세포 독성이 없으면서 강력한 항산화 활성을 가지는 천연물의 발굴과 효능검증에 관한 연구가 증가하고 있다[6, 36]. 예를 들어, 방풍 나물(갯기름나물, Peucedanum japonicum Thunb.) 추출물이 미세먼지 처리에 의한 염증 매개 안구건조증에 동반된병리 현상을 개선하였음을 Kang et al. [17]이 보고한 바 있다. 본 연구실에서도 산수유(山茱萸, Corni Fructus) 추출물 투여가 PM_2.5 에 의한 눈물막의 안정화 및 염증 억제를 통해 안구건조증 증상을 약화시켰으며, 망막 기능 및 지질 대사 장애 개선에 기여할 수 있음을 밝힌 바 있다[24]. 이러한 개선 효과는 우슬(牛膝, Achyranthis Radix), 행인 (杏仁, Apricot kernel) 등을 포함한 다양한 한약재 추출물에 의한 결과에서도 보고된 바 있으며[14, 26], 이는 식·의약 소재로서 전통적으로 사용되어 온 많은 천연 소재들이 미세먼지에 의한 안구질환의 처치에 잠재력이 우수함을 시사한다. 따라서 본 연구에서는 미세먼지에 대한 1차 노출 기관인 안구의 손상을 예방하기 위한 치료 약물의 발굴을 연구 목표로 설정하였다. 이를 위하여 hCECs를 대상으로 PM_2.5에 의한 세포 독성에 대한 예방 또는 치료에 적용 가능한 12종의 후보 약제를 선정하여 그 효능을 평 가하였다. 12종의 후보 약제 에탄올 추출물 중, PM_2.5 의 세포 독성을 유의적으로 차단하였던 5종에 대한 항산화 활성, 미토콘드리아 기능 보존, DNA 손상 보호 및 인플라마솜 매개 염증성 반응에 대한 개선 효과를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.

재료 및 방법

세포 배양

본 연구에서 사용된 hCEC 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. hCEC 세포는 10% fetal bovine serum가 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Nutrient mixture F-12) 배지와 Keratinocyte serum-free medium을 1:1 (v:v) 비율로 혼합한 후, 25 mg의 bovine pituitary extract와 2.5 µg epidermal growth factor 및 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포 배양에 사용된 재료들은 모두 Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.

후보 약제 추출물의 준비

본 연구를 위해 선별된 12종의 약재(Table 1) 중에서 금잔화는 한뫼산야초꽃차연구원(양산꽃차, Yangsan, Republic of Korea)에서 제공받았으며, 나머지는 ㈜대한생약제품 (Miryang, Republic of Korea)에서 파쇄된 상태로 구입하였다. 각 약재에서 에탄올 추출물을 얻기 위해 약재 100 g에 2 l의 70% 에탄올을 가하여 초음파추출로 추출물을 제조 하였다. 이를 위해 추출 용기에 약재와 70% 에탄올을 혼합한 후 초음파 수조 바닥에 닿지 않도록 하여 40 KHZ 초음파를 가하여 2시간 동안 추출하였다. 각 추출물은 여과지로 여과한 후 Rotary Evaporator (EYELA Co. Ltd., Shanghai, China)를 이용하여 농축한 후, 동결 건조 분말을 제조하였다. 이들 시료는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Am- resco, Solon, OH, USA)를 이용하여 100 mg/ml로 stock sol- ution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석 및 혼합하여 사용하였다. PM_2.5 (1650b)는 National Institute of Stan-dards and Technology (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하여 DMSO에 25 mg/ml로 현탁하고, 30분간 초음파를 이용하여 균질화된 stock solution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석, 혼합하여 사용하였다.

세포 독성 평가

hCEC 세포에서 PM_2.5 및 후보 추출물에 의한 세포 독성을 평가하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol–2-yl)-2,5-diphe- nyltetra-zolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 이를위하여 적정 농도의 PM_2.5 와 후보 추출물을 처리하여 24 시간 동안 배양하거나, 후보 추출물을 1시간 동안 전처리한 후, PM_2.5를 처리하여 24시간 배양하였으며, 양성 대조군으로는 강력한 항산화제인 N-acetyl-l-cysteine (NAC, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 1시간 전처리하였다. 배양 후, 각 well에 0.5 mg/ml MTT 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣은 후 1시간 30분 동안 반응시켰다. 이어서 배지를 제거한 후, DMSO를 넣어 생성된 formazan을 모두 녹인 다음 96 well plate에 200 μl 씩 옮겨서 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 각 물질에 대한 세포 독성은 대조군 값을 기준으로 백분율로 환산하여 나타내었다.

Table 1. List of herbal medicines used in this study

*ACM, ethanol extract of Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr; AGS, ethanol extract of Acorus gramineus Soland; AJ, ethanol extract of Atractylodes japonica KOIDZ. et. KITAGAWA; ASM, ethanol extract of Asiasarum sieboldi F. Maekawa; BJC, ethanol extract of Brassica juncea Czern. et Cosson; CCF, ethanol extract of Coptis chinensis Franch; CIL, ethanol extract of Chrysanthemum indicum Linné; EJL, ethanol extract of Eriobotrya japonica Lindley; GSB, ethanol extract of Gentiana scabra Bunge; SC, ethanol extract of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill; TE, ethanol extract of Tagetes erecta L. (Asteraceae); TKM, ethanol extract of Trichosanthes kirilowii Maximowicz.

ROS 생성의 측정

PM_2.5 및 후보 물질에 의한 hCEC 세포에서의 ROS 생성변화를 측정하기 위해 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein di acetate (DCF-DA) 염색법을 이용하였다. 이를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 세포들을 모아 10 μM의 DCF- DA (Invitrogen) 용액을 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20분간 반응시킨 후, 형광현미경(EVOS FS Auto, Thermo Fisher Scientific, Bothell, WA, USA)을 이용하여 형광 강도를 관찰하였으며, 핵의 교차 염색을 위해서는 4′,6′-diamidino-2- phenylindole (DAPI, 2.5 μg/ml; Thermo Fisher Scientific) 용액를 사용하였다[22].

미토콘드리아 활성 측정

PM_2.5와 각 후보 물질에 의한 미토콘드리아의 활성을 측정하기 위해 MitoTracker^® Red 염색법을 적용하였다. 이를 위하여 제조사의 지침에 따라, 다양한 조건에서 배양된 세포를 대상으로 MitoTracker^® Red (100 nM, Thermo Fisher Scientific)을 처리하여 37℃에서 20분 염색하고, phosphate buffer saline (PBS)로 2회 세척한 후 형광현미경하에서 관찰하였다.

DNA 손상 여부 조사

PM_2.5에 의한 DNA 손상에 대한 후보 물질의 개선 효과를 확인하기 위해 PM_2.5 단독 또는 후보 물질 처리 1시간 후 PM_2.5 를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 처리가 완료된 후, 배양액을 수거하여 4℃에서 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 잔존해 있는 미세먼지를 제거한 후 8-hy- droxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) enzyme-linked immunospecific assay (ELISA) kit (Biovision, K4160-100, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 정량적인 평가를 수행하였다.

면역 형광 검사

DNA 손상 마크인 phosphorylated-H2A histone family member X (γ-H2AX) 및 인플라마솜의 형성에 관여하는 apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) 및 caspase-1의 발현을 조사하기위하여 면역 형광 검사법을 적용하였다. 이를 위하기 동일한 조건에서 배양된 세포를 100% 메탄올로 -20℃에서 10분 동안 고정시켰다. PBS로 3번 세척 후, PBS-T (0.1% Triton X)에 5% bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich Chemical Co.)이 함유된 blocking buffer에 1시간 상온에서 반응시키고 2.5% BSA로 희석한 γ-H2AX, ASC 및 cas- pase-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 첨가하여 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 PBS-T로2회 10분간 세척하였다. 이후 1% BSA로 희석한 2차 항체 (Alexa Fluor 488-labeled donkey anti-rabbit IgG, Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PBS-T로 2회 10분간 세척하였으며, DAPI 용액을 이용하여 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 각 항체에 대한 형광 강도를 분석하였다. Image-Pro Plus 6.0 이미지 분석 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)를 사용하여 각 이미지의 광학 밀도를 측정하고 각 이미지의 평균 광학 밀도를 산출하였다.

단백질 분리 및 Western blot analysis

동일한 조건에서 배양된 세포들을 수확한 후, 3000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride, 5 mM dithiothreitol]를 첨가하여 4℃ 에서 30분간 반응시킨 후 14,000 rpm, 4℃, 30분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 동량의 단백질과 Laemmli sample buffer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 혼합하여 전기영동을 위한 샘플을 만들었고 sodium dodecyl sulphate -polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)로 단백질들을 전이시켰다. 그 후 5% skim milk를 30분 처리하였고 1차 항체(Santa Cruz Bio- technology, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA 및 Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA)를 처리하여 4℃에서 12시간 반응시킨 다음 적정 2차 항체(Santa Cruz Bio- technology, Inc.)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 단백질의 발현을 검출하기 위하여 enhanced chemiluminescence detection kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하였으며, Chemi-Smart (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 시각화하였다.

통계처리

GraphPad Prism® version 5.0 (Graphpad Inc., San Diego, CA, USA)의 one-way ANOVA를 사용하여 통계 분석을 실시하였으며, Tukey's test로 사후검정하여 p<0.05 값을유의한 값으로 처리하였다.

결과 및 고찰

hCEC 세포의 증식에 미치는 PM_2.5의 영향 평가

hCEC 세포에 대한 PM_2.5의 독성을 평가하기 위해 PM_2.5 를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였다. Fig. 1A에 나타낸 바와 같이, 25 μg/ml의 PM_2.5 가 처리된 hCEC 세포의 생존율은 약 73%로 나타났으며, 50 μg/ml가 처리된 경우 약 59%로 나타나 PM_2.5 처리 농도 의존적으로 hCEC 세포의 생존율이 억제되었다. 본 연구를 위하여 사용한 PM_2.5 와 NAC을 hCEC 세포에 처리하기 위하여 1 mM의 DMSO에 희석하였으나, 상기에서 관찰된세포 독성이 DMSO와는 무관함을 확인하였으며(Fig. 1B), PM_2.5의 처리에 따른 hCEC 세포의 형태 변화에서 PM_2.5가 처리된 hCEC 세포의 수축과 배지로의 부유된 세포의 증가가 동반되었다(Fig. 1C). 몇몇 선행 연구들의 결과에 의 하면, PM_2.5 에 노출된 각막상피세포의 증식 억제는 ROS의 생성과 연관된 산화적 스트레스의 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있다[5, 32]. 특히 Gao et al. [10]은 PM_2.5 에 의한 각막상피세포의 손상이 ROS 억제제인 NAC의 존재하에서는 현저히 차단되었음을 보고한 바 있다. 본 연구실의 선행 연구에 의하면, 이러한 ROS 생성 의존적 PM _2.5 의 세포 독성은 각막상피세포에서 뿐만 아니라 망막색소상피세포를 포함한 다양한 세포에서 나타나는 공통적인 현상임을 알 수 있다[22-25, 30]. 따라서 hCEC 세포에서도 이러한 현상이 관찰되는지를 조사하기 위하여 NAC을 전처리된 조건에서 PM_2.5 를 노출시킨 경우, PM_2.5 에 의한 세포 생존율의 억제가 유의적으로 회복됨을 확인하였다 (Fig. 1A). 이는 hCEC 세포에 미치는 PM_2.5 의 세포 독성은 산화적 스트레스 유발과 밀접한 연관성이 있음을 의미하는 것이다.

Fig. 1. Effects of PM_2.5 on the cell viability and cellular mor- phology in human corneal epithelial cells (hCECs). Cells were treated with the indicated concentrations of PM_2.5 or DMSO, or pre-treated with 1 mM NAC for 1 hr, and then treated with PM_2.5 for 24 hr. (A and B) Cell viability was measured by the MTT assay. Data are expressed as the mean±SD. The statistical analy- ses were conducted using analysis of variance (ANOVA- Tukey's post-hoc test) between groups (***p<0.001 when compared to control and ##p<0.01 when com- pared to PM_2.5 -treated cells). (C) Cell morphology was detected under an inverted phase contrast microscope (x200). Each image is representative of at least three independent experiments.

hCEC 세포에서 PM_2.5에 의한 세포 독성에 미치는 12종 후보 물질의 개선 효능 평가

hCEC 세포에서 PM_2.5의 세포 독성을 차단할 수 있는 약재의 탐색을 위한 실험 조건의 설정을 위하여 12종 에탄올 추출물이 hCEC 세포의 증식에 미치는 영향을 먼저 조사하였다. 이를 위하여 각 추출물을 단독으로 24시간 처리한 후 MTT assay를 수행하여 얻어진 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 제시된 결과는 다양한 처리 농도에 의한 선행 결과를 토대로 세포 독성이 나타나지 않는 조건에서의 적정 농도를 선정한 후 제시한 것으로서, 이를 기준으로각 추출물의 처리 최고 농도를 선정하였다[천문동(ACM), 100 μg/ml; 석창포(AGS), 0.5 μg/ml; 창출(AJ), 5 μg/ml; 세신(ASM), 5 μg/ml; 개자(BJC), 50 μg/ml; 황련(CCF), 0.5 μg/ml; 감국(CIL), 0.5 μg/ml; 비파엽(EJL), 100 μg/ml; 초용담(GSB), 50 μg/ml; 오미자(SC), 200 μg/ml; 금잔화(TE), 0.5 μg/ml; 괄루인(TKM), 0.5 μg/ml].

Fig. 2. Effects of ethanol extracts of 12 herbal medicine candidates on the cell viability of hCECs. Cells were treated with various concentrations of the indicated herbal extracts for 24 hr. Cell viability was measured by the MTT assay and data are expressed as the mean±SD.

이상에서 선정된 각 추출물의 최고 농도를 기준으로이들이 PM_2.5 에 의한 hCEC 세포의 생존율 억제에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 각 추출물 최고 농도를 포함한 4가지 처리 농도를 설정하여 hCEC 세포에 PM_2.5 를 24시간 동안 처리하기 전에 1시간 동안 전처리 후 MTT assay를 수행하였다. Fig. 3에 제시하였듯이, 10 μg/ml 및 100 μg/ml 의 천문동 에탄올 추출물(ACM)을 전처리하였을 경우, PM_2.5 단독 처리군에 비하여 유의적인 세포 독성 억제 효과를 보이지 않았지만, 25 μg/ml 및 50 μg/ml 전처리군에서는 PM_2.5 에 의한 hCEC 세포의 생존율을 유의적으로 차단하였다. 석창포 에탄올 추출물(AGS) 전처리군의 경우, 0.1 μg/ml 이하의 농도에서 PM_2.5 에 대한 세포 독성을 억제하였으나, 0.5 μg/ml 전처리군에서는 유의적인 보호 효과가 나타나지 않았다(Fig. 3B). 아울러 황련(CCF), 감국(CIL) 및 금잔화(TE) 추출물의 경우에도, 적정 처리 농도에서 유의적인 세포 생존율을 회복을 보여주었지만, 나머지 추출물의 경우, 조사된 각 추출물의 전처리 농도 범위에서 PM_2.5 에 대한 유의적인 세포 독성 억제 효과는 나타나지 않았다(Fig. 3).

이상의 결과를 바탕으로 12종 추출물 중 hCEC 세포에 독성을 나타내지 않으면서 PM_2.5에 의해 유발된 세포 손상을 보호할 수 있는 수 후보 약물로 5가지를 선정하였으며, 각 추출물에서 가장 높은 효능을 나타낸 농도[천문동 (ACM), 50 μg/ml; 석창포(AGS), 0.05 μg/ml; 황련(CCF), 0.05 μg/ml; 감국(CIL), 0.05 μg/ml; 금잔화(TE), 0.05 μg/ml] 를 다시 선정하여 후속 연구를 위한 전처리 유효 농도로 설정하였다(5종의 후보 물질 중에서 석창포(AGS) 0.05 μg/ ml 전처리군에서는 대조군 대비 약 80% 이상의 세포 생존율을 보인 반면, 천문동(ACM) 50 μg/ml 및 황련(CCF) 0.05 μg/ml 전처리군에는 약 75%의 생존율을 나타내었고, 감국 (CIL) 0.05 μg/ml 및 금잔화(TE) 0.05 μg/ml 전처리군에서는 70% 정도의 생존율을 나타내었음). 일부 후보 약물(예, ACM, AGS, CCF, CIL 및 TE)에서 나타난 PM_2.5 에 대한 세포독성의 억제 효과가 처리 농도 비의존적으로 나타난 현상은 PM_2.5과의 동시 처리에 대한 독성 증가 현상인지는 알 수가 없으며, 이에 대한 추가적인 해석을 위한 연구가 요구된다.

Fig. 3. Effects of ethanol extracts of 12 herbal medicine candidates on the cell viability in PM_2.5-treated hCECs. Cells were pre- treated with the indicated candidates for 1 hr, and then treated with 50 μg/ml PM_2.5 for 24 hr. Cell viability was measured by the MTT assay. Data are expressed as the mean±SD (***p<0.001 when compared to control; #p<0.05, ##p<0.01 when compared to PM_2.5 -treated cells).

hCEC 세포에서 PM_2.5에 의한 ROS 생성에 미치는 후보 물질 5종의 효능 비교

미세먼지에 의한 세포 독성 유발의 가장 큰 요인은 산화적 스트레스이며, 다양한 항산화 활성을 가지는 천연물들은 미세먼지에 의한 ROS의 생성을 차단하면서 세포 손상을 억제할 수 있는 것으로 보고되고 있다[3, 6]. 아울러 Fig. 1A의 결과는 PM_2.5 에 의한 hCEC 세포의 손상이 ROS 생성과 밀접한 연관성이 있음을 의미하기 때문에, 이러한 예측의 확인과 선정된 5종의 후보 물질이 ROS 생성을 억제할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 hCEC 세포에 PM_2.5 를 24시간 단독 처리하거나 5종의 후보 물질을 1시간 전처리 후 PM_2.5 를 처리하여 24시간 동안 배양한 후, ROS 생성 여부를 조사하기 위하여 DCF-DA로 염색하여 형광현미경 하에서 세포를 관찰하였다. Fig. 4A의 결과에서 알 수 있듯이, PM_2.5가 단독 처리된 세포에서는 ROS의 생성이 증가하였음을 의미하는 녹색 형광의 강도가 매우 증가되었지만, 시험법의 검증을 위해 양성 대조군으로 사용된 NAC이 전처리된 세포에서는 PM_2.5에 의한 ROS의생성이 현저히 억제되었다. Fig. 4A에서 제시한 PM_2.5 단독 처리군 및 NAC 전처리군과 5종의 후보 물질을 전처리한 세포와의 형광 강도를 비교해 보면, 석창포(AGS) 전처리군에서는 대조군의 세포에서와 유사하게 ROS의 생성이 거의 완벽하게 억제되었다. 또한 천문동(ACM) 및 황련 (CCF) 전처리군에는 NAC 전처리군과 유사한 형광 강도를 나타내어 ROS의 생성이 유의적으로 차단되었음을 보 여주었다. 그러나 감국(CIL) 및 금잔화(TE) 전처리군에서는 PM_2.5 단독 처리군에 비하여 ROS의 생성이 어느 정도 감소하였지만, 다른 3가지 추출물보다는 ROS 생성 억제효과가 비교적 미비함을 알 수 있었다. 또한, 5종 후보물질만을 단독으로 처리한 경우는 ROS 생성에 영향을 주지 않았고(data not shown), 이들의 ROS 생성 억제력에 대한 차이는 Fig. 3에서 보여준 세포 독성 억제 효율과 매우 잘 일치되며, hCEC 세포에서 PM_2.5 에 대한 세포 보호 효과는 ROS 소거능과 직접 연관성이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 4. Effects of ethanol extracts of selected 5 herbal medicine candidates on ROS generation and mitochondrial activity in PM_2.5 -treated hCECs. Cells were pre-treated with the indicated extracts for 1 hr, and then treated with 50 μg/ml PM_2.5 for 24 hr. (A) The cells were stained with DCF-DA dye (scale bar; 100 μm). (B) Mitochondria were stained with MitoTracker® Red dye (scale bar; 75 μm). (A and B) Nuclei were counter-stained using DAPI solution. The stained cells were pictured under a fluorescence microscope. Each image is representative of at least three independent experiments. The average optical density of DCF and MitoTracker in the images was quantitatively determined (***p<0.001 when compared to control; ###p<0.001 when compared to PM_2.5 -treated cells).

hCEC 세포에서 PM_2.5에 의한 미토콘드리아 손상에 미치는 후보 물질 5종의 효능 비교

다양한 산화적 스트레스에 의한 세포 손상과 연계된 ROS의 생성에는 세포 내 특정 신호계가 관여할 수 있지만, 전자전달계 교란에 따른 미토콘드리아의 기능 손상이 주요 요인으로 작용한다[1, 2, 21]. 따라서 PM_2.5 가 처리된 hCEC 세포에서 세포 독성 유발 및 ROS 생성 증가가 미토콘드리아 손상과 연관되었는지를 확인하였고, 선정된 5 종 후보 물질이 이에 미치는 영향을 평가하였다. 이를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 hCEC 세포를 대상으로 MitoTracker® Red dye를 이용하여 미토콘드리아 활성 여부를 관찰하였다. Fig. 4B의 결과에서 알 수 있듯이, 정상 배지에서 배양된 hCEC 세포에서는 세포질 전체에균일하게 MitoTracker®의 붉은색 형광 강도가 뚜렷하게 관찰되었다. 그러나 PM_2.5 를 단독 처리한 경우, 형광 강도는 거의 사라졌으며, NAC 전처리군에서는 개선시키는 경향을 보였다. 그리고 NAC이 전처리된 세포보다는 형광강도의 회복 정도가 약하지만, 5종 후보 물질이 전처리된세포에서도 PM_2.5 단독 처리된 세포에 비하여 다소 회복되는 결과를 보였으며, 그 효과는 모두 유사하였다. 이와 유사하게 각막상피세포를 이용한 선행 연구에 의하면, 미세먼지에 의한 손상은 미토콘드리아의 기능 손상을 동반

하였으며, 이는 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성과 연관성이 있음을 유추할 수 있다[21, 33]. 본 연구에서 나타난 NAC의 전처리 조건에서의 결과는 확실하게 이들의 결과를 지지해 줄 수 있지만, 5종 후보 물질이 PM_2.5 처리에 의한 미토콘드리아 기능 손상을 완벽하게 차단하지는 못하였기 때문에, 그들의 ROS 생성 억제력과 미토콘드리아 손상 차단에 관여하는 경로에 관한 추가적인 연구가 요구 된다.

hCEC 세포에서 PM_2.5에 의한 DNA 손상에 미치는 후보 물질 5종의 효능 비교

미세먼지에 의한 ROS의 축적은 산화 스트레스 반응을더욱 강화하여 단백질, 지질 및 미토콘드리아를 포함한 세포 내 소기관의 손상뿐만 아니라 핵 내로 침투하여 DNA 부가물 형성 및 DNA 복구 경로의 변경을 유도하여 DNA 손상을 유도한다[29, 34, 35]. 이러한 현상이 hCEC 세포에서도 나타나는지를 조사하기 위하여 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 지표로 사용되는 8-OHdG의 생성과 γ- H2AX의 발현 변화를 조사하였다[1, 11]. Fig. 5A에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이, 대조군에 비하여 PM_2.5 처리군에서 과량의 ROS에 의해 guanine이 수산화형(8-hydroxygua- nine)으로 전환되어 형성되는 8-OHdG의 함량[1]이 2배 이상 증가하였다. 아울러 DNA 이중나선 가닥의 파손(DNA double-strand breaks)에 의한 인산화형 H2AX (γ-H2AX)의 발현[11] 또한 PM_2.5 처리군에서 매우 증가되어(Fig. 5B 및 Fig. 5C) PM_2.5 가 각막상피세포에서 DNA 손상을 유발하였다는 Gao et al. [10]의 결과와 잘 일치된다. 그러나 PM_2.5 에 의한 8-OHdG의 생성과 γ-H2AX의 발현은 NAC이 전처리된 세포에서는 유의적으로 억제되어 각막상피세포에서 PM_2.5 에 의한 DNA 손상이 ROS 생성 의존적일 것이라는 가능성을 보여주었다. 아울러 조사된 5종의 후보추출물 전처리군에서도 PM_2.5 에 의한 DNA 손상이 모두 감소되어, 이들 추출물의 항산화력이 DNA 손상에 대한 보호능과 상호 연관성이 있음을 알 수 있다.

Fig. 5. Effects of ethanol extracts of selected 5 herbal medicine candidates on DNA damage in PM_2.5-treated hCECs. Cells were pre-treated with the indicated extracts for 1 hr, and then treated with 50 μg/ml PM_2.5 for 24 hr. (A) The levels of 8-OHdG contained in the culture medium were measured using an 8-OHdG ELISA kit. Data are expressed as the mean±SD (***p<0.001 when compared to control; ###p<0.001 when compared to PM_2.5 -treated cells). (B) Cells were stained with anti-γ-H2AX antibody and DAPI solution. The stained cells were pictured under a fluorescence microscope (scale bar; 25 μm). Each image is representative of at least three independent experiments. (C) The average optical density of γ-H2AX proteins in the images was quantitatively determined (***p<0.001 when compared to control; ###p<0.001 when compared to PM_2.5 -treated cells).

hCEC 세포에서 PM_2.5에 의한 인플라마솜 활성에 미치는 후보 물질 5종의 효능 비교

다양한 세포에서 미세먼지는 산화적 스트레스를 유도하면서 염증성 반응을 촉진시킬 수 있음이 선행 연구들을 통하여 밝혀졌다[12, 43, 44]. 세포 내 항상성 유지를 위한 면역반응 과정에서 외부 신호를 인식하는 수용체는 인플라마솜이라고 불리는 다단백질 복합체의 형성에 관여한다. 인플라마솜은 센서에 해당하는 NLRP3과 어댑터인 ASC 및 pro-caspase-1로 구성된다[41, 49]. 이 3가지 단백질복합체의 형성에 의해 pro-caspase-1에서 절단된 caspase-1 은 염증성 사이토카인인 interleukin (IL)-1β와 IL-18을 활성형으로의 전환과 세포 외로의 방출을 촉진하며, 나아가 pyroptotic 세포사멸을 유도한다[13, 19]. NLRP3 인플라마솜은 병원체, 바이러스, 박테리아 등을 포함한 다양한 자극에 의해 활성화될 수 있으며, 최근 미세먼지 또한 강력한 NLRP3 인플라마솜의 강력한 활성자로 보고된 바 있다 [39, 47]. 형광현미경적 관찰 및 Western blotting의 결과에 의하면, PM_2.5 는 hCEC 세포에서 ASC, caspase-1 및 NLRP3 의 발현을 증가시켰다(Fig. 6A - Fig. 6C). 그리고 대조군에 비하여, IL-1β와 IL-18의 발현도 PM_2.5가 처리된 세포에서 증가하였으며, 세포로부터 분비된 IL-1β의 정량적 분석에서도 유의적으로 증가가 관찰되었다(Fig. 6D 및 Fig. 6E). 이는 hCEC 세포에서 PM_2.5 처리에 의하여 인플라마솜이 활성화되었음을 의미한다. 또한, 염증성 매개 인자인 prostaglandin E의 생성에 핵심적인 인자인 cyclooxygen- 2 ase-2 (COX-2)의 발현과 IL-6 및 tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토카인의 발현도 PM_2.5 가 처리된 세포에서 증가되어 인플라마솜-매개 염증성 반응이 활성화되었음을 알 수 있다. 그러나 NAC이 전처리된 조건에서는 PM_2.5에 의한 인플라마솜 구성 요소들의 발현뿐만 아니라, 염증성 사이토카인의 발현 및 IL-1β의 분비도 감소되어 인플라마솜 활성화가 ROS 생성 의존적이라는 선행 연구의 결과들을 잘 일치한다[7, 18]. 따라서 선정된5종 후보 물질이 PM_2.5 에 의한 인플라마솜 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 석창포(AGS)와 황련(CCF) 추출물의 전처리군에서 억제 효과가 다소 높게 관찰되었으며, 염증성 반응에 미치는 영향은 추출물의 종류에 따라 차이가 났지만, 전반적으로 억제 효능을 보여주었다.

Fig. 6. Effects of ethanol extracts of selected 5 herbal medicine candidates on inflammation activity in PM_2.5-treated hCECs. Cells were pre-treated with the indicated extracts for 1 hr, and then treated with 50 μg/ml PM_2.5 for 24 hr. (A) The cells were stained with anti-ASC-1 (red) or anti-caspase-1 (green) and the nuclei were then stained with DAPI (blue) (scale bar 10 μm). (B and C) The average optical density of ASC (B) and caspase-1 proteins (C) in the images was quantitatively determined (***p<0.001 vs control; #p<0.05, ##p<0.01 and ###p<0.001 vs PM_2.5 -treated cells). (D) The ex- 2.5 pression of inflammsome components and pro-inflammatory cytokine proteins was evaluated by Western blot analysis with whole cell lysates. (E) The levels of IL-1β on cell supernatants was measured by an IL-1β ELIAS kit. Data are expressed as the mean±SD (***p<0.001 vs control; ###p<0.001 vs PM_2.5 -treated cells).

Fig. 7. Schematic diagram showing the blocking effect of herb- al drug candidates expected to protect cell damage by PM_2.5 treatment in hCECs.

본 연구에서는 미세먼지에 의한 안구 손상 방호 천연물의 발굴을 위하여 항산화 활성을 가진 12종의 약재를 선정하였으며, 그들 에탄올 추출물이 PM_2.5 에 의한 각막상피세포에 미치는 세포 독성 억제 여부를 조사하였다. 12 종의 추출물 중 hCEC 세포에 독성을 나타내지 않으면서 PM_2.5 처리에 의한 세포 생존율 억제를 유의적으로 차단하였던 후보 물질 5종[천문동(ACM), 석창포(AGS), 황련 (CCF) 감국(CIL) 및 금잔화(TE)]을 다시 선별하였다. 선정된 5종의 후보 물질을 대상으로 PM_2.5 에 의한 산화적 스트레스, 미토콘드리아 및 DNA 손상 억제 여부를 조사한 결과, 선별된 5종의 추출물은 종류에 따라 PM_2.5에 대한 세포 손상 차단 효과는 다소 차이가 있었지만, 산화적 스트레스 억제 활성이 높을수록 PM_2.5에 대한 방호 효과가 우수한 경향성을 보여주었으며, 이는 추출물은 인플라마솜의 활성 억제 가능성과 연관성이 있었다(Fig. 7). 최근 연구결과들에 의하면, 미세먼지에 의한 산화적 스트레스와 동반된 인플라마솜 매개 염증성 반응의 증가에 의한 안구의 손상은 노화 관련 황반변성(age-related macular degen- eration)과 시신경 퇴화를 포함한 시력 상실의 원인이 되고 있다[4, 16, 28]. 따라서 본 연구에서 제시한 5종의 후보 물질은 미세먼지에 의한 안구 손상의 개선에 활용 가능성이 높을 것이라 추측되며, 본 연구의 결과는 각 추출물에서의 유효 성분의 발굴과 그들의 추가적인 기전 연구를 수행할 예비 자료로 활용하고자 한다.

감사의 글

본 연구는 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단에서 시행한 기초연구사업(No. 2021R1A2C2009549) 및 ㈜비지엔케어의 연구비 지원으로 수행되었으며, 본 연구에 사용된 금잔화를 제공하여 주신 한뫼산야초꽃차연구원 전학연 대표님께 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.