A Study on the Cosmetic Materials of Abies nephrolepis MAX. Extracts with Whitening Activity

미백활성을 가진 분비나무(Abies nephrolepis MAX.) 추출물의 화장품 소재로써 연구

Abstract

We conducted a study on the whitening activity of Abies nephrolepis MAX. extracts. The electron-donating ability of 70% ethanol extracts from A. nephrolepis MAX. Stem (AN-S) and A. nephrolepis MAX. Leaf (AN-L) were found to be 89.4% and 90.9% at 1,000 ㎍/ml concentration, respectively. Their ABTS⁺ radical scavenging abilities were found to be 88.8% and 96% 500 ㎍/ml concentration, respectively. Their tyrosinase inhibitory effects were found to be 48.5% and 31.1% at 500 ㎍/ml concentration, respectively. Cell survival rates measured in B16F10 were examined with the AN-S and AN-L extracts. Results showed cell viabilities of 98.3% and 94.4% at 500 ㎍/ml concentration, respectively. The protein and mRNA expression inhibitory effects of AN-S and AN-L extracts were measured by Western blotting and RT-PCR, respectively, at 25, 50 and 100 ㎍/ml concentrations. The results of western blotting showed that the AN-S extract at 100 ㎍/ml concentration decreased the TRP-1 protein expression rate by 46%. The results of Western blotting also showed that the AN-L extract at 100 ㎍/ml concentration decreased the MITF protein expression rate was by 54.6%. Consequently, in the case of MITF, TRP-1, TRP-2, and tyrosinase, the amount of mRNA expressed decreased as the concentration of the extracts increased. Our results suggested that A. nephrolepis MAX. extracts can be used as a functional cosmetic material by confirming that they can be used as a whitening material.

본 연구에서는 분비나무의 생리활성 및 미백 활성을 검증하여 화장품 소재로써의 가능성을 검증하였다. 분비나무 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 전자공여능을 측정한 결과, 분비나무 줄기와 잎 추출물 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하여 각각 1,000 ㎍/ml 농도에서 89.4%, 90.9%의 높은 전자공여능을 나타내었다. ABTS⁺ radical scavenging activity assay 측정 결과, 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하였으며, 두 추출물 모두 1,000 ㎍/ml에서 약 90% 이상의 활성을 나타내었다. 미백 효과를 알아보기 위해 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, 분비나무 줄기와 잎 추출물은 1,000 ㎍/ml에서 각각 48.5%, 31.1%의 저해율을 나타냈으며 농도가 증가함에 따라 저해활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. MTT assay를 통해 세포 생존율을 확인한 결과, 멜라노마 세포(B16F10)에서 농도구간이 500 ㎍/ml 일 때 분비나무 줄기와 잎 추출물은 98.3%, 94.4%의 생존율을 나타내었다. 이에 따라 세포 관련 실험을 세포의 생존율이 100%에 가까운 25, 50, 100 ㎍/ml 농도로 진행하였다. B16F10 세포에 분비나무 추출물을 처리하여 단백질 발현을 측정한 결과, 분비나무 줄기 추출물은 TRP-1과 tyrosinase, 분비나무 잎 추출물은 MITF의 인자에서 대조군인 kojic acid 보다 단백질 발현 억제가 우수한 것을 확인할 수 있었다. B16F10 세포에 분비나무 추출물을 처리하여 mRNA 발현을 측정한 결과, 농도가 높아질수록 mRNA 발현양이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 분비나무 줄기 추출물은 tyrosinase의 인자에서 모든 농도구간이 대조군인 kojic acid 보다 mRNA 발현 억제가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 분비나무 추출물의 우수한 미백활성을 확인하였고, 기능성 활성이 우수하여 화장품 천연물 및 기능성 소재로써의 응용가능성을 확인할 수 있었다.

서 론

멜라닌(melanin)은 피부의 표피 중 기저층에 있는 멜라닌 생성 세포(melanocyte)의 멜라 노 좀(melanosome)에서 생성되며, 멜라닌 외에도 카로틴(carotene), 헤모글로빈 (hemoglobin) 등 피부에 존재하는 색소들은 많지만 멜라닌은 피부색을 결정하는데 가장 큰 영향을 준다고 보고되어있다. 자연계에 흔히 발견되는 페놀류의 고분자 물질로 흑갈색과 검은색을 띠는 단백질의 복합체가 멜라닌이며 [5, 6, 12], 멜라닌 합성은 자외선에 피부가 노출되었을 때 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase)의 한 종류인 ty- rosinase가 아미노산의 종류 중 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2 의 효소로 인해 하이드록시화(hydroxylation)하여 L-3, 4-di- hydroxy-L-phenylalanine (DOPA)를 생성한다. 그 후 산화된 DOPA는 DOPA quinone을 거쳐 산화되어 melanin을 합성하게 되며[16], microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 멜라닌 합성 조절 인자로써 멜라닌 합성 중 세포 증식 및 조절 기능의 역할을 한다[14]. 페오 멜라닌(pheo-melanin)과 유 멜라닌(eu-melanin)으로 나뉘는 것은 DOPA quinone으로 전환된 이후이며 페오 멜라닌은 DOPA quinone이 시스테인(cysteine)과 합성하여 생성되며, 유 멜라닌은 DOPA quinone이 DOPA chrome을 촉매, 산화되어 중합반응에 의해 고분자 합성으로 생성된다 [10]. 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논 (hydroquinone), 글루타치온(glutathione) 등은 미백효과를 갖고 있는 tyrosinase 활성 억제제로 알려져 있어 색소침착이 유발되어 나타나는 기미, 주근깨 등의 피부질환에 사용되는 성분이지만 안정도가 떨어지고 독성, 피부 자극성으로 인해 알레르기, 피부 트러블 등이 발생하는 경우가 있어 천연물을 함유한 기능성 화장품의 개발이 이루어지고 있다[4].

분비나무(Abies nephrolepis MAX.)는 구상나무(Abies koreana E.H.Wilson)와 함께 우리나라 아고산 지대(subal- pine zone)에서 자생하는 식물로써 아고산 지대는 고산대 (alpine zone)와 산지대(montane zone) 사이를 지칭하며, 기온이 낮고 강한 바람이 불며 불규칙한 적설량으로 인해 연교차가 크다. 최근 분비나무는 기후의 변화, 높은 산지의 기상 특성으로 인해 세계자연보전연맹(IUCN)에서 약관심종(Least Concern)으로 분류되어 분비나무를 보존하기 위해 침엽수종 증식, 복원 기술 개발을 위한 연구 활동을 추진 중이라고 보고된 바 있다[15].

본 논문에서는 우리나라 아고산 지대에서 자생하는 분비나무를 분비나무 줄기(Abies nephrolepis MAX. Stem) 와분비나무 잎(Abies nephrolepis MAX. Leaf) 두 가지 추출물로 나누어 생리활성 및 미백 활성을 검증하여 화장품 소재로써의 응용가능성을 연구하였다.

재료 및 방법

재료 및 시료의 추출

본 연구에 사용된 분비나무는 경기도산림환경연구소에서 2020년 9월에 채취하여 70% 에탄올 추출을 하였다. 채취한 시료를 건조시킨 후 분쇄하여 70% 에탄올을 시료 무게의 10배로 가하여 실온에서 24시간 침지 후 상등액과 침전물을 분리시켜 추출하였다. 여과지(Whatman No. 2)를사용해 시료 추출물을 여과하였으며 EYELA evaporator로 감압농축, 용매 제거 후 동결건조한 파우더 상태의 시료를 -20℃에서 보관하여 본 실험에 사용하였다.

시약 및 기기

전자공여능 측정 실험에는 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)과 ABTS⁺ radical 소거능 측정 실험에는 potassium persulfate 시약을 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서 구입 후 사용하였고, 2, 2'-azino-bis-(3-ethylbenzothia- zoline-6-sulphonic acid) 시약은 Wako Pure Chemical In- dustries. Ltd. (Japan)에서 구입 후 사용하였다. 미백 활성 억제 측정 실험의 L-3, 4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA), mushroom tyrosinase 시약 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 단백질 발현 효과 측정실험에 사용된 1차 항체인 β-actin, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase와 2차 항체인 anti-mouse는 Santacruz (CA, USA) 에서 구입 후 사용하였다. RT-PCR에 사용된 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase와 GAPDH primer는 Bionics (Seoul, Ko- rea)에서 제작하여 구입 후 사용하였다. ATCC (USA) 사에서 멜라노마 세포인 B16F10을 구입 후 사용하였다. 세포배양을 위해 Thermo Scientific Hyclone (USA)에서 pen- icillin/streptomycin, fetal bovine serum (FBS), trypsin, dul- becco`s modified eagle medium (DMEM), phosphate buffered saline (PBS)을 구입 후 사용하였으며, 세포 독성 측정 실험에 사용된 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 BioShop (Canada)에서 구입 후 사용하였다. 3-[4, 5-dimethylthiazol]- 2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 시약은 Sigma- Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입 후 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 Davinch-Chemi^™ Imager CAS-400 SM System (Davinch-K Co., Korea), pH meter (Mettler- Toledo AG, Switzerland), UV transilluminator (BioTop, Swit- zerland), CO₂ incubator (Vision Scientific, Korea), freeze drier (ILShin BioBase Co., Korea), microplate reader (Tecan, Aus- tria), microscope (Olympus, Japan), digital shaker (Daihan Scientific, Korea), centrifuge (Hanil Science Industrial Co., Korea), Mini-PROTEAN^® tetra cell (Bio-Rad, USA), micro centrifuge (Gyrozen, Korea), rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Mini Trans-Blot^® Cell (Bio-Rad, USA), autoclave (JS Research Inc., Korea), vortex (Scientific Indus- tries, Inc., USA), PCR (ASTEC Co., Japan)을 사용하였다.

실험방법

전자공여능 측정

전자공여능(EDA: electron donating abilities) 측정을 위해 Blois의 방법[1]을 변형하여 실험을 진행하였다. 1, 1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 60 μl와 추출물을 120 μ l 씩 넣어 혼합 후 15분간 반응시켜 microplate reader를 이용해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료 용액의 첨가구과 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

전자공여능(%) = (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가 구의 흡광도)×100

ABTS⁺ radical scavenging activity assay 측정 ABTS radical을 이용하여 ABTS⁺ decolorization assay 방법[17]에 의해 항산화력을 측정하였다. 2.45 mM potassium persulfate와 7 mM 2, 2-azino-bis-(3-ethyl-benthiazoline-6-sul- fonic acid)를 혼합한 뒤 실온에서 24시간 동안 반응 시켜 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS⁺를 형성시킨다. 이 후 에탄올에 희석한 후 ABTS⁺ 100 μl에 시료를 100 μl 첨가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS⁺ radical 소거능(%) = (1-시료첨가구의 흡광도/ 무첨가구의 흡광도)×100

Tyrosinase 저해활성 측정

미백 활성을 확인하기 위해 tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[18]에 따라 실험을 진행하였다. pH 6.8인 67 mM sodium phosphate buffer 80 μl를 이용해 10 mM L-DOPA (Sigma, USA)를 용해한 기질 액 40 μl와 시료용액 40 μl의 혼합 용액에 200 U/ml mushroom tyrosinase (Sigma, USA) 40 μl를 첨가시켜 37℃에서 10분간 반응시킨다. 그 후 생성된 DOPA chrome을 흡광도 492 nm에서 측정하였으며, tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구과 무 첨가 구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

저해율(%) = (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100

세포주 및 세포 배양

본 실험에 사용된 멜라노마 세포인 B16F10의 배양은 1%의 penicillin/streptomycin (100 U/ml)와 10%의 FBS를첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃의 5% CO₂ in- cubator에 적응시키며 계대 배양하였다.

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

MTT assay에 의한 세포 독성 측정은 Carmichael의 방법 [2]에 따라 실험을 진행하였다. 멜라노마 세포(B16F10)를 96-well plate에 1×10⁵ cells/well로 180 μl씩 분주하였고, 시료를 농도구간 별로 조제하여 20 μl를 첨가한 후 37℃의 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 여기에 MTT 용액을 2.5 mg/ml 농도로 제조 후 40 μl 첨가, 3시간 배양 후 배양액을 제거하고 DMSO 100 μl를 각 well당 가하여 실온에서 10분간 반응시켜 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도 측정을 실시하였다. 세포 생존율 측정은 시료 용액의 첨가구과 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포 생존율(%) = (시료첨가구의 흡광도/무첨가 구의 흡광도)×100

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

미백인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 인자들의 단백질 발현 활성을 알아보기 위해 cell line B16F10을 각각 100 mm tissue culture dish에 1×10⁶ cells/dish로 seeding 한 후 24시간 동안 배양하여 안정화시켰다. Cell line B16 F10에 추출물을 농도 구간별 처리한 배지로 24시간 배양한 후 PBS로 2회 washing하였다. Radio-immunoprecipita- tion assay (RIPA) buffer 10 ml에 complete mini 1 tab을 가한 80 μl로 용해하여 4℃, 13, 200 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 분리된 상층액은 BCA protein assay kit를 이용하여 정량 후 20 μl의 단백질을 질량의 차이를 이용한 10%의 SDS-PAGE상에서 전기영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질은 transfer 기기를 사용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮기고 skim milk와 TBST를 혼합하여 제조한 5% blocking buffer를 사용해 실온에서 1시간 blocking을 진행하였다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night 한 후, tris-buffered saline and tween 20 (TBST)를이용해 10분 간격으로 3회 washing한다. 2차 항체를 1:500 로 희석하여 실온에서 1시간 30분 반응시킨 후 3회 wash- ing하여 Davinch-Chemi^TM Imager CAS-400SM 기기를 이용해 밴드를 확인하였다.

Total RNA 분리 및 cDNA 합성

실험에 사용된 cell line B16F10을 100 mm culture dish에 1×10⁶ cells/dish로 cell을 seeding한 후 24시간 동안 배양하여 추출물을 농도별로 처리 후 24시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 배지의 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer 를 dish에 1 ml 씩 분주하여 세포를 lysis 하였고 chloroform 을 200 μl 씩 분주하여 20초 동안 위아래로 흔들어 반응시켜주었다. 그 후 13, 200 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층 액을 isopropanol 500 μl와 1:1로 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 이전과 동일한 조건으로 원심분리 하였고, 상층 액제 거 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate (DEPC) water를 각 e-tube에 1 ml씩 분주한 뒤 13, 200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 실온에서 건조시켰다. DEPC wa- ter를 50 μl씩 분주하여 녹인 뒤 96-well plate에 멸균수 195 μl와 RNA 5 μl를 총 양이 200 μl가 되도록 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ml) 1 μl, 추출한 RNA 2 μl와 nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 뒤 5X reaction buffer, RNasin inhibitor, MgCl₂, PCR nucleotide mix, nuclease free water, reverse transcriptase를 첨가 후 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃에서 15분간 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

본 실험에 사용된 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 ty- rosinase의 mRNA 발현 억제율을 알아보기 위하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 진행하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 5X green GoTaq flexi buffer, PCR nucleotide mix (10 mM), MgCl₂, primer, nuclease free water, GoTaq DNA polymerase, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞어준 후 PCR을 실행하였다. GAPDH은 96℃ 2분, 96℃ 10초, 64℃ 30초, 72℃ 1분(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃ 30 초, 58℃ 45초, 72℃ 1분(40 cycles), tyrosinase는 94℃ 30초, 60℃ 45초, 72℃ 45초(40 cycles)을 하였다. 그 후 PCR로 합성 시켜 10 mg/ml solution의 ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 35분간 전기영동하여 UV transilluminator를 사용하여 밴드를 확인, 분석 정량하였다.

Table 1. Sequence of the primers used for RT-PCR

결과 및 고찰

전자공여능 측정 결과

산화를 억제하는 목적으로 사용되는 전자공여능은 인체 내에서 노화 억제 작용으로 이용되어지고 있다[11]. 이에 따라 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 전자공여 능을 측정하였으며, DPPH는 환원되지 않은 상태에서는 자줏빛을 띄고 flavonoid 화합물, peptide에 의해 환원되어 자색이 탈색된 후 발색 정도에 따라 효과를 측정하는 원리를 갖고 있으며 환원된 후에는 노란색을 띈다 [1, 3].

이러한 방법으로 분비나무 추출물의 전자공여능을 측정한 결과, Fig. 1과 같이 분비나무 줄기와 잎 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 전자공여능이 증가하였고, 각각 1, 000 μg/ml 농도에서 89.4%, 90.9%의 효과를 나타내었다.

Fig. 1. Electron donating ability of Abies nephrolepis MAX. extract. The results were expressed as the average of triplicate samples. AS: Abies nephrolepis MAX. Stem, AL: Abies nephrolepis MAX. Leaf, Vit.C : L-ascorbic acid.

ABTS⁺radical scavenging activity assay 측정 결과

ABTS⁺ radical 소거능은 ABTS diammonium salt와 potassium persulfate의 반응으로 생성되는 양이온인 ABTS free radical (ABTS⁺)이 추출물 내 항산화 물질에 의해 파괴되어 radical의 색이 청록색에서 연한 녹색으로 탈색되는 원리를 갖는 방법이다[13].

분비나무 추출물의 ABTS⁺ radical scavenging activity as- say를 측정한 결과, Fig. 2와 같이 나타내었다. 분비나무줄기와 잎 추출물은 농도가 증가함에 따라 각각 500 μg/ml 에서 88.8%, 96%의 우수한 소거능을 나타내었다.

Fig. 2. ABTS⁺ radical scavenging ability of Abies nephrolepis MAX. extract. The results were expressed as the aver-age of triplicate samples. AS: Abies nephrolepis MAX. Stem, AL: Abies nephrolepis MAX. Leaf, Vit.C: L-ascorbic acid.

Tyrosinase 저해활성 측정 결과

Tyrosin을 기질로 하여 DOPA와 DOPA quinone을 거쳐 tyrosinase는 melanocyte의 유사분열이 일어나 활성화된다. 그 후 tyrosinase 합성이 촉진되고 melanin이 과생성 되어 피부의 표피 밖으로 배출되면 기미, 주근깨와 같은 색소침착이 생기게 된다. 이를 방지하기 위하여 피부 미백에 관한 연구가 활발해지고 있으며, 그 중 tyrosinase 저해 활성 측정법은 유용한 평가법으로 인정받고 있다[7-9]. 분비나무 추출물의 tyrosinase 저해활성 측정 결과, Fig. 3과 같이 나타내었다. 분비나무 줄기와 잎 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었고, 각각 1, 000 μg/ml의 농도에서 48.5%, 31.1%의 저해 활성을 나타내었다.

Fig. 3. Inhibition rate of extract from Abies nephrolepis MAX. on tyrosinase. The results were expressed as the aver-age of triplicate samples. AS: Abies nephrolepis MAX. Stem, AL: Abies nephrolepis MAX. Leaf, Vit.C: L-ascorbic acid.

MTT assay에 의한 세포독성 측정 결과

분비나무 추출물에 대한 멜라노마 세포인 B16F10에서의 세포 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과, Fig. 4와 같이 나타내었다. 500 μg/ml의 농도에서 각각 98.3%, 94.4%의 세포 생존율을 나타내었으며 이에 본 실험에서는 시료 용액을 100%에 가까운 세포 생존율이 확인된 25, 50, 100 μg/ml의 농도구간으로 설정하여 실험을 진행하였다.

Fig. 4. Cell viability of extract from Abies nephrolepis MAX. on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells were incubated for 24 hr in DMEM, the cells were treated with various concentrations of Abies nephrolepis MAX. for 24 hr. Result are means±SD of triplicate data. AS: Abies nephrolepis MAX. Stem, AL: Abies nephrolepis MAX. Leaf.

멜라노마세포(B16F10)에서의 MITF, TRP-1, TRP-2,tyrosinase 단백질 발현에 미치는 영향

분비나무 줄기와 잎 추출물에 대한 미백관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 인자의 단백질 발현 억제를 측정하기 위해 Western blot을 진행하였다. 그 결과를 Fig. 5∼Fig. 6에 나타내었다. 이때 β-actin이 세포의 다양한 조건에서도 발현의 정도 차이가 매우 적어 house keeping gene인 positive control로 사용하였으며, B16F10 세포에 추출물을 25, 50, 100 μg/ml의 농도별로 처리하였다. MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 단백질 발현은 농도가 증가함에 따라 단백질 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히 분비나무 줄기 추출물은 TRP-1과 tyrosinase 인자에서, 분비나무 잎 추출물은 MITF의 인자에서 대조군인 kojic acid 보다 단백질 발현 억제가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 멜라노마세포(B16F10)에서MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의mRNA발현에미치는영향

Fig. 5. MITF, TRP-1, TRP-2 and tyrosinase protein expression rate of extract from Abies nephrolepis MAX. Stem on melanoma cell (B16F10). B16F10 cells were incubated for 24 hr in DMEM, were treated with various concentrations of Abies nephrolepis MAX. Stem for 24 hr and then total protein was isolated. Con: control, in B16F10 cells treated with α-MSH, Nor: normal, in B16F10 cells not treated with α-MSH. The results were expressed as the average of triplicate samples.

Fig. 6. MITF, TRP-1, TRP-2 and tyrosinase protein expression rate of extract from Abies nephrolepis MAX. Leaf on melanoma cell (B16F10). B16F10 cells were incubated for 24 hr in DMEM, were treated with various concentrations of Abies nephrolepis MAX. Leaf for 24 hr and then total protein was isolated. Con: control, in B16F10 cells treated with α-MSH, Nor: normal, in B16F10 cells not treated with α-MSH. The results were expressed as the average of triplicate samples.

분비나무 줄기와 잎 추출물의 미백관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 인자의 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. 이때 GAPDH을세포의 다양한 조건에서도 발현의 정도 차이가 매우 적은 house keeping gene인 positive control로 사용하였으며, mRNA 발현 억제를 Fig. 7∼Fig. 8과 같이 확인하였다. B16F10 cell에 분비나무 추출물을 25, 50, 100 μg/ml의 농도별로 처리하였다. 그 결과, MITF, TRP-1, TRP-2, ty- rosinase의 인자는 추출물의 농도가 높아질수록 mRNA 발현양이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 분비나무 줄기 추출물은 tyrosinase의 인자에서 모든 농도 구간 이대 조 군인 kojic acid 보다 mRNA 발현 억제가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 7. MITF, TRP-1, TRP-2 and tyrosinase mRNA expression rate of extract from Abies nephrolepis MAX. Stem on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr. The cells were treated Abies nephrolepis MAX. Stem extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, in B16F10 cells treated with α-MSH, Nor: normal, in B16F10 cells not treated with α-MSH. The results were expressed as the average of triplicate samples.

Fig. 8. MITF, TRP-1, TRP-2 and tyrosinase protein expression rate of extract from Abies nephrolepis MAX. Leaf on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr. The cells were treated Abies nephrolepis MAX. Leaf extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, in B16F10 cells treated with α-MSH, Nor: normal, in B16F10 cells not treated with α-MSH. The results were expressed as the average of triplicate samples.