IKKγ Facilitates the Activation of NF-κB by Hsp90

Hsp90에 의한 NF-κB의 활성화를 촉진하는 IKKγ의 역할

Abstract

NF-κB acts as a critical transcription factor in inflammation and innate immunity, and it is also closely involved in cell survival and tumorigenesis via induction of anti-apoptotic genes. In these processes, NF-κB cooperates with multiple other signaling molecules and pathways, and although many studies have demonstrated that Hsp90 regulates NF-κB activity, the exact mechanism is unclear. In this study, we investigated the relationship between Hsp90 and IKKγ in the regulation of NF-κB using expression plasmids of IKK complex components. Wild-type and deletion mutants of IKKγ were expressed together with Hsp90, and the combined regulatory effect of Hsp90 and IKKγ on NF-κB activation was assayed. The results show that Hsp90 activates NF-κB by promoting the phosphorylation and degradation of IκBα and that activation of NF-κB by NIK and LPS was increased by Hsp90. IKKγ elevated the effect of Hsp90 on NF-κB activation by increasing phosphorylation and degradation of IκBα. The positive regulation on NF-κB by Hsp90 and IKKγ was also proved in analysis with IKKβ-EE, the constitutively active form of IKKβ. In experiments with the deletion mutants of IKKγ, the N-terminal IKKβ binding domain, C-terminal leucine zipper, and zinc finger domains of IKKγ were found not necessary for the positive regulation of NF-κB activity. Additionally, the expression of pro-inflammatory cytokines was synergistically elevated by Hsp90 and IKKγ. These results indicate that inhibiting the interaction between Hsp90 and IKKγ is a possible strategic method for controlling NF-κB and related diseases.

NF-κB는 염증과 선천성 면역에 중요한 전사인자이며 anti-apoptotic gene을 유도하여 세포의 생존과 발암에도 깊이 연관되어 있으며 많은 신호전달분자 및 신호전달회로와 연결되어있다. 한편, Hsp90는 NF-κB의 활성을 조절한다는 보고가 이루어졌으나 그 구체적인 기전은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 IKK compelx를 구성하는 인자들의 발현 plasmid를 이용하여 NF-κB의 활성조절에서 Hsp90와 IKKγ의 연관성 및 역할을 연구하였다. 그 결과 Hsp90는 IκBα의 인산화와 분해를 촉진하여 NF-κB를 활성화시켰고, NIK과 LPS에 의한 NF-κB의 활성화는 Hsp90에 의해 더욱 활성이 증가하였다. IKKγ는 Hsp90에 의해 증가된 IκBα의 인산화와 분해를 더욱 촉진함으로써 Hsp90의 NF-κB 활성화 작용을 상승시켰다. 이러한 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB의 활성화 현상은 항상 활성화 된 상태를 유지하는 IKKβ-EE mutant를 이용한 검토에서도 입증되었다. 또한 IKKγ의 deletion mutant를 이용한 검토에서 IKKγ의 N-말단에 위치하는 IKKβ 결합부위와 C-말단에 위치하는 leucine zipper 및 zinc finger 부위는 IKKγ와 Hsp90의 NF-κB에 대한 상호협력적 촉진작용에 필요하지 않았다. 또한 Hsp90에 의해 촉진된 세포내 pro-inflammatory cytokine들의 발현은 IKKγ에 의해 더욱 상승하였다. 이러한 결과로부터 Hsp90와 IKKγ의 상호작용을 차단한다면 NF-κB의 과다활성으로 인한 질병의 예방과 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

서 론

Hsp90 (Heat shock protein 90)는 진핵생물에 필수적인 ATP 의존성 샤페론이며 다양한 단백질의 활성화와 안정화에 관여한다. Hsp90가 작용하는 단백질에는 tyrosine kinase, Akt, NF-κB를 비롯한 다양한 세포 주기 조절인자와 신호전달 단백질이 있으며[9] 이러한 단백질은 악성종양의 생존과 사멸, 전이, 혈관 증식 등에 관여한다. 그러므로 Hsp90를 표적으로 억제하게 되면 악성종양이 개선된다고 보고되었다[6, 23, 25, 28].

한편, NF-κB는 면역 시스템과 관련된 유전자의 발현을 조 절하는 전사 인자이다. 면역 시스템을 구성하는 세포와 조직 의 유지뿐만 아니라 면역의 발달, 면역 반응, 염증 및 암의 발생과 유지에 중요한 역할을 하는 전사인자이다[8, 19, 22]. NF-κB는 IκB kinase (inhibitor of nuclear factor-κB kinase)에 의해 조절되며 IκB가 인산화를 거쳐 분해됨에 따라 세포질에 머물러 있던 NF-κB가 핵 속으로 들어가 활성화된다[16, 17]. IκB kinase외에도 NF-κB를 활성화시키는 cytokine에는 TNFα, IL-1, IL-6 등이 있고 bacteria의 LPS (lipopolysaccharide) 또한 NF-κB를 활성화 시킨다[2]. NF-κB에 의해 생산이 유도되 는 효소에는 대표적으로 COX-2, iNOS가 있으며 이들은 NF-κ B활성화와 더불어 체내에서 만성 염증의 유발 및 악성종양의 전이 뿐 아니라 cytokine storm도 유발하여 각종 합병증을 유 발하기도 한다[2, 7, 26].

NF-κB의 활성화에 핵심역할을 하는 IKK complex에는 IκB kinase로서 IKKα와 IKKβ가 있고 조절 인자인 IKKγ (NEMO) 와 그 외 여러 가지 단백질이 포함되어 있다. IKKγ는 IKKα, IKKβ와 달리 kinase 활성이 없는 단백질이지만 C 말단에 CCD (coiled-coil domain)와 LZD (leucine zipper domain)를 가지고 있어 단백질 간의 상호작용이 이루어져 IKK complex 에 구조적인 안정성을 제공한다[4, 12, 16].

Hsp90는 NF-κB 활성화 경로에 중요한 역할을 하고 Hsp90 의 세포 내 과발현은 NF-κB의 활성 증가와 함께 여러가지 종 양에서 유의하게 나타난다고 알려져 있고[18], IKKγ는 NF-κB 의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있으나[1, 16] Hsp90와 IKKγ의 상호작용 및 연관성에 대해서는 명확하게 알려지지 않았다. 따라서 본 연구는 Hsp90와 IKKγ의 NF-κB 활성화 과 정에서의 역할을 확인하고 Hsp90와 IKKγ의 상호작용에 의한 NF-κB의 활성화 기전을 규명하여 NF-κB의 과다 활성에 의해 유발되는 염증 질환과 암의 발생을 예방하고 치료하는 데 도 움을 주고자 하였다.

재료 및 방법

세포배양 및 transfection

쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 실험에 사용하였으며 세포의 배양은 FBS (Fetal Bovine Serum)가 10% 함유된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. FBS와 DMEM은 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)의 제품을 사용하였다. 사용 한 발현 plasmid는 사람의 IKKβ [10], IKKβ-EE [15], NIK [10], Hsp90 [18]의 cDNA와 mouse IKKγ [10]의 cDNA를 pCMV5 벡터에 cloning한 것이며, plasmid DNA의 세포 내 도입을 위한 transfection은 FuGENE6Ⓡ (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 lipofection을 진행하였다. Plasmid DNA를 serum free DMEM과 FuGENE6가 20:1의 비율로 혼합된 혼합 액에 섞고 실온에서 20분 동안 반응시켜 복합체를 형성시킨 후 60~70%의 밀도로 배양된 RAW264.7 세포에 적하하고 배양 하였다.

세포추출물(total cell lysate)의 제조

배양한 RAW264.7 세포를 PBS (phosphate-buffered saline) 로 두 번 세척한 후 1,000 rpm, 3분 동안 원심분리하여 harvest 하고 Total lysis buffer [20 mM Hepes (pH7.9), 25% glycerol, 450 mM NaCl, 0.4 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF (complete EDTA free), 1% NP-40]로 suspension하여 on ice에 서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 12,000 rpm, 4℃, 15분 동안 원심분리하여 상등액을 수거하였다.

Luciferase assay

Luciferase gene을 포함한 NF-κB의 reporter plasmid는 pNL3.2-κB-RE (Promega, code N1111)를 사용하였으며 이는 Luciferase promoter 부위에 5개의 NF-κB 결합 부위를 가지고 있다. Luciferase activity의 측정은 Nano-GloⓇ Substrate (Promega)를 Nano-GloⓇ buffer (Promega)에 100배 희석하여 사 용하였으며 cell lysate는 96-well plate에 50 μl씩 분주하여 사 용하였다. Substrate는 Luminoskan (Thermofisher, USA)을 이용하여 노즐을 70% Ethanol로 10회 wash하고 멸균 증류수 로 10회 세척한 후 투여하였다. 효소반응은 50 μl씩 substrate 가 분주되도록 하였으며 luciferase activity를 10초 간격으로 측정하였다.

Western blotting

Total cell lysate를 Bradford assay로 단백질을 정량한 후 4X SDS sample buffer (1 M Tris-HCl, 10% Glycerol, 10% β -Mercaptoethanol, 2% SDS, 0.1% Bromophenol blue)를 첨가 하여 6분간 100℃에서 denaturation시키고 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 한 후, 실온에서 90 V, 2시간 동 안 nitrocellulose membrane (Amersham, UK)에 electro transfer하였다. 그 후 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 TBS-T [Tris buffered saline (0.2 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 485.4 mM HCl)] 용액으로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. Membrane을 1차 항체와 실온에서 3시간 동 안 반응시키고 TBS-T 용액으로 3번 세척한 후 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시 켰다. 반응시킨 membrane을 TBS-T로 3번 세척한 후 Enhanced Chemiluminscence (ECL, Amersham Corp., Arlington Heights, UL, USA)로 반응시킨 후 Amersham Imager 600 (GE healthcare Life Science, Germany)을 이용하여 결과를 확인하였다. Membrane의 strip은 stripping buffer [6.25 mM Tris-HCl (pH6.7), 2% SDS, 100 mM 2-mercaptoethanol]를 이용하여 5 0℃에서 30분 동안 처리한 후 TBS-T 용액으로 10분씩 2회 세척 하였다. 사용한 1차 항체는 anti-P-IκBα monoclonal antibody (sc-8404), anti-IκBα polyclonal antibody (sc-371), anti-COX-2 polyclonal antibody (sc-1745), anti-iNOS polyclonal antibody (sc-651), anti-HA-probe monoclonal antibody (sc-7392), anti-Actin polyclonal antibody (sc-1616) (Santa Cruz Bio Technology, CA, USA), anti-Flag tag polyclonal antibody (ab1162), anti-Myc tag polyclonal antibody (ab9106) (Abcam, Cambridge, UK)을 제조사의 사용법에 따라 사용하였다.

RT-PCR

세포를 TrizolⓇ (Ambion, CA, USA)용액으로 처리하여 total RNA를 분리한 후 Accupower Roketscript cycle RT premix (Bioneer Corp., Daejeon, Korea)을 이용하여 cDNA를 합 성한 후 PCR에 이용하였다. PCR조건은 94℃ 3분간 predenature하고 94℃ 30초 denature, 60℃ 30초 annealing, 72℃ 1분 extension을 30 cycle 거친 후, 72℃ 10분으로 완료하였다. PCR 의 결과는 2.5% agarose gel에서 확인하였다. 사용한 primer는 Table 1과 같다.

Table 1. Primer sequences for RT-PCR

F : forword R : reverse

통계처리

실험은 3회 반복하였고, 결과는 Graphpad Prism5를 이용 하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타내었다. One way ANOVA와 tukey’s test를 이용하여 통계적으로 분석하였으 며, p값이 0.05 이하이면 유의성이 있다고 판단하였다.

결 과

NF-κB의 활성화에 대한 Hsp90의 영향

NIK (NF-κB inducing kinase)은 IKKβ를 인산화하여 활성 화시키는 kinase이며 IKKβ는 IKK complex의 구성성분으로 NF-κB의 inhibitor인 IκB를 인산화시켜 분해를 유도하고 NF-κB 를 활성화시키는 kinase이다[2]. NF-κB의 활성화에서 Hsp90 의 영향을 알아보기 위해 Luciferase gene의 promoter 부위에 5개의 NF-κB 결합부위를 가진 pNL3.2-κB-RE Luciferase reporter plasmid를 이용하였다. 그 결과 예상한대로 NIK은 NFκB를 활성화시켰으며 IKKβ가 과량 발현될 때 NIK에 의한 NF-κB의 활성은 더욱 증가하였다(Fig. 1A lane 3, 4). 또한 Hsp90도 NF-κB를 활성화시켰으며 IKKβ가 과량발현될 때 활 성화 효과가 증가하였다(Fig. 1A lane 5, 6). 이로부터 NIK과 마찬가지로 Hsp90도 IKKβ를 경유하는 NF-κB회로를 활성화 시킴을 알 수 있었다. 이와 더불어 NF-κB의 inhibitor인 IκBα 의 인산화와 분해를 검토한 결과에서도 NIK과 Hsp90는 IκBα 의 인산화와 분해를 촉진하였고(Fig. 1B lane 3, 5) IKKβ가 과 량발현 될 때 인산화와 분해는 더욱 증가하였다(Fig. 1B lane 4, 6). 이 결과로부터 Hsp90는 NIK과 마찬가지로 IKKβ에 의 한 IκBα의 인산화와 분해를 통한 NF-κB의 활성화를 촉진함을 알 수 있었고, 또한 Hsp90가 IKKβ와 IKKγ를 포함하는 IKK complex에 작용하여 NF-κB를 활성화시킬 가능성이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1. Effect of Hsp90 on the activation of NF-κB. RAW264.7 cells were co-transfected with pNL3.2-κB-RE reporter plasmid and the expression plasmids of IKKβ, NIK, Hsp90 as indicated. Luciferase assay was performed after 40 hr of transfection. (A) (mean ± SD, n=3, **p<0.01, ***p<0.001), and the proteins in total cell lysates were detected by Western blotting (B).

NIK에 의한 NF-κB의 활성화에서 Hsp90 및 IKKγ의 영향

세포 외부로부터 NF-κB를 활성화시키는 자극이 작용하였 을 때 NF-κB의 신호전달회로에서 가장 초기에 작용하는 upstream kinase인 NIK이 활성화되어 IKKβ의 인산화 및 활성화 가 일어나고 이것이 IκBα를 인산화 및 분해하여 NF-κB를 핵 내로 이동시킨다[13, 19]. 이에 따라 NIK에 의해 NF-κB가 활성 화 될 때 Hsp90는 어떠한 영향을 미치는지, 이 때 IKK complex에서 조절인자로 작용하는 IKKγ는 어떤 역할을 하는지 알아보기 위해 IKKβ, NIK, Hsp90, IKKγ의 발현 plasmid를 세포에 도입하고 luciferase reporter gene assay를 실시하였 다. 그 결과, IKKγ는 NIK에 의한 NF-κB의 활성화에 영향이 없었으나(Fig. 2A lane 3, 5), Hsp90는 NIK에 의한 NF-κB의 활성화를 약하게 상승시켰으며(Fig. 2A lane 3, 4), 이러한 상승 작용은 IKKγ를 과발현 시켰을 때 더욱 증가하였다(Fig. 2A lane 4, 6). 이러한 Hsp90와 IKKγ의 상호협력적인 NF-κB의 활성화를 IκBα의 인산화와 분해로 확인한 결과 Hsp90는 NIK 에 의한 IκBα의 인산화와 분해를 촉진하였고(Fig. 2B lane 3, 4), 이러한 Hsp90의 촉진효과는 IKKγ가 과량 발현되었을 때 더욱 증가하였다(Fig. 2B lane 5, 6). 이 결과로부터 IKKγ는 HSP90에 의한 NF-κB의 활성화를 더욱 상승시킴을 알 수 있었 다. 아울러 이러한 Hsp90와 IKKγ에 의하여 NF-κB가 활성화 되었을 때 NF-κB의 대표적인 target 유전자인 iNOS와 COX-2 의 발현변화를 검토한 결과 Hsp90는 NIK에 의한 iNOS와 COX-2의 발현증가를 더욱 촉진하였고(Fig. 2B lane 3, 4), Hsp90가 IKKγ와 함께 발현되었을 때 iNOS와 COX-2의 발현 이 더욱 상승함을 확인함으로써 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB 의 활성증가는 NF-κB 관련 유전자의 발현증가로 이어짐을 알 수 있었다(Fig. 2B lane 4, 6).

Fig. 2. Synergistic effect of Hsp90 and IKKγ on the activation of NF-κB by NIK. RAW264.7 cells were co-transfected with pNL3.2-κB-RE and the expression plasmids as indicated. Luciferase assay was performed after 40 hr of transfection. (A) (mean ± SD, *p<0.01, **p<0.001), and the proteins in total cell lysates were detected by Western blotting (B).

LPS에 의한 NF-κB의 활성화에서 Hsp90 및 IKKγ의 작용

세포 외부로부터 NF-κB의 활성화 자극이 작용하였을 때 NF-κB의 활성화에 미치는 Hsp90와 IKKγ의 영향을 알아보기 위해 Hsp90와 IKKγ의 발현 plasmid를 세포 내에 도입하고 NF-κB의 대표적인 외부 활성화인자인 bacterial LPS (lipopolysaccharide)를 처리한 후 luciferase assay를 실시하였다. 그 결과 LPS에 의해 NF-κB가 활성화되었고(Fig. 3A lane 2), Hsp90는 LPS에 의한 NF-κB의 활성화를 촉진시켰으며(Fig. 3A lane 3, 4), 이는 IKKγ에 의해 더욱 상승하였다(Fig. 3A lane 4, 6). 또한 Hsp90와 IKKγ의 동시발현은 세포 내 IκBα의 인산 화 및 분해를 더욱 상승시키는 결과를 나타내어(Fig. 3B lane 4, 6) 세포 외부로부터 작용하는 요인에 의한 NF-κB의 활성화 에도 Hsp90와 IKKγ는 상호협력적으로 높은 상승효과를 나타 내는 것으로 확인되었다. 또한 LPS에 의한 NF-κB의 활성화로 인하여 발현이 증가하는 대표적인 유전자로 알려진 iNOS와 COX-2 역시 Hsp90와 IKKγ의 동시발현에 의해 발현이 증가하 는 것으로 나타났다(Fig. 3B).

Fig. 3. Synergistic effect of Hsp90 and IKKγ on the activation of NF-κB by LPS. RAW264.7 cells were co-transfected with indicated plasmids and after 35 hr, the cells were treated with 0.5 μg/ ml of LPS. Luciferase assay (A) (mean ± SD, *p<0.01, **p<0.001) and Western blotting (B) were performed after 3 hr of treatment with LPS.

IKKβ의 활성형 mutant를 이용한 Hsp90와 IKKγ의 작용검토

세포 내 IKKβ는 평상시에는 활성이 없는 상태로 있다가 세포 외부에서 NF-κB의 활성화 요인이 작용하면 NIK, MEKK 등의 upstream kinase에 의해 인산화되어 활성을 나타낸다 [15, 21]. 이에 비해 IKKβ-EE는 IKKβ의 activation loop의 ser177과 ser181부위를 glutamate로 치환하여 upstream kinase가 없어도 항상 활성화된 상태를 나타내는 IKKβ의 활성형 mutant이다[15]. 이러한 IKKβ-EE에 대한 Hsp90와 IKKγ의 작 용을 검토한 결과 IKKβ-EE는 IKKβ와 달리 NIK이나 LPS가 없어도 높은 NF-κB활성을 나타내었으며(Fig. 4A lane 3) Hsp90와 IKKγ가 동시에 발현되었을 때 가장 높은 NF-κB의 활성이 나타났고(Fig. 4A lane 6), IκBα의 인산화 및 분해도 가장 많이 일어났다(Fig. 4B lane 6). 또한 IKKβ-EE에 의한 iNOS와 COX-2의 발현 증가도 Hsp90와 IKKγ가 동시에 발현 되었을 때 가장 높게 나타났다(Fig. 4B lane 6). 이러한 결과로 부터 Hsp90와 IKKγ의 상호작용에 의한 NF-κB의 활성화 작용 은 upstream kinase를 활성화하는 것이 아니라 IKK complex 에 직접 작용하는 것임을 알 수 있었다.

Fig. 4. Synergistic effect of Hsp90 and IKKγ on the NF-κB activation triggered by IKKβ-EE. RAW264.7 cells were co-transfected with indicated plasmids and after 40 hr, luciferase assay (A) (mean ± SD, *p<0.05, **p<0.01, ***p< 0.001) and Western blotting (B) were performed.

IKKγ의 deletion mutant를 활용한 Hsp90와 IKKγ의 상호 작용 기전 검토

위의 결과에서 Hsp90는 NF-κB를 활성화시켰고 IKKγ는 Hsp90의 활성화 작용을 더욱 상승시키는 것으로 나타났다. 그러므로 NF-κB의 활성화 과정에서 Hsp90와 IKKγ의 상호작 용 기전을 더욱 상세히 검토하기 위하여 IKKγ의 deletion mutant를 사용하였다. 사용한 mutant는 mouse IKKγ의 N-말단 의 IKKβ 결합 부위 100아미노산이 결손된 ΔN과 C-말단의 leucine zipper (LZ)부위와 zinc finger (ZF) 부위를 포함하는 100아미노산이 결손된 ΔC를 사용하였다(Fig. 5) [10]. C-말단 의 LZ와 ZF 부위는 IKKγ의 결합을 유도하여 고분자 복합체 형성에 필요한 부위이다[12]. pNL3.2-κB-RE reporter plasmid 와 IKKβ, NIK, Hsp90 및 IKKγ의 wild type (WT), ΔC, ΔN의 발현 plasmid를 RAW264.7 세포에 co-transfection한 후 luciferase assay를 실시한 결과 Hsp90는 NIK에 의한 NF-κB의 활성화를 상승시켰고 IKKγ의 wild type, ΔC, ΔN은 모두 Hsp90의 상승 작용을 더욱 증가시켰다(Fig. 6A). 이러한 결과 를 IκBα의 인산화와 분해를 통하여 확인한 결과 Hsp90는 NIK 에 의해 유도된 IκBα의 인산화 및 분해를 촉진하였고 IKKγ의 wild type, ΔC, ΔN은 모두 Hsp90의 촉진 작용을 더욱 상승시 켰다(Fig. 6B lane 5, 6, 7). 이러한 IKKγ의 상승작용은 wild type, ΔC, ΔN에서 거의 동일하게 나타났으며 이 결과로부터 IKKγ의 N-말단에 의한 IKKβ와 IKKγ의 결합 및 C-말단에 의 한 IKKγ의 고분자 복합체 형성은 Hsp90와의 상호작용에 관여 하지 않음을 알 수 있었다.

Fig. 5. The structure of wild type, N-terminal and C-terminal deletion mutants of mouse IKKγ. IKKβ binding domain at N-terminal and leucine zipper domain (LZ), zinc finger domain (ZF) at C-terminal were shown. The numbers indicate the number of amino acids.

Hsp90와 IKKγ에 의한 pro-inflammatory cytokines의 발 현증가

NF-κB의 활성이 증가하면 인체 내 염증이 발생하는 것으로 알려져 있으며 이러한 염증은 NF-κB가 염증을 유발하는 proinflammatory cytokines의 발현을 증가시키는 것이 원인으로 알려져있다[11, 19]. 그러므로 Hsp90와 IKKγ가 pro-inflammatory cytokines의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 검토하였다. RT-PCR을 이용하여 각 단백질의 mRNA양을 측정한 결과 NIK에 의한 NF-κB의 활성화로 인해 pro-inflammatory cytokines의 발현이 증가하였으며(Fig. 7 lane 3) Hsp90는 이러한 발현 증가를 촉진하였고(Fig. 7 lane 4) Hsp90와 IKKγ가 동시 에 발현되었을 때 pro-inflammatory cytokines의 발현은 가장 많이 상승하였다(Fig. 7 lane 6). 이상의 결과로부터 IKKγ는 Hsp90의 NF-κB 활성화 작용을 더욱 상승시키고 이는 인체 내 pro-inflammatory cytokines의 발현을 증가시켜 염증을 비 롯한 관련 질병을 유발할 수 있음을 알 수 있었다.

고 찰

NF-κB는 세포에 가해지는 다양한 stress에 대한 방어작용 을 위해 면역세포를 활성화하는 것이 주된 역할로 알려져 있 으나 세포의 사멸과 증식, 분화 및 발암 등 광범위한 세포 변화 에 관여함이 밝혀지면서 NF-κB 활성의 적절한 조절이 각종 질병의 예방과 치료를 위해 중요함이 강조되고 있다[3, 5, 11]. IKKγ는 IKK complex의 구성성분으로 kinase활성은 없으나 NF-κB의 활성화 경로의 조절에 중추적인 역할을 하고 있다. IKKγ가 결핍 된 세포는 고분자 IKK complex가 형성되지 않고 TNF-α, LPS 등 세포 외부 인자에 의한 NF-κB의 활성화가 일 어나지 않는 것으로 알려져있다[10, 14, 27].

한편, Hsp90는 chaperon 단백질로서 세포 내 약 300종류의 단백질이 Hsp90의 조절을 받는 것으로 알려져있으며 IκB kinase를 비롯하여 NF-κB 신호전달 회로에 관여하는 kinase들도 Hsp90의 조절을 받는 것으로 밝혀져 있다[20]. 이에 따라 Hsp90의 inhibitor가 NF-κB의 활성을 억제한다는 연구결과도 다수 보고되었다[24, 25].

본 연구에서는 Hsp90에 의한 NF-κB의 활성 조절 기전을 명확히 하기 위해 Hsp90와 IKKγ의 상호연관성을 검토하였다. 그 결과 Hsp90는 NIK과 LPS에 의한 NF-κB의 활성화를 증가 시켰고 IKKγ는 이러한 증가를 더욱 가중시켰다. Hsp90에 의 한 NF-κB의 활성화 작용이 IKKγ의 발현 plasmid의 도입으로 IKKγ가 과발현 될 때 더욱 상승하는 것으로 보아 Hsp90는 IKKγ와 상호작용하여 NF-κB를 활성화시킬 가능성이 크다는 결론을 얻을 수 있었다(Fig. 2, Fig. 3). 또한 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB의 활성화가 IκBα의 인산화 및 분해의 증가에 의한 것으로 나타나 Hsp90와 IKKγ가 IκBα의 인산화에 직접 관여하 는 IKK complex의 활성을 증가시킴을 알 수 있었다. 또한 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κB의 활성화가 항상 활성화된 상태 를 유지하는 IKKβ-EE mutant에서도 동일하게 나타난 것으로 보아 Hsp90가 IKKβ를 활성화시키는 upstream kinase에 작용 하는 것이 아니라 IKKγ complex에 직접 작용하는 것이며 이 때 IKK complex 내에있는 IKKγ가 Hsp90의 작용을 상승시킴 을 알 수 있었다(Fig. 4). 아울러, IKKγ의 N-말단의 IKKβ 결합 부위와 C-말단의 leucine zipper 및 zinc finger 부위가 결손된 IKKγ에서도 NF-κB의 활성 증가가 나타난 것으로 보아(Fig. 6) IKKγ는 IKKβ와 결합하지 않은 상태로, 또한 고분자 복합체 를 형성하지 않은 상태에서도 Hsp90와 상호작용 및 NF-κB를 활성화 함을 알 수 있었다. 그리고 Hsp90와 IKKγ에 의한 NF-κ B의 활성증가가 실제 NF-κB의 target 유전자의 발현 증가로 이어지는지 검토한 결과 iNOS, COX-2, TNF-α를 비롯한 여러 종류의 pro-inflammatory cytokines의 발현 증가가 확인되어 (Fig. 7) Hsp90의 비정상적 발현 증가는 인체 내 다양한 염증의 유발과 그로인한 염증성 암의 발생을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 그러므로 Hsp90를 target으로 하는 저해제 뿐 아니 라 Hsp90와 IKKγ의 상호작용을 차단하는 저해제도 NF-κB의 과다활성으로 인한 질병의 예방과 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 사료되며 NF-κB를 조절하는 다양한 signaling proteins의 작용 기전을 추가로 연구한다면 더욱 효율적인 NF-κB 의 제어방법이 모색될 것으로 보인다.