생체 흡수율이 증가된 liposomal ascorbic acid 제조법 개발

Development of a Method for Producing Liposome Ascorbic acid with Increased Bio-absorption

Abstract

리포좀을 제조하는 방법으로 여러가지 알려져 있다. 그 중 Bangham법이 가장 간단하며 일반적으로 많이 이용되어 왔다. 소규모 실험 수준에서는 효과적으로 리포좀을 제조할 수 있지만 유기용매 제거의 어려움과 지질막 형성에 반응기 크기 등의 문제로 대규모 생산을 할 수 없다는 문제점이 있다. 반면 톤(t) 단위로 대량생산이 가능한 Emulsion Method는 균일한 입자를 가진 리포좀으로 제조가 가능하나 포집률이 현저히 낮은 단점이 있다. 그래서 본 연구에서 높은 포집율과 안정성을 향상시킨 Heating Method으로 리포좀 최적의 공정방법을 개발하여 포집률, 입자크기, 제타전위 및 SD rat에 경구 투여하여 흡수율 실험을 수행하였다. 약 214 nm의 작고 균일한 리포좀을 형성하였고, 포집률은 Emulsion Method는 26.46%, Heating Method는 38.67%으로 Heating Method법을 제조된 리포좀이 높은 포집률을 보여주는 것을 확인할 수 있었다. 혈중 농도 대비 모든 군에서 1.5-2배 정도 증가한 경향을 보여주었고, 4-12 hr까지 점차 낮아지는 양상을 나타냈다. Ascorbic acid powder의 혈중 최고 농도는 약 12.017 ㎍/ml, Emulsion Method 리포좀 13.871 ㎍/ml, Heating Method 리포좀은 16.322 ㎍/ml 순으로 ascorbic acid powder보다 향상된 흡수율 결과를 보여주었다.

Various methods are known for preparing liposomes, the simplest being the Bangham method which has been widely used. Although it is possible to produce liposomes effectively on a small experimental level with this approach, large-scale production cannot be easily performed due to difficulties in removing the organic solvent and the size of the reactor required to form the lipid film. On the other hand, emulsion can mass produce tons of liposomes with uniform particles but has the disadvantage of a significantly low capture rate. This study therefore developed an optimal liposome processing method using heat with improved capture rate and stability, and bio-absorption experiments were performed by oral administration to SD rat alongside capture rate, particle size, and zeta potential. Through the heating method, a small and uniform liposome of about 214 nm was formed and the capture rate was 38.67%, confirming that the liposome prepared by heating has a higher capture rate than the 26.46% achieved through emulsion. Comparing blood concentrations, it showed a 1.5 to 2 fold increase in all groups, gradually decreasing until 4-12 hr. The highest blood concentration of ascorbic acid powder was about 12.017 ㎍/ml, the emulsion liposome 13.871 ㎍/ml, and the heating liposome 16.322 ㎍/ml, thereby showing an improved absorption rate.

서론

Ascorbic acid는 vitamin C로 알려진 필수영양소이자 식품 내에 함유되어 항산화제나 영양분으로 작용하는 기능성 식품소재이다[5, 11]. 인체 내 필수성분 중 하나이며 단백질 합성 등 생물학적 기능을 한다[8, 22]. 그러나 사람은 ascorbic acid 를 스스로 합성할 수 없어 외부로부터 섭취해야만 한다[2]. 이러한 경우 체내 희석으로 인하여 표적 조직이나 세포에 대한 유효 적용 농도가 낮아지게 되고 유효량 전달 시간도 길어지게 된다[7]. 즉, 체내 흡수율이 상당히 낮다는 단점을 가지는데, 흡수율을 높이는 방법은 주사, 다량복용(mega-dose), 경피 투여 등이 있다. 또한 ascorbic acid는 공기, 열, 빛과 같은 외부환경요인에 민감하게 반응하여 산화되는 경우가 많다. 이러한 불안정성을 극복하기 위해 리포좀으로 포집하여 안정성을 향상시킬 수 있으며, 체내 흡수율도 높일 수 있다[12].

리포좀이라는 이름은 지방을 의미하는 ‘Lipo’와 신체를 의미하는 ‘Soma’의 두 그리스어 단어에서 파생되었다[3]. 인지질로 구성된 구형 소포체로 다층 혹은 단층의 지질 2중층 구조로 이루어져 있다[23]. 1960년대 Alec Bangham은 인지질을 물속에서 분산시켜 소포체 구조가 형성되는 것을 발견하였다[19]. 인지질은 생체막의 주요 구성 성분이기 때문에 리포좀의 인지질 막 또한 생체막과 유사한 생리학적 기능 및 특성을 나타낸다[9]. 소포체 내부에 친수성 및 친유성 성분을 동시에 포집할 수 있으며 인지질 이중층 사이에는 소수성 물질을 포집할 수 있다. 약물 및 비타민 등과 같은 생리활성성분에 대한 약물 전달체(drug delivery system)로 식품 산업과 화장품 산업 등 다양한 분야에서 많은 연구가 진행되고 있으며 잠재성이 매우 뛰어나다[9-11, 19].

리포좀은 제조 방법에 따라 형태와 크기가 달라지며 이에 따라 분류할 수 있다. 크기는 20-1, 000 nm로 넓은 범위를 가지며 nm에서 μm로 다양하게 만들어지는데, 단층 소포체인 ULV (unilamellar vesicle)와 다층 소포체인 MLV (multilamellar vesicle)로 나눌 수 있다. MLV는 소포체 막의 형태에 따라 MVV (multivesicular vesicles), OLV (oligolamellar vesicle), MLV로 분류할 수 있다[6, 18, 21]. 크기에 따라서는 GUV (giant unilamllar vesicle), LUV (large unilamellar vesicle) 그리고 SUV (small unilamellar vesicle)로 나눌 수 있다. GUV는 1, 000 nm 이상, LUV는 100-1, 000 nm, SUV는 20-100 nm 크기를 나타낸다.

리포좀의 제조방법으로는 Bangham, 역상 증발법, 초음파 법, 압출법, 균질화법, 에테르/에탄올 주입법, 탈수-재수 화법 등 다양한 방법이 알려져 있다[4]. 그 중 Bangham (Film) 법은리포좀을 제조하는 가장 전형적이고 간단한 방법이다. 유기용매를 휘발시켜 얇은 지질막을 형성시킨 후 수용액을 넣고 뒤섞어 리포좀을 포함하는 현탁액을 얻는다[1]. 이 방법은 소규모 실험실적 수준에서는 효과적으로 리포좀을 제조할 수 있지만 낮은 포집율, 인지질을 용해시키기 위한 유기 용매 제거의 어려움, 지질막을 형성하기 위한 반응기의 크기 문제 등으로 인해 대규모 생산을 할 수 없는 문제점이 있다[14]. 또 다른 방법으로는 크기를 조절할 수 있고 균일한 입자 분포를 갖는가 장 일반적으로 사용되는 emulsion법이다. 리포좀의 크기 분포가 매우 광범위하며 가변이 가능한 오일 및 금속 오염이 되는 단점이 있다[15]. 본 연구에서는 포집률이 낮은 emulsion 법의 단점을 보완하여 포집률과 안정성을 향상시킨 최적의 공정조건을 도출하고 리포좀 대량생산 방법을 개발하여 산업화될 수 있는 가능성을 확인하였다.

재료 및 방법

재료

본 연구에 사용한 대두레시틴은 ㈜이든타운에프앤비 (Incheon, Korea)에서 구매하여 실험에 사용하였다. 리포좀의내부에 포집될 수용성 형광물질인 fluorescein, ascorbic acid, citric acid는 Sigma (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다. 리포좀 제조시 사용된 homo mixer는 MARK II Model 2.5 (PRIMX, Japan)를 사용하였으며, 대량생산을 하기 위해 μ-Tron-ISP 25 (ESYN, KOREA) 장비를 사용하였다. 리포좀 크기와 제타전위 측정은 NanoBrook 90Plus PLAS (Brookhaven Instrument Corp., NY, USA) 장비를 사용하였다.

Emulsion Method를 이용한 리포좀 제조

Ascorbic acid, fluorescein 및 citric acid를 녹인 수용액에 레시틴을 넣은 후 homo mixer를 사용하여 6, 000 rpm 속도로 약 20분간 균질화시켜 충분히 분산될 수 있도록 하여 리포좀을 제작하였다(Fig. 1A).

Fig. 1. Liposome preparation method. The manufacturing process (A) by the emulsion and the heating method (B) are diagrammed.

Heating Method (HM)를 이용한 리포좀 제조

Emulsion Method와 동일하게 ascorbic acid, fluorescein 및 citric acid를 녹인 수용액에 레시틴을 넣은 후 μ-Tron-ISP 25 (ESYN, KOREA) 장비를 사용하여 65℃로 설정 후 Disperser (HED) motor를 6, 000 rpm으로 20분간 가동시킨 다음 Scapper Paddle를 이용하여 60 rpm으로 90분간 온도를 가하고 그 후가 온하면서 롤링해주어 리포좀을 대량으로 제조하였다(Fig. 1B).

리포좀 포집율 측정

리포좀의 ascorbic acid 포집률을 측정하기 위해 리포좀을다음과 같이 전처리 하였다. PBS buffer로 10배 희석하여 vor- texing하여 17, 000 rpm에서 약 20분간 총 3회 원심분리 (LZ-1730R, LABOGENE, Seoul, South Korea)하였다. 상등액과 침전물을 분리한 후 회전 진공 감압 농축기를 이용하여용매를 각각 증발시켰다. 이렇게 분리 건조된 리포좀에 10% Triton X-100을 이용하여 리포좀을 파쇄하여 0.2 μm syringe filter로 여과 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent 1100, Japan)으로 정량 분석하였다. HPLC 분석 조건은 Table 1에 나타내었다.

Table 1. HPLC condition. Conditions for HPLC analysis for encapsulation efficiency of liposomal vitamin C

입자크기 및 제타전위 측정

리포좀의 크기는 나노 입자 크기 분석기(NanoBrook 90Plus PALS, Brookhaven Instruments Corp., NY)를 이용하여 리포좀 입자크기(particle size), 제타전위(zeta potential) 및 분산지수인 PDI (polydispersity index)를 분석하였다. 제조된 리포좀을 200배 희석하여 RI (refractive index)값을 1.450, 온도는 25 ℃로 설정하여 총 5회 반복 측정하였다. 동일한 나노 입자 크기 분석기(NanoBrook 90Plus PALS, Brookhaven Instruments Corp., NY)로 제타전위 측정을 하였다. 각 샘플의 입자크기(particle size)값을 설정하여 동일한 조건으로 총 5회 반복 측정하였다. 입자크기, 분산지수 및 제타전위는 동적 광산법 (Dynamic Light Scattering; DLS) 원리를 이용하여 측정하였다.

Pharmacokinetics 시험

SD Rat를 이용한 vitamin C 제제에 따른 pharmacokinetics 시험은 ㈜다올에 의뢰하여 진행하였다. 실험동물은 체중 240-260 g 내외의 7주령된 Sprague Dawley계 수컷 쥐를 사용하였다(T&PBIO-IACUC 2021-009). 명암주기 12시간 cycle, 실내온도 20-24℃의 사육실에서 자유급식으로 공급하여 5일 동안 환경에 적응시켰다. 실험동물군을 ascorbic acid powder, emulsion법, heating법으로 나누어 각 군별로 평균체중이 균등하도록 6마리씩 배분하고 3 ml 주사기에 렛드 경구 투여용 존대를 결합하여 10 ml/kg의 시험물질을 경구 투여하였다.

시료채취 및 Ascorbic acid 측정

각 군의 모든 개체에 대하여 투여 후 예정된 시간(0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 hr)에 일회용 주사기를 사용하여 경정 맥에서 약 300 μl를 채혈하였다. 차광 된 1.5 ml amber tube에 혈액을 담아 30분간 실온상태에서 혈액을 응고시켰다. 혈청은 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 만들었으며, 분석 전까지 각 100 μl씩 분주하여 초저온 냉동고(약 -70℃)에 보관하였다. 추후 시험물질 분석을 위해 분석기관인 ㈜비바젠에 혈청 샘플을 송부하여 HPLC-TUV를 이용해 혈중농도를 분석하였다(Table 2). 분석과정에 vitamin C가 내인성 물질로 확인되어 혈청 dialysis 후 사용하였다.

Table 2. HPLC-TUV condition. Conditions for HPLC-TUV analysis for encapsulation efficiency of liposomal vitamin C

통계처리

본 실험에 대한 모든 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 연구 결과 얻어진 자료를 SPSS 20 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 프로그램을 사용하여 one-way ANOVA 분석 후 p< 0.05 수준에서 LSD multiple test에 의해 검정하였다.

결과

Liposomal ascorbic acid 포집률

두 가지 방법으로 제조된 리포좀에 포집된 ascorbic acid를 HPLC로 이용하여 포집율률을 측정하였다. Li 등에 의하면 균질 화법으로 제조된 리포좀의 ascorbic acid 포집률이 다양한 제조법에 비해 낮은 포집률을 보여주었다[13]. 이를 바탕으로 Emulsion법의 ascorbic acid는 약 26.46%으로 낮은 포집률을보여주였고 heating법의 ascorbic acid는 약 38.67%의 포집률을 나타내었다. 가온효과로 인해 리포좀들이 서로 응집되면서 입자 크기가 커져 ascorbic acid를 많이 포집할 수 있는 것으로 사료된다(Fig. 2).

Fig. 2. HPLC peak result. The ascorbic acid peak of the emulsion method (A), and the ascorbic acid peak of the heating method

Liposomal ascorbic acid 입자크기 및 제타전위

레시틴의 농도별로 제조된 리포좀의 입자크기와 제타 전위를 DLS 분석을 통해 측정하였다. Emulsion법과 heating법의리포좀은 약 179-214 nm 내의 작은 입자크기를 보여주었고 비교적 균일하게 분포되어 있었다(Fig. 3). 제타전위는 입자의 전하끼리 안정적인 분산도를 나타내는 수치로, 절대값이 약 -30 mV 이상 증가할수록 안정적으로 입자가 유지된다[16]. 이를 통해 emulsion법과 heating법에서 각 -62 mV, -64 mV의입자 분산도를 보여주었고 안정적인 형태의 리포좀인 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. Liposome particle size and zeta potential prepared by Emulsion method (EM) and heating method (HM). Emulsion method (A) and heating method (B) the particle size and zeta potential of the liposome were measured for each concentration of lecithin. All the values were expressed as means ± S.D. (n=5). Values with different letters above the bar graph differ significantly by one-way ANOVA followed by multiple tests of LSD (p<0.05).

Liposomal ascorbic acid 안정성

2주 동안 저장하면서 입자크기와 제타전위를 측정한 결과는 Fig. 4, Fig. 5와 같다. Emulsion법과 heating법의 리포좀은 초기 입자크기에 비해 7일 후에 약 200 nm의 크기로 증가하였으며 14일이 경과 후 감소하거나 유지하는 결과를 보였다. 리포좀을 제조하고 시간이 지날수록 입자들이 반응이 일어나서 응집되거나 크기가 증가되는 현상을 보였다[13]. 이를 바탕으로 시간 경과에 따라 입자크기가 증가하다가 감소하거나 유지되는 양상을 보였으며 이것은 제조 직후 리포좀의 형태를 유지하지 못하고 풀리거나 응집되는 현상으로 사료된다. 제타 전위 측정 결과 초기 제타전위값은 -54 mV에서 -64mV로 안정적인 수치를 나타냈다. 전체적으로 저장기간 동안 -75 mV까지증가하거나 유지하는 경향을 보였으며 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 4. Results of particle size and zeta potential of Emulsion Method liposomal ascorbic acid over time. Changes in particle size (A) and zeta potential (B) of liposome during storage were measured by a nanoparticle analyzer. All the values were expressed as means ± S.D. (n=5). Values with different letters above the bar graph differ significantly by one-way ANOVA followed by multiple tests of LSD (p<0.05).

Fig. 5. Results of particle size and zeta potential of Heating method liposomal ascorbic acid over time. Changes in particle size (A) and zeta potential (B) of liposome during storage were measured by a nanoparticle analyzer. All the values were expressed as means ± S.D. (n=5).

Liposomal ascorbic acid 크기 및 형태 관찰

광학현미경과 형광현미경으로 관찰한 리포좀의 이미지는 Fig. 6, 7, 8에 나타냈다. 시간에 지남에 따라 리포좀의 변화를 관찰하였다. 그 결과 emulsion법과 heatin법으로 제조된 리포좀의 모양이 약 200 nm내의 작은 입자크기로 굴곡이 있고 타원형 및 둥근 구형의 모습을 확인할 수 있었다. Fig. 8 이미지는 14일이 경과 된 사진이다. 리포좀 모양들은 균일하게 온전한 형태를 유지하고 있는 것으로 보였다.

Fig. 6. Liposomal ascorbic acid image observation. The size and shape of (A) emulsion method and (B) heating method were observed.

Fig. 7. Liposomal ascorbic acid image observation. Changes in the size and shape of the liposomes after 7 days were observed. (A) emulsion method and (B) heating method.

Fig. 8. Liposomal ascorbic acid image observation. Changes in the size and shape of the liposomes after 14 days were observed. (A) emulsion method and (B) heating method.

약동학 분석

Ascorbic acid 및 liposomal ascorbic acid의 시간에 따른 혈중 농도를 각각 Fig. 9, Fig. 10에 나타냈다. Ascorbic acid 투여군에서 AUC0-24 (24시간 동안의 곡선아래 면적) 233.957μg·hr/ml, Cmax (최고혈중농도)는 12.017 μg/ml, Tmax (최고 혈중농도 시간)는 7.667 hr, T1/2는 27.759 hr으로 계산되었고, emulsion 법 투여군은 AUC0-24는 281.481 μg·hr/ml, Cmax 는 13.871 μg/ml, Tmax는 7.500 hr, T1/2는 68.957 hr으로 계산, heating 법 투여군은 AUC0-24는 309.981 μg· hr/ml, Cmax 는 16.322 μg/ml, Tmax는 5.500 hr, T1/2는 76.028 hr으로 결과를 나타냈다.

Fig. 9. HPLC-TUV. The Chromatogram of Blank plasma (A), The chromatogram of LOQ (Limits Quantifica- tion) (B).

Fig. 10. The Concentration of ascorbic acid in Serum. It is a graph showing the blood concentration of 6 mice in each group. (A) is ascorbic acid powder, (B) is an emulsion liposome, (C) is a heating liposome.

Liposomal ascorbic acid 경구투여

SD rat을 이용한 liposomal ascorbic acid에 대한 경구투여 후 약물 동태 시험을 실시하였다. 시험물질을 각 군 구성에 따라 경구투여 후 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 hr 동안 채혈하였다. 임상관찰 시 시험 기간 동안 사망 동물은 발견되지 않았으며, 특별한 임상증상은 관찰되지 않았다. 경구투여 전 혈청 내 ascorbic acid 농도는 0 또는 6-10 ug/ml 로 각 그룹 내 개체들에서 검출되었으며 이는 내인성물질로 사료된다. 투여 1, 2 hr 후 기초 혈청 수준 대비 모든 군에서 1.5-2 배 정도 증가한 경향을 보였으나 4-12 hr까지 다소 낮은 혈중 농도를 보이며, 24 hr까지도 뚜렷한 소거현상이 나타나지 않았다(Fig. 11).

Fig. 11. The Concentration of ascorbic acid in Serum. The mice were compared with the average of the blood concentration of each group for 2 hr after oral administration of 10 ml / kg of vitamin C in a 24 hr. It was reached 1-2 hr and gradually decreased. Compared to vitamin C, Liposomal vitamin C tends to increase about 1.5 times in all the groups.

고찰

리포좀은 인지질 및 이들의 유도체가 물에서 분산될 때 자발적으로 소포체를 형성하며, 내부에 수상으로 이루어진 핵을 포함하는 지질 이중층에 의한 특성을 갖는 구형 소포체이다. 다양한 방법으로 제조된 리포좀은 의학, 제약학 및 생화학 분야에서 약물, 효소, 단백질과 같은 치료제를 위한 전달체로 사용될 수 있다.

본 연구에서는 emulsion법으로 제조된 리포좀을 가온시키면서 입자들이 서로 응집되어 큰 리포좀을 형성되도록 하였고 그 후 다시 균질화시켜 평균 약 200 nm 범위 내의 작고 균일한 입자들을 제조하였다. 이는 리포좀을 형성하는 물리적인 힘인 온도가 일정하게 전달되어 리포좀 입자의 생성이 모두 동일한 것으로 확인하였다.

HPLC를 통해 liposomal ascorbic acid에 대한 포집률을 측정한 결과 emulsion법은 26.46%, heating법은 38.67%으로 heating 법으로 제조된 리포좀이 더 높은 포집률을 보여주었다.

Ascorbic acid를 함유한 리포좀이 약물전달체로서의 기능을 확인하고자, SD rat에 경구 투여하여 흡수율을 측정한 결과 ascorbic acid, emulsion 및 heating의 시간별혈중농도(AUC0- 24) 및 최고혈중농도(Cmax)는 각각 233.957 μg·hr/ml, 281.481 μg·hr/ml 및 309.981 μg·hr/ml와 12.017 μg/ml, 13.871 μg/ml 및 16.322 μg/ml로 ascorbic acid powder, emuslion lipo- some, heating liposome의 순으로 혈중농도가 높았다.

사람은 ascorbic acid 생합성 단계의 마지막 효소인 L-gulo- nolactone oxidase의 변이로 인해 자체 생합성을 못하고 외부에서 섭취하여야 한다[17]. 반면 생쥐는 자체 생합성이 되기 때문에 실험상황이 다를 수 있다. 이를 바탕으로 투여 전 각 개체군들에서 혈중 농도가 0 또는 6-10 μg/ml 검출되었으며 이는 내인성물질로 사료된다. 투여 후 1-2 hr까지 증가하다가 그 이후 점차 감소하는 경향을 보였다. Liposomal ascorbic acid 흡수율이 ascorbic acid powder보다 1.5-2배 정도 증가되는 것으로 확인하였다.

Shin [20] 등에서는 포집률이 높을수록, 리포좀의 입자크기가 작을수록 생체 흡수율이 높다고 밝혔다. 본 연구는 향상된 포집률과 약 200 nm의 균일한 리포좀을 제조하였으며, ascorbic acid를 포집한 리포좀의 혈중 농도가 16.322 μg/ml로 약 135% 향상된 제조 방법을 개발하였고 이들의 PK (Pharmaco- kinetics)로 SD rat을 이용하여 추적하였다.

따라서 film법에 비해 현저히 떨어진다고 알려진 emulsion 법의 낮은 포집률을 개선한 heating법으로 안정적인 리포좀제형으로 제조 후, ascorbic acid powder보다 생체흡수율을향상시킴으로서 대규모 생산 개발에 크게 활용될 가능성을 확인하였고 산업화에 많은 기여가 될 것으로 사료된다.