Cell Migration and Wound Healing Activities of Recombinant Thymosin β-4 Expressed in Escherichia coli

재조합 Thymosin β-4의 세포이동능과 상처치유능

Abstract

Thymosin β-4 (TB4) is a small peptide composed of 43 amino acids. To obtain sufficient biologically active mouse TB4 economically, we cloned and overexpressed this gene in an Escherichia coli system. With the isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside induction of the E. coli transformant, TB4 fusion protein with intein- and chitin-binding domain was successfully expressed in the soluble fraction within the E. coli cell. The TB4-intein - chitin-binding domain fusion protein was purified from the soluble fraction of E. coli cell lysate. The affinity chromatography with chitin beads and dithiothreitol-mediated intein self-cleavage reaction releases the TB4 peptide into the stripping solution. Sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot analyses were used to confirm that the recombinant TB4 peptide was produced with the expected size of 5 kDa. We found that the recombinant TB4 stimulated cell migration in the transwell plate chamber assay. After 18 hr of the treatment of the recombinant TB4 with 1 ng/ml concentration, the migration of the HT1080 cell was increased by 20% compared with that of the chemically synthesized TB4. The recombinant TB4 was also observed to promote the healing of a wound area in C57BL/6 mice by as high as 35% compared with that of the chemically synthesized TB4. These results suggest that the recombinant TB4 has better biological activity for cell migration and wound healing than that of the chemically synthesized TB4 peptide.

Mouse thymosin β-4 (TB4) 유전자를 Escherichia coli에서 intein-tag 융합 단백질로 발현시키고 정제하였다. 재조합 TB4-intein 융합 단백질의 분자량을 10% glycine SDS-PAGE로 확인한 결과, 세포내 soluble 분획에서 60 kDa의 단백질을 얻을 수 있었고, 유도발현 최적 조건은 0.1 mM IPTG, 25℃에서 3시간 동안 유도 발현할 때가 최적임을 확인하였다. TB4 만을 얻기 위해서 유도발현된 TB4-intein을 DTT를 이용해 self-cleavage를 일으킨 다음, chitin bead를 이용한 친화성 크로마토그라피로 정제 후 분자량을 확인 한 결과, 5 kDa으로 확인되었으며, 순도는 95%이상 이었다. 정제한 recombinant TB4가 생물학적 기능을 보유하고 있는지 확인을 하기 위하여, TB4를 농도 별(1~1,000 ng/ml)로 하여 HT1080 cell을 이용한 cell migration을 측정한 결과, 모든 농도에서 recombinant TB4가 화학합성한 TB4 보다 약 20% 이상 높은 활성을 보였으며, recombinant TB4 1 ng/ml의 농도에서 cell migration 활성이 가장 높게 나타났다. Recombinant TB4를 마우스 상처 부위에 5일 동안 매일 처리한 결과(최종 처리 농도 0.5 mg/ml), 화학합성 TB4 보다 recombinant TB4의 상처치유 활성이 약 35% 더 높음을 알 수 있었다. 이상의 결과는 recombinant TB4가 화학합성 TB4보다 cell migration과 상처치유에 훨씬 높은 활성을 나타냄을 보여주고 있다.

서 론

Thymosin β-4 (TB4)는 43개의 amino acid로 구성이 되어있 고, 분자량은 5 kDa이다[8]. 포유류 세포에서만 발견이 되고, 기능은 G actin과 binding 하여[1], 항염증[23], 심장세포나 정 맥내피세포의 migration을 일으키며[2, 9, 17], 혈관신생과 궤 양과 상처 및 화상 등의 치유 및 모낭발달에도 관여하며[5, 11, 15, 16, 18, 21, 28, 31], 암 전이[4, 12], 퓨린성 신호전달[7], 안구건조 방지[30] 등 여러 가지 기능이 최근에 많이 알려지고 있다. 현재 TB4 유전자가 많이 발견된 생물종은 human, mouse, rat이며[8]. 위의 여러 기능을 하는 TB4는 의약용으로 사용되기도 하고[20, 25], 분자 marker라 하여 질병의 유무를 판별하는데 사용이 되기도 한다[3, 26]. TB4를 포유류 세포에 서 직접 생산, 정제해서 쓰기도 하지만, 그 양이 많지 않을뿐더 러, 시간도 많이 들고, 경제적으로도 아주 고비용 공정이다.

그래서 미생물 세포에서 재조합 단백질 형태로 생산하는데, 대표적으로 쓰이는 숙주세포가 Escherichia coli 이다. 조작도 쉽고, 성장속도 및 단백질 생산 속도가 빨라서 적은 시간으로 도 많은 양의 단백질을 고효율로 생산해 낼 수 있다[10]. 그러 나, E. coli 내에서 분자량이 작은 펩타이드를 발현시키면 E. coli 내에 있는 protease에 의해서 proteolysis가 자주 일어난다 [24]. 이러한 proteolysis 정도를 낮춰주기 위해서 protease-deficient 균주를 사용하거나[13, 19], tumor necrosis factor 또는 green fluorescent protein을 융합 파트너로 사용하여 분자량 을 높힌 chimeric 단백질 형태로 발현시키거나[10, 27], 6X His 또는 intein tags를 사용해서 TB4를 발현시키려는 시도가 있어 왔다[6, 13, 14, 30]. 특히, intein-tag은 chitin binding domain (CBD)과 융합되어 있어 목적 단백질의 분자량을 높혀 E. coli 세포질 내 proteases의 공격으로부터 목적 단백질을 보호할 수 있고, chitin과의 친화력을 이용하면, 정제 시 목적 단백질 만 높은 수율로 단시간에 획득할 수 있다[6, 30].

본 논문에서는 mouse TB4 유전자를 subcloning하여 intein-tag과 CBD와 융합된 대장균 발현계를 구축하고, protease-deficient 균주인 E. coli BL21 (DE3)에 형질전환시켜 최 적 발현조건을 조사하고, 과발현된 recombinant TB4의 분리, 정제 공정을 확립하고자 하였다. 또한, 정제된 recombinant TB4의 주요한 생물학적 활성(cell migration, wound healing) 을 밝히고자 하였다. 특히, 이때까지 연구되지 않았던, 그리고, 종양 생검 조직에 사용되는 인간 섬유육종 세포주 HT1080를 사용하여 cell migration 활성을 조사하였고, 상처치유 효능도 직접 동물 mouse를 사용하여 인위적 상처를 유발시킨 뒤 recombinant TB4의 상처치유 효능을 정량적으로 살펴보았다.

재료 및 방법

사용균주 및 Plasmid

본 연구에 사용된 mouse TB4 유전자는 pET-22b vector에 재조합시켜 얻은 plasmid pET-22b-TB4에 subcloning 되어 있 다(고신대 의대 제공). 이 plasmid를 E. coli DH5α 에 형질전환 시켜 보관하였고, GeneAllR GENEx Genomic kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 추출한 plasmid는 pTYB2 vector (New England Biolabs Ltd, UK)에 subcloning 을 위해 PCR 증폭(forward primer (GGAATTCCATATGT CTGACAAACC; under line: Nde I cutting site 와 reverse primer (CCGCTCGAGCGATTCG; under line: Xho I cutting site)하였다. 구축한 plasmid pTYB2-TB4 (7,575 bp)를 E. coli BL21 (DE3) codon plus 에 형질전환시켰다. Plasmid pTYB2- TB4는 T7 promoter를 가지고 있어 isopropyl thiogalactoside (IPTG)를 첨가함으로써 TB4 발현을 유도할 수 있다.

배양 및 유전자 발현 최적화

E. coli BL21 (DE3) codon plus/pTYB2-TB4은 LB 배지에서 37℃, 16시간 본 배양을 하고, OD600 값이 0.5가 되었을 때, IPTG를 첨가하였다. TB4 발현 최적 조건을 규명하기 위해 IPTG 농도 별(0, 0.1, 0.3, 0.5 mM), 유도 시간별(0, 3, 6, 12시간), 배양 온도 별(37℃, 30℃, 25℃)로 TB4-intein (60 kDa)의 발현 양을 10% glycine SDS-PAGE로 측정하였다.

TB4의 정제

E.coli BL21 (DE3) codon plus/pTYB2-TB4를 LB 배지에서 1 L 배양하였고, 배양 후 10,000× g, 10분, 4℃에서 원심분리하 여 cell pellet만 모으고, column buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.5) 에 녹이고 난 후, sonication 실행하였다.

Cell lysate를 15,000× g, 10분, 4℃에서 원심분리한 후, 상등 액(soluble fraction)을 chitin beads가 들어있는 Econo-Pac chromatography column (Bio-Rad, USA) 에 넣고, column buffer로 washing한 후, cleavage buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM DTT, pH 8.5)를 넣고 25℃에 서 48시간 동안 반응시켜 TB4와 intein-CBD를 절단시켰다[30]. TB4 용출 후, column 내의 intein-CBD와 chitin beads를 분리 하기 위해 stripping buffer (1% SDS)와 DW로 washing 한 뒤, column buffer를 채워 넣었다. 용출된 TB4는 DTT를 제거 하기 위해 PBS로 투석하였다.

Protein 농도와 SDS-PAGE를 이용한 TB4 분석

단백질 정량은 Lowry 법을 사용하였고, 표준 단백질로 0.1% BSA를 사용하였다. 단백질 농도를 각 lane 별로 2.5 μg/ ml의 농도로 맞추고 10% glycine SDS-PAGE와 16% Tricine SDS-PAGE를 실행하였다. 염색은 Coomassie Brilliant Blue (R250)를 사용하였다.

정제 TB4의 western blotting

정제된 TB4를 16% Tricine SDS-PAGE를 실행하고 난 뒤, western blotting을 실행하였다. 0.2 μm pore size의 PVDF membrane을 methanol에 적셔준 뒤 transfer buffer에 5분간 반응시켰다. Semi dry transfer로 15 V에 1시간 동안 transfer 시킨 뒤, membrane을 blocking buffer에 넣고 4℃에서 overnight 하였다. PBST (PBS, 0.5% tween 20)로 3번 washing, DW 로 1번 washing 해주고 난 뒤, TB4 antibody (LS Bio, Seattle, USA)를 25℃에서 1시간 동안 반응시키고 washing 후, secondary antibody (AP-conjugated goat anti-mouse antibody, LSBio, Seattle, USA)를 25℃, 1시간 반응시킨 뒤 washing하였 다. Detection 용액(Miracle-Star™ Western Blot Detection System, iNtRON Biotechnology, Korea)을 분주하고 37℃에서 20분 동안 반응을 시키고, 반응을 종결시키기 위해 DW로 washing하였다. 화학합성한 TB4 (chemical TB4, Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)와 recombinant TB4의 분자량을 비 교하기 위해 16% Tricine SDS-PAGE를 실행하였다.

재조합 TB4의 cell migration assay

TB4의 주 기능인 cell migration 활성을 측정하기 위해 인간 섬유육종 세포주 HT1080를 사용하였고, 배지조성은 DMEM 과 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamine이 며, 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다.

Hemocytometer로 세포수를 세고, 각 well 당 5×104 cells/ ml를 12 plate well에 seeding한 다음 TB4를 처리하였다. 대조 군으로 PBS를 사용하였고, 화학합성 TB4, recombinant TB4를 각 농도별(1, 10, 100, 1000 ng/ml)로 각 well에 분주하고 난 뒤, 24시간 동안 incubation 시켰다[17]. 24시간 동안 TB4를 처리해준 HT1080 cell은 0.25% Trypsin-EDTA로 처리하여 FBS가 포함된 DMEM를 분주하고 1,000 rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리 하고 난 뒤 cell pellet을 DMEM (FBS free)에 재현탁시켰다.

Trans-well lower chamber를 0.5 mg/ml 농도의 collagen 10 μl 분주 후 도포하고 뒤집어 말린 뒤 4℃에 보관하였다. Lower chamber에 DMEM, 0.1% FBS를 600 μl 분주하고, upper chamber에는 위의 재현탁한 HT1080 cell 농도가 1×104 cells/ml 되도록 seeding하고(total volume 100 μl가 되도록 FBS-free DMEM 을 채워줌), 18시간 동안 배양하였다. 이후 trans-well의 배지를 제거하고 trans-well 바닥을 methanol로 1분간 cell fixing시겼다. Hematoxylin으로 3분간 cell을 염색 시킨 뒤, DW로 washing하고 upper chamber filter 부분을 면 봉으로 닦아주었다. 뒤집어서 수분을 말린 뒤, filter를 칼로 오려내고 lower chamber filter가 윗부분으로 하여 slide glass 위에 놓은 뒤, Balsam 시약을 처리하고 세포수를 세었다. 이렇 게 센 세포수를 seeding한 세포수와 비교하여 상대적 수치(%) 로 나타내었다[2, 22].

재조합 TB4의 wound healing assay

TB4의 주 기능인 wound healing 활성을 측정하기 위해 mouse C57BL/6를 사용하였고 age는 6-week, sex는 female이 였다(Kosin 15-10). 15마리를 사용하여 control (DW: glycerol 비율을 7: 3으로 만든 용액) 5마리, chemical TB4 처리용 5마리, recombinant TB4 처리용 5마리로 나누어 사용하였다. 전신마 취를 시키고 난 뒤, 쥐 등에 있는 털을 제거한 후, 2 mm biopsy punch로 상처를 내고, TB4를 처리하였다. DW: glycerol 비율 을 7: 3으로 만든 용액 50 μl에 25 μg TB4를 녹인 용액으로 5일 동안 매일 치료한 뒤(최종 처리 농도 0.5 mg/ml), 상처부 위의 tissue를 현미경으로 찍어 상처 면적을 상대적 수치(%)로 나타내었다.

결과 및 고찰

TB4–Intein 융합 단백질의 최적 발현

형질전환체 E. coli BL21 (DE3) codon plus/pTYB2-TB4를 LB 배지에서 37℃에서 16시간 배양하여 OD600 값이 0.5가 될 때, 최종 농도 0.5 mM의 IPTG 를 첨가하고 3시간 유도배양하 였다. 유도배양 후, 배양액을 4℃에서 10,000× g로 원심분리하 여 cell pellet을 TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹인 다음, 10% glycine SDS-PAGE로 확인한 결과, 60 kDa의 부위에서 TB4-intein-CBD 융합단백질이 발현된 것 을 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1. 10% Glycine SDS-PAGE analysis of the recombinant TB4- intein fusion protein. Lane 1, protein molecular weight markers; lane 2, cell lysate of E. coli BL21 (DE3) Codon plus; lane 3, cell lysate of E. coli BL21 (DE3) Codon plus/pTYB2-TB4 (37℃, 0.5 mM IPTG, 3 hr).

TB4–intein-CBD 융합 단백질의 최적 유도발현 조건을 정 하기 위해 IPTG 농도별(0, 0.1, 0.3, 0.5 mM), 유도 시간별(0, 3, 6, 12시간), 배양 온도별(37℃, 30℃, 25℃)로 형질전환체를 배양한 후 TB4–intein-CBD 융합 단백질의 발현 국재성과 발 현량을 조사하였다. Cell lysate를 insoluble과 soluble 분획으 로 나누어 SDS-PAGE로 분석한 결과, TB4–intein-CBD 융합 단백질은 soluble 분획에서 발현되었고, 최적 IPTG 농도는 0.1 mM, 최적 배양온도와 유도 시간은 25℃에서 3시간으로 확인 되었다(data not shown). E. coli에서 TB4가 soluble 분획에서 발현된 것은 ploy-His tag과의 발현과 dimeric TB4 발현에서 도 보고된 바 있다[13, 29]. TB4 발현량을 증대시키기 위해 dimer 또는 tetramer 형태로 발현시키는 경우가 있는데[28, 29], 본 연구에서는 momomer 형태(single copy)로 발현시켜 도 과발현에 문제가 없음을 보여주었다.

재조합 TB4의 정제 및 western blotting

TB4-intein-CBD 융합 단백질은 chitin beads가 채워진 Econo-Pac chromatography column으로 정제를 하였다. Cell lysate 상등액을 column에 넣어 TB4-Intein-CBD을 chitin beads 에 붙였다. 그 다음으로 cleavage buffer를 넣고 48시간 동안 25℃에서 TB4와 intein-CBD를 cleavage 시켰다. 정제 단계별 로 재조합 TB4를 10% glycine SDS-PAGE로 확인한 결과, intein-CBD는 55 kDa에서 확인이 되었고(Fig. 2A), TB4는 16% tricine SDS-PAGE에서 5 kDa 단일 밴드로 확인되었다(Fig. 2B). 정제된 TB4를 western blotting으로 다시 확인한 결과 (Fig. 2C), 5 kDa에서 순수한 단일 밴드로 나타나, 약 95% 이상 의 순도를 보이는 것으로 판단된다. 또한, 화학합성한 TB4 (chemical TB4)와 정제한 recombinant TB4를 동일한 농도에 서 16% Tricine SDS-PAGE로 비교한 결과, 둘 다 5 kDa에서 band 확인이 되었으나, 화학합성한 TB4의 band는 넓게 퍼져 있고 연한 반면에, recombinant TB4는 퍼져 있지 않고 굵고 진한 band로 나타났다(data not shown). 이는 recombinant TB4의 단백질(펩타이드) 접힘(folding)이 천연형에 가깝게 더 잘 일어났음을 의미하며, 동일한 펩타이드 농도로 처리시, chemical TB4 보다 recombinant TB4가 더 높은 생물학적 활성 을 보일 것으로 예측된다.

Fig. 2. Purification of recombinant TB4 expressed in E. coli. (A) 10% glycine SDS-PAGE of E. coli BL21 (DE3) Codon plus/pTYB2-TB4. Lane 1, protein molecular weight markers; lane 2, crude extract of transformant E. coli cells; lane 3, supernatant of crude extract of transformant E. coli cells; lane 4, non-binding proteins to chitin beads; lane 5, elution fraction after cleavage with DTT; lane 6, intein-CBD fraction. (B) 16% Tricine SDS-PAGE of purified TB4. Lane 1, protein molecular weight markers; lane 2, purified TB4. (C) Western blotting of recombinant TB4.

Intein-CBD 융합 파트너를 이용한 TB4 발현에서 대부분 2 단계 이상의 chromatography (hydrophobic interaction chromatography 포함)를 해야 95% 이상의 순도를 보이는 것으로 보고된 바[6, 30], 본 연구에서는 1단계의 chromatography로 도 95% 이상의 순도를 나타내어 정제 효율성(수율과 순도)이 우수함을 의미하여, 이때까지 TB4의 생산을 대부분 화학합성 에 의존하던 공정을 E. coli에서 recombinant 형태로 생산함에 높은 경제성을 부여할 것으로 판단된다.

재조합 TB4의 cell migration 활성

Transwell 사용하여 HT1080 cell을 migration 시킨 결과, TB4 최적농도가 1 ng/ml이고, 농도를 높이면 높일수록 migration은 저하되는 것을 알 수 있었다(Fig. 3). 대조구(PBS)의 상대적 cell migration 값이 98.87±2.3 이였고, 1 ng/ml 농도에 서 화학합성 TB4는 142.64±6.8, recombinant TB4는 172.85±5.3 을 보여(p<0.01), 대조구에 비해 화학합성 TB4는 44%, recombinant TB4는 75% 증가된 cell migration 효율을 보였다. 또한, 1 ng/ml 이상의 모든 농도에서 화학합성 TB4 보다 recombinant TB4가 HT1080 세포의 migration을 약 20% 이상 더 잘 시킴을 알 수 있었다(Fig. 3D).

Fig. 3. Staining of migrated HT1080 cell with hematoxylin. (A), control (PBS); (B). 1 ng/ml chemical TB4; (C), 1 ng/ml recombinant TB4. Scale bar 10 μm. (D), Effects of TB4 concentration on HT1080 cell migration. (black bar, chemical TB4; grey bar, recombi- nant TB4). Student’s t-test, p<0.01.

Cell migration과 TB4의 농도와의 관계는 반비례하는 보고는 인간 탯줄정맥 내피세포[18, 29]와 모낭 줄기세포에서 보고 [5]가 있어, 본 연구 결과와 잘 일치함을 알 수 있었다. 화학합 성 TB4 보다 recombinant TB4가 cell migration을 더 잘 일으 키는 이유는 recombinant TB4 peptide의 좀 더 정확한 접힘으 로 추정된다. Mouse TB4와 인간 TB4의 아미노산 유사성은 100%이기 때문에 인간 섬유육종 세포주 HT 1080에서도 recombinant mouse TB4가 이러한 결과를 보이는 것으로 판단 된다. 높은 TB4 농도에서 cell migration 활성이 약해지는 현상 은 다양한 수용체 관련 생물학적 반응에서 공통적으로 나타나 며[7, 29], 그 기작은 아직 정확히 알려져 있지 않아 향후 연구 가 더 필요한 부분이다.

재조합 TB4의 wound healing 활성

25 μg/50 μl (0.5 mg/ml)의 화학합성 TB4와 recombinant TB4를 5일 동안 쥐 상처부위에 처리한 결과, 대조구(30% glycerol)에 비해 TB4를 처리해 준 쥐 실험군에서 상처 면적이 현 저히 작아짐을 확인하였다(Fig. 4B, Fig. 4C). 대조구(30% glycerol)의 상대적 상처 면적 값이 100.00±18.8 이였고, 화학합성 TB4는 81.21±15.7, recombinant TB4는 60.00±10.9 값을 보여 (p<0.01), 화학합성 TB4는 19%, recombinant TB4는 40% 정도 로 상처 면적을 많이 줄였다(Fig. 4D).

Fig. 4. Microphotos of wound tissues after treatment of TB4 for 5 days. (A), control (30% glycerol); (B), chemical TB4; (C), recombinant TB4; (D), Wound healing activity of recombinant TB4 (final concentration=0.5 mg/ml). Student’s t-test, p<0.01. (scale bar = 100 μm).

화학합성 TB4와 recombinant TB4의 두가지 만을 비교를 하였을 때, recombinant TB4의 상처치료 효과(상처 면적 감소 효과)가 약 35% 더 높음을 알 수 있었다.

Recombinant TB4의 상처 치유 효능이 높은 이유는, cell migration 활성이 높은 이유와 마찬가지로, 재조합 TB4의 정 확한 folding 때문인 것으로 유추된다[28]. 화학합성 TB4 보다 recombinant TB4의 상처 치유 활성이 높다는 보고는 몇 편 있으나[15, 28, 29, 31], 본 연구에서처럼 동물(쥐) 모델에 직접 상처를 내고 아무는 과정을 연구한 보고는 거의 없는 실정이 며, 그나마 최근 E. coli에서 발현된 recombinant dimer TB4의 상처치유 효과도 0.25 mg/ml 농도에서 7일 정도 지나야 rat의 상처가 아문다고 보고되었다[29]. 따라서, 본 연구에서 생산한 monomer 형태의 recombinant TB4의 상처치유 효능이 더 우 수하다고 판단되며, 앞으로 다양한 동물 모델에서의 상처치유 연구가 기대된다.

결 론

Mouse thymosin β-4 (TB4) 유전자를 Escherichia coli에서 intein-tag 융합 단백질로 발현시키고 정제하였다. Recombinant TB4-intein 융합 단백질의 분자량을 10% glycine SDSPAGE로 확인한 결과, 세포 내 soluble 분획에서 60 kDa의 단백질을 얻을 수 있었고, 유도발현 최적 조건은 0.1 mM IPTG, 25℃에서 3시간 동안 유도 발현할 때가 최적임을 확인 하였다. Recombinant TB4 만을 얻기 위해서 chitin bead를 이 용한 친화성 크로마토그라피 후 DTT를 이용해 self-cleavage 를 일으킨 다음, 분자량을 확인한 결과, 5 kDa으로 확인되었으 며, 순도는 95% 이상이었다. 정제한 recombinant TB4가 생물 학적 기능을 보유하고 있는지 확인을 하기 위하여, TB4를 농도 별(1~1,000 ng/ml)로 하여 HT1080 cell을 이용한 cell migration을 측정한 결과, 모든 농도에서 recombinant TB4가 화학 합성한 TB4 보다 약 20% 이상 높은 활성을 보였으며, recombinant TB4 1 ng/ml의 농도에서 cell migration 활성이 가장 높게 나타났다. Recombinant TB4를 마우스 상처 부위에 5일 동안 매일 처리한 결과(최종 처리 농도 0.5 mg/ml), 화학합성 TB4 보다 recombinant TB4의 상처치유 활성이 약 35% 더 높 음을 알 수 있었다. 따라서, 본 연구에서 생산한 monomer 형 태의 recombinant TB4의 상처치유 효능이 기존 recombinant TB4 보다 더 우수하다고 판단되며, 앞으로 다양한 동물 모델에 서의 항암 효능과 상처치유 효능 연구가 기대된다.