Evaluation of Anti-thrombosis Activities of Different Parts of Cannabis sativa L.

대마 부위별 추출물의 항혈전 활성

Abstract

The high fatality of COVID-19 (Corona Virus Disease 2019) is closely related to acute pneumonia and severe blood clot formation in brain, heart, kidney and lung. The use of low-molecular weight heparins has been shown to reduce the risk of thrombosis and reduce fatality rates among COVID-19 patients. In this study, we investigated the antithrombotic activity of different parts of C. sativa extracts to determine its potential in preventing blood clots in patients with thromboprophylaxis. The extracts of leaf, stem, root, immature flower and seed of C. sativa showed strong inhibitory activities on blood clot formation. In particular, the flower extract showed the strongest inhibitions against blood coagulation factors and thrombin. Strong hemolysis activities were observed in flower extract and seed extract, suggested that removal of the hemolysis active compounds in th extracts is necessary. This is a first report of anti-thrombosis activities of different parts of C. sativa extracts, and our results suggest that C. sativa extract has potential has a valuable bioresource for high-value products.

COVID-19 (Corona Virus Disease 2019) 감염증에 의한 주요 사망원인은 급성폐렴과 신체 전체에 나타나는 혈전증이며, 증가된 면역반응에 의한 사이토카인 폭풍(cytokine storm)은 고염증 상태와 함께 비정상적인 혈전생성을 더욱 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 최근 혈전 생성을 억제하는 low molecular weight heparins의 사용이 사망률을 감소시키며, 대마 추출물이 COVID-19 증상의 완화 및 치료에 효과적임이 보고되었다. 본 연구에서는 대마 성분이 항혈전 활성에 기여하는지를 확인하고자, 대마 잎, 줄기, 뿌리, 미성숙 꽃 및 종실 추출물을 각각 조제하고 이를 대상으로 혈전 생성 억제활성을 평가한 결과, 모든 부위 추출물에서 우수한 항혈전 활성을 확인하였으며, 특히 대마 꽃 추출물에서 강력한 혈액응고인자 저해에 의한 혈전 생성 억제활성을 확인하였다. 그러나 대마꽃 추출물은 적혈구 용혈활성도 강력하여 향후 항혈전 활성물질의 분리가 필요하였다. 본 연구는 대마 부위별 추출물의 항응고 활성에 대한 최초 보고이며, 향후 국내에서 연구 및 사용이 제한된 대마를 이용한 고부가가치 생물소재 개발이 필요함을 제시하고 있다.

서론

2019년 12월 31일 중국 우한에서 원인불명의 호흡기 폐렴이 WHO (World Health Organization)에 보고되었으며, 이는 COVID-19 (Corona Virus Disease 2019)라는 감염증 명칭으로 명명되었다[11]. 높은 인체 감염력과 전파력으로 인해 2020년 3월 11일 WHO에서 “PANDEMIC”을 선언하였으며 현재에 도전 세계적으로 유행하고 있다[12]. COVID-19의 원인 바이러스는 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)로 확인되었으며, 호흡기 상피세포, 코와 입 점막, 폐, 동맥혈관, 심장, 신장 등에 존재하는 세포 표면의 ACE2 (Angiotensin-converting enzyme 2) 수용체를 통해 감염이 나타나는 것으로 알려져 있다[7, 12, 31]. 현재 대부분의 감염 환자는 1~3주내에 회복되고는 있으나, 전 세계 사망자는 2021년 5월 현재 320 만 명을 넘어서고 있는 실정이다. 주요 증상과 사망원인은 급성폐렴과 신체 전반적으로 광범위하게 나타나는 혈전증으로 보고되어 있다[7, 11, 12, 20, 22, 26]. 특히 혈전증의 경우 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 혈관 내피세포의 직접적인 변형 및 손상으로 인해 혈소판 응집에 의한 혈전 생성이 개시되며, 이어서 혈액응고계의 비정상화인 활성화 및 면역반응 활성화에 따른 폭발적인 혈전 생성이 나타나는 것으로 알려져 있다[12,15]. 또한 증가된 면역반응에 의한 TNFα, IL-2, IL-6, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 등이 사이토카인 폭풍(cytokine storm)을 유발하며 이는 고염증 상태와 함께 비정상적인 혈전 생성을 활성화 시키며, 이러한 과도한 혈전이 심장, 뇌, 폐, 신장 등에서 나타나는 경우 사망 위험을 크게 증가시키는 것으로 알려져 있다[7,26]. 따라서 WHO에서는 COVID-19 감염증 치료시에 혈전 생성을 억제하는 low molecular weight heparins (LMWHs)의 사용을 권장하고 있으며[12]. 실제 LMWHs 사용시 7일 후 사망률을 48%, 28일 후 사망률을 37% 감소할 수 있음이 확인되었다[12,36]. 또한 혈전 절제술(thrombectomy) 역시 COVID-19 감염환자의 쇼크를 막는 중요 방법으로 제안되고 있으며, 백신 접종 전 후 항혈전제 사용은 혈전증으로 나타날 수 있는 위험성을 낮출 수 있다고 알려져 있다.

한편 대마(Cannabis sativa L.)는 삼과에 속하는 1년생 초본식물로, 바람에 의해 수정되는 풍매화이면서 불완전화로 암수가 구분되는 자웅이주식물이다. 대마는 중앙아시아가 원산지로 알려져 있으나, C. sativa subsp. sativa, C. sativa subsp. indica 및 C. sativa subsp. ruderalis의 3종이 전 세계적으로 분포되어있으나, 풍매화의 특성상 600여종 이상의 변종이 알려져 있다 [10]. 외국에서는 외형과 환각 중독성 물질로 알려진 tetrahydrocannabinol (THC) 함량으로 헴프(hemp)와 마리화나(mari- huana)로 구분하고 있는 바, 통상 헴프는 THC가 0.3% 이하로 함유량이 낮아 산업용으로 이용 가능하나, 마리화나는 6~20% 이상의 THC를 함유하고 있어 이용의 제한이 있다[13]. 국내의 경우에도 1977년 1월부터 시행한 [대마관리법]에 따라 대마를 수입 또는 수출하는 행위 및 제조하는 행위, 매매하는 행위, 흡연 또는 섭취하는 행위, 타인에게 매매 및 사용을 위한 장소를 제공하는 행위를 일체 금지하고 있다.

대마는 인류 역사와 가장 밀접한 관련성을 가진 식물 중 하나로, 식용, 약용, 화장품, 섬유, 생활용품 등 다양하게 이용[1, 10, 13]되어 왔으며, 대마 종실에서 THC를 제거한 헴프 씨드 너트는 영양성과 기능성이 우수하여 식품소재로 각광받고 있다[5, 10, 30]. 또한 대마로부터 항염증[1, 2, 30], 항생제 내성 균주에 대한 항세균 및 항진균[6], 통증완화[30] 및 우울증 개선 [3], 암세포 성장 억제[24], 신경보호[18], 항산화[8] 및 혈소판응집저해에 의한 혈전증 개선[29]과 같은 유용 생리활성이 보고되면서 의약품 소재와 관련 산업이 급성장하고 있다[23,28]. 최근 대마는 COVID-19와 관련하여 주목받고 있다. COVID- 19로 인한 글로벌 락다운(Lockdown measures), 코로나 블루 (COVID-19 Blue) 현상 및 자가격리 실행은 전 세계적으로 대마의 사용 증가로 나타나고 있으며[5,9], 또한 대마 추출물이 COVID-19 증상의 완화 및 치료에 효과적임이 알려지고 있다 [9, 14, 16, 33]. 최근 대마 추출물이 인간 폐 상피세포 A549 세포주에서 ACE2의 발현을 억제하며 IL-6, IL-8 생성을 억제함이 보고[2,25]되었으며, 폐 상피세포의 COVID-19 관련 염증반응을 억제함이 확인되었다[2,26]. 대마 추출물의 주요 활성 물질로는 강력한 항염증 활성으로 미국 FDA 의료용 사용승인을 받은 cannabidiol (CBD)과 △9-THC로 추측되고 있으며[9, 16, 25], 특히 CBD의 경우 ACE2 단백질의 발현 및 SARS- CoV-2의 세포내 침입에 필수적인 TMPRSS2 (Transmembrane serine protease 2)단백질의 발현도 저해함이 알려져 있다[6,36]. 그러나 현재까지 CBD를 포함한 cannabinoids에 의한 혈전 생성억제는 보고된 바 없으며[17], 대부분의 연구는 CBD를 고농도로 포함하는 꽃에 대한 연구가 대부분이다.

따라서 본 연구에서는 국내산 대마의 잎, 줄기, 뿌리, 미성숙 꽃 및 종실 추출물을 각각 조제하고 이를 대상으로 혈전 생성 및 적혈구 용혈에 미치는 활성을 평가하여, 향후 항혈전 활성 소재로서 대마 사용 가능성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

실험재료 및 시약

본 실험에 사용된 대마 종실(CS-H), 대마 꽃(CS-F), 대마잎(CS-L), 대마 줄기(CS-S), 대마 뿌리(CS-R)는 2020년 경북 안동의 대마재배 허가자(박무순)로부터 제공받았으며(Fig. 1), 본연구는 마약류취급자(마약류학술연구자) 허가(제 267호) 하에 진행되었다. 확증표본은 안동대학교 식품영양학과에 보관하고 있다. 음건, 세절한 대마 시료들은 각각 20배의 70% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 가한 후 상온에서 2일 동안 침지하여 추출하였으며, 추출액을 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1110S, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)후 동결건조하였다. 추출물들은 DMSO에 100 mg/ml 농도로 녹인 후, 항혈전 활성 평가시 최종농도가 5 mg/ml 되도록 첨가하였으며, 적혈구 용혈활성 평가시에는 최종농도가 1 mg/ml 되도록 첨가하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였다[27]. 기타 시약은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약급 이상의 제품을 구입하여 사용하였다.

Fig. 1. The representative photography of 5 different parts of Cannabis sativa L. used in this study. Symbols: CS-H: Seed (hempseed), CS-F: Flower, CS-L: Leaf, CS-S: Stem, CS-R: Root of Cannabis sativa L.

항응고 활성

부위별 대마 추출물의 항응고 활성은 각각 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다[19, 21, 27]. 모든 실험은 3회 반복하여 평균치로 나타내었으며, 각각의 항응고 활성은 시료 첨가시의 응고 시간의 평균치를 무첨가시의 응고 시간의 평균치의 비로 나타내었다[27].

인간 적혈구 용혈활성

부위별 대마 추출물의 인간 적혈구 용혈 활성은 PBS로 3 회수 세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 부위 추출물 100 μl를 가하여 최종농도가 1 mg/ml 가 되도록 조정한 후 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1, 500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100 (1 mg/ml)및 amphotericin B를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다[21,27].

(%)Hemolysis=[(Abs. S - Abs. C)/(Abs. T - Abs. C)]×100

Abs. S : 시료 첨가구의 흡광도, Abs. C : DMSO 첨가 구의 흡광도,

Abs. T : Triton X-100 첨가구의 흡광도.

추출물의 총 폴리페놀 및 기타 분석

Total polyphenol (TP) 및 Total flavonoid 함량 측정은 기존의 보고된 방법[32]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량은 phenol-sulfuric acid법으로, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였으며, 각각 sucrose와 glucose를 표준물질로 사용하였다[19,21].

통계분석

모든 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다. 실험 결과는 SPSS 26.0 버전을 사용하여 mean ± SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결과 및 고찰

부위별 대마 추출물의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총당 및 환원당 분석

부위별 대마 추출물을 제조한 후 이의 유용성분을 분석하였으며, 그 결과는 Table 1에 나타내었다. 대마 종실에서 가장 높은 12.9% 추출효율을 나타낸 반면 줄기는 3.5%의 낮은 추출효율을 보였다. 부위별 추출효율은 종실 > 잎 > 꽃 > 뿌리 > 줄기의 순으로 나타났다. 부위별 추출물의 유용성분 분석 결과, 총 폴리페놀 함량은 꽃 추출물에서 가장 높은 90.2 mg/g 의 함량을 보였으며, 잎 추출물(73.8 mg/g), 뿌리 추출물(41.9 mg/g), 줄기 추출물(31.5 mg/g) 순으로 나타났으며, 종실 추출물이 가장 낮은 7.5 mg/g을 보였다. 플라보노이드 함량 측정 결과에서도 총 폴리페놀 함량과 유사하게 꽃 > 잎 > 뿌리 > 줄기 > 종실 순으로 나타났다. 총당 함량의 경우 잎 추출물과 줄기 추출물에서 가장 높은 230.6~231.8 mg/g을 보인 반면 뿌리, 꽃, 종실의 경우 상대적으로 낮은 함량을 보였다. 환원당 함량은 잎 > 꽃 > 줄기 > 뿌리 > 종실 순으로 나타났다. 따라서, 대마는 부위별 구성성분의 차이가 확연하며, 꽃과 잎에서 다른 부위보다 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타내어 더욱 우수한 생리 활성을 나타내리라 예상되었다[21,27].

Table 1. Component analysis of the ethanol extracts of 5 different parts of Cannabis sativa L.

Symbols: CS-H: Seed (hempseed) extract, CS-F: Flower extract, CS-L: Leaf extract, CS-S: Stem extract, CS-R: Root extract of Cannabis sativa L. Different superscripts within a column differ significantly (p<0.05).

부위별 대마 추출물의 항혈전 활성

부위별 대마 추출물의 항응고 활성을 TT, PT, aPTT를 각각 측정하여 평가하였다. 활성대조구로는 thrombin 및 혈액응고인자 저해를 통해 혈전 생성을 억제하는 aspirin [35,37]을사용하였으며, aspirin은 1.5 mg/ml 농도에서 용매 대조 구에 비해 TT, PT, aPTT를 각각 1.57, 1.42 및 1.63배 증가시켜 우수한 항응고 활성을 나타내었다. 반면, 부위별 대마 추출물(5 mg/ ml)의 TT 측정 결과 모든 부위 추출물에서 우수한 트롬빈 저해가 나타났으며, 특히 꽃 추출물에서 가장 우수한 2.75 배의 TT 연장효과를 확인하였다. 줄기, 뿌리, 종실 추출물에서도 2.0배 이상 연장된 TT를 확인하였으며, 예상과는 달리 잎 추출물에서는 1.69배의 상대적으로 낮은 트롬빈 저해에 의한 항응고 활성을 보였다(Fig. 2A).

Fig. 2. Effect of the ethanol extracts of 5 different parts of Cannabis sativa L. on (A) thrombin time, (B) prothrombin time and (C) activated partial thromboplastin time. Anti-coag- ulation activity was calculated on the clotting time of sample divided by the clotting time of solvent control in blood coagulation assay. The thrombin time (TT), prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aPTT) of solvent control (dimethylsulfoximide) were 19.5 sec, 15.6 sec and 51.2 sec, respectively. Data are means ± SD of triplicate determinations. Different superscripts within a panel differ significantly (p<0.05).

한편 프로트롬빈 저해에 의한 항응고 활성 측정 결과, 꽃 추출물에서 가장 강력한 1.8배 PT 연장효과를 보인 반면, 다른 부위 추출물에서는 1.21~1.33배의 상대적으로 약한 프로트롬빈 저해를 보였다(Fig. 2B). 외부 상처없이 나타나는 내 인성 혈전 생성에 가장 중요한 혈액응고인자 저해에 의한 항응고 활성 측정 결과 역시, 꽃 추출물에서 가장 강력한 7.02배 연장된 aPTT를 보였으며, 뿌리(1.88배 연장), 잎(1.73배 연장), 줄기 (1.55배 연장), 종실(1.36배 연장)의 순으로 항응고 활성을 나타내었다(Fig. 2C). 이러한 결과는 대마의 다양한 부위가 항응고 활성을 나타냄을 의미하고 있으며, 특히 대마 꽃 추출물의 경우 혈액응고인자 저해를 통한 강력한 항응고제로 개발 가능함을 제시하고 있다. 또한 대마 줄기와 대마 추출물은 대마 꽃 및 잎 추출물과는 달리 THC 및 CBD와 같은 phyto-cannabi- noids 성분을 함유하지 않음[5,13]이 알려져 있으나 우수한 항응고 활성을 나타내어, 줄기 및 뿌리 등의 미이용 부산물을 이용한 항혈전제 개발 가능성을 검토할 필요가 있음을 확인하였다. 향후 각각의 부위 추출물의 항혈전 활성 물질의 분리확인이 필요하며, 대마 활성 성분이 phyto-cannabinoids와 함께 COVID-19 감염증의 고혈전 생성 위험을 상보적으로 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.

부위별 대마 추출물의 인간 적혈구 용혈 활성

부위별 대마 추출물의 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였으며, 그 결과는 Table 2에 나타내었다. 먼저, 용매 대조구로 사용된 DMSO는 용혈 활성이 없었으며, Triton X-100은 1 mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 또한, 항암제, 항진균제로 사용되고 있는 amphotericin B의 경우 0.0125 mg/ml 농도에서 75% 이상 적혈구를 용혈시킴을 확인하였다. 한편 대마 종실 추출물과 대마 꽃 추출물의 경우 1 mg/ml 농도에서 90% 이상의 적혈구 용혈활성을 보여 고농도 사용 시문 제가 발생할 수 있음을 확인하였으며, 잎, 줄기 및 뿌리 추출물의 경우 1 mg/ml 농도에서 5.4% 이하의 무시할 만한 용혈 활성을 보였다. 따라서 향후 대마 꽃 및 종실 추출물로부터 용혈을 나타내지 않는 항혈전 활성물질의 분리가 필요하다고 판단된다. 본 연구는, 최근 COVID-19 감염증 치료제로 부상하고 있는 대마 추출물의 부위별 항응고 활성에 대한 최초 보고이며, 향후 국내에서 연구 및 사용이 제한된 대마를 이용한 고부가가치 생물소재 개발이 필요함을 제시하였다.

Table 2. Hemolytic activities of the ethanol extracts of 5 different parts of Cannabis sativa L.

Symbols: CS-H: Seed (hempseed) extract, CS-F: Flower extract, CS-L: Leaf extract, CS-S: Stem extract, CS-R: Root extract of Cannabis sativa L. Different superscripts within a column differ significantly (p<0.05).

감사의 글

본 연구는 2020년도 안동시 지원사업에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.