Angiogenesis-inhibiting Effects of Prunus mume Butanol Fractions on Human Umbilical Vein Endothelial Cells

매실 부탄올 분획물에 의한 혈관 신생 억제 효과

Abstract

Prunus mume Sieb. et Zucc is distributed throughout Asia and has traditionally been used as medicine and food. P. mume is known to contain large amounts of various organic acids, minerals, and phenol components. To date, the trend of P. mume research has focused only on the effects of antioxidant, anticancer and antibacterial, with only a few studies have focused on angiogenesis. Angiogenesis is a common characteristic of metastatic cancer through which oxygen and nutrients are delivered to the cells and tissues. In the present study, angiogenesis-inhibiting activity was investigated by evaluating the total polyphenol and flavonoid contents of the P. mume butanol fraction (PBF) and their ability to inhibit VEGF-induced human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) proliferation, migration, invasion, and capillary formation. The polyphenols (12.81 mg GAE/g) and flavonoids (28.4 mg QE/g) of the PBF exhibited high antioxidant activity. The results of this study showed that PBF did not inhibit the proliferation of HUVECs at concentrations of 25-200 ㎍/ml and did not exhibit toxicity to normal cells. However, PBF inhibited the VEGF-induced mobility, invasion, and capillary formation of HUVECs. These results show that PBF inhibits the angiogenesis of HUVECs induced by VEGF. Therefore, PBF could serve as a therapeutic agent for the inhibition of angiogenesis.

Prunus mume Sieb. et Zucc는 아시아 전역에 분포되어 있으며 전통적으로 약과 음식에 사용되어져 왔다. 이러한 매실은 각종 유기산, 무기질 및 페놀성분이 다량으로 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 지금까지의 매실 연구 동향은 항산화, 항암, 항균 등의 연구에만 치중되어 있고 혈관 신생에 대한 연구는 거의 이루어져 있지 않다. 혈관 신생은 전이성 암의 일반적인 특징으로 이를 통하여 부족한 산소와 영양분을 타 조직에서 가지고 온다. 이 연구에서는 매실 부탄올 분획물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 VEGF로 유도된 인체 혈관 내피 세포의 증식과 이동성, 침윤 및 모세혈관 형성 억제능을 평가함으로서 혈관신생 억제 활성에 대하여 조사하였다. 매실 부탄올 분획물은 높은 항산화능을 가지고 있는 폴리페놀(12.81 mg GAE/g)과 플라보노이드(28.4 mg QE/g)를 함유하고 있다. 매실 부탄올 분획물은 25-200 ㎍/ml의 농도에서 인체 혈관 내피 세포의 증식을 억제하지 않았으며 정상 세포에 독성을 나타내지 않았다. 또한 매실 부탄올 분획물은 인체 혈관 내피 세포에서 VEGF에 의한 이동성, 침윤 및 모세혈관 형성을 억제하였다. 이 결과는 매실 부탄올 분획물이 VEGF에 의해 유도된 인체 혈관 내피 세포의 혈관 신생활성을 억제하는 것을 시사하였다. 따라서 본 연구는 매실 부탄올 분획물이 혈관 신생 억제를 위한 잠재적인 치료제로서의 가능성이 있음을 확인하였다.

서론

전 세계적으로 인구의 고령화와 더불어 흡연, 신체 활동 부족 및 서구적인 식습관으로 종양의 발생이 눈에 띄게 늘어나고 있다[12]. 일반적으로 종양의 진단에서 가장 중요한 점은 악성인지 양성인지를 판단하는 일이다. 양성종양은 국소적으로 한정된 부위에서만 천천히 증식하고 전이가 없는 것을 특징으로 가진다. 그러나 악성종양의 경우 매우 빠르게 성장하고 이를 유지 및 전이를 위해 다량의 산소 및 영양분이 요구되며 타 장기로 새로운 혈관을 형성하여 침윤을 진행한다[13,22]. 암에서의 혈관 신생은 주요 매개체인 혈관 내피 세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 다양한당 단백질이 상호작용하여 일어난다[21]. 특히 암에서 방출된 VEGF가 혈관 내피세포의 수용체 단백질인 VEGF receptor (VEGFR)에 부착되면서 혈관 신생 신호전달 경로가 활성화되어 암세포 생장 및 전이를 위한 혈관 신생에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다[5]. 또한 최근 연구에서는 체내에서 과다 생성된 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 VEGFR 에 의한 혈관 신생 신호전달경로의 신호전달 물질로 검증되었다[4].

현재 가장 일반적인 암의 치료 방법은 수술적 요법, 방사선요법, 화학 요법 및 면역 요법 등이 있다[32]. 하지만 암은 복합적인 유전자와 신호 전달 경로가 관여하는 질환이기 때문에 단순하게 암세포 자체만을 제거하는 단일 치료방법으로는 성공적인 치료 효과를 확인하기가 어려운 실정이다. 따라서 최근에는 단순히 암세포의 사멸만이 아니라 혈관 신생을 억제하여 성장 및 전이를 억제하는 치료제가 개발되고 있다[33]. 더불어 이런 치료 방법은 독성이 매우 높고 정상세포를 공격하는 등 다양한 부작용을 수반할 수 있기에 상대적으로 독성이 낮은 천연물을 이용하여 암의 예방 및 치료를 위한 연구가 진행되고 있다. 천연물에 의한 암세포 사멸 관련 연구는 대표적으로 Pacific yew Taxus brevifolia에서 추출한 ‘Taxol’이라는 천연물질을 이용한 항암제가 개발되어 사용되고 있다[14,25].

장미목 장미과 벚나무 속에 속하는 매화나무(Prunus mume Sieb. et Zucc)의 과실인 매실은 중국 사천성과 호북성의 산간지가 원산지로 알려져 있으며 한국, 중국, 일본 등지에 널리 분포하고 있다. 우리나라에서 매실은 예로부터 전통 약재나식재료로 사용되어져 왔다[11,24]. 매실은 다량의 citric acid, malic acid, succinic acid 및 fumaric acid와 같은 유기산과 미네랄을 함유하고 있어 피로회복, 소화, 식욕 증진 등의 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다[2,27]. 최근 매실의 약리학적 효능에 대한 연구로는 항산화 활성[16], 생리활성 물질 분석 [31], 피로 및 운동 성능 개선[17], 비브리오 패혈증에 대한 항균 활성[8], 포도당 대사 증진 및 복부비만 억제 효과[18] 등이 보고되었다. 또한 매실 추출물과 그 성분의 항암효과에 대하여 간암[9], 피부암[29] 및 백혈병 세포[3] 등에 대한 연구가 진행되고 있다. 하지만 매실에 대한 연구의 대부분이 추출물 상태에서 이루어져 있어 분획물에 대한 연구는 적은 편이다. 게다가 매실 분획물이 인체 혈관 내피세포 신생 억제에 미치는 영향에 대한 연구 또한 거의 진행되어 있지 않다.

따라서 본 연구는 매실 에탄올 추출물을 이용하여 제조한 매실 부탄올 분획물(PBF)의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 인체 혈관 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 세포 생존 및 VEGF에 의해 유도된 혈관신생 억제에 미치는 영향을 조사하여 매실을 이용한 기능성 식품소재 개발에 있어 기초 자료로서 활용하고자 한다.

재료 및 방법

매실 추출물 및 분획물의 제조

매실 추출물 및 분획물 제조를 위한 매실은 순천엔 매실㈜에서 구입하였다. 먼저 세척한 매실의 수분을 제거한 후 씨를 분리하여 파쇄하였다. 매실 파쇄액은 에탄올과 1:1(w/v)로 혼합하여 24시간 동안 실온에서 추출 후 3, 000 rpm으로 5분간 원심분리하였고, 그 상층 액을 Büchner funnel에 Whatman fil- ter paper NO.2를 이용하여 감압 여과하였다. 수득한 여과액은 감압 농축 후 동결 건조를 실시하여 계통 분획을 진행하였다. 매실 분획물은 매실 추출물과 다이클로로메테인 그리고 물을 이용하여 1:10:10(w/v/v)의 비율로 혼합 후 분리한 다이클로로 메테인 분획물을 감압 농축하고, 이후 헥산, 메탄올, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획을 실시하여 얻은 각각의 분획물은 모두 감압 여과 및 동결 건조 후 냉동 보관하여 실험에 사용하였다[14].

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다[7]. 매실 부탄올 분획물 10 μl에 증류수 90 μl와 2N Folin-Ciocalten 시약(Sigma-Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA) 10 μl를 첨가하고 5분 동안 반응시킨 후 20% Na₂CO₃ (Junsei Chemical Co., Ltd, Japan)를 100 μl 가하여 1시간 동안 암실에서 방치하였다. 반응물의 흡광도는 760 nm에서 UV/ Vis-spectrophotometer (U-1800, Hitachi)를 사용하여 측정하였고, gallic acid (Sigma-Aldrich, Co.)를 이용한 표준 곡선을 작성하여 양을 환산하였다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 Abdel-Hameed방법을 변형하여 측정하였다[1]. 10배로 희석한 매실 부탄올 분획물 1 ml에 5% sodium nitrite 0.15 ml을 가하여 6분간 반응시킨 후 10% aluminum chloride 0.3 ml를 넣고 5분간 방치하였다. 이후 1N NaOH 1 ml을 가하여 교반 후 510 nm에서 UV/Vis-spectrophotometer (U-1800, Hitachi)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 quercetin (Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성하였고, 이를 바탕으로 총 폴라보이드 함량을 환산하였다.

세포 배양

본 실험에 사용한 인체 혈관 내피세포(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)는 LONZA (Basel, Switzerland)에서 분양을 받아 사용하였다. Endothelial Basal Medium-PLUS (Lonza, Co, ) 배지에 kit 구성물인 rh VEGF 0.5 ml, L-Glutamine 25 ml, ascorbic acid 0.5 ml, hydrocortisone hemisuccinate 0.5 ml, rh EGF 0.5 ml, heparin sulfate 0.5 ml, FBS 10 ml, rh FGF basic 0.5 ml, rh IGF-I 0.5 ml를첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator (Thermo Fisher Scientific) 에서 계대배양하여 사용하였다.

세포 생존율 측정

매실 부탄올 분획물 처리에 의한 세포 독성 평가는 생존한 세포 내의 단백질 총량을 흡광도를 통하여 세포 생존 정도를 확인하는 방법인 sulforhodamine B (SRB, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)법을 이용하여 측정하였다. 혈관 내피 세포를 2×10⁴ cells/ml의 농도로 48-well plate에 분주한 다음 CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 매실 부탄올 분획물 (25-200 μg/ml)을 첨가하여 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 12% TCA를 넣어 4℃에서 세포를 고정시키고 증류수로 well plate을 세척한 후 0.4% SRB 용액을 첨가하여 염색하였다. 염색 종료 후 1% acetic acid (Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan)로 세척하고 10 mM Tris buffer (Sigma Aldrich Co.)를 첨가하여 SRB를 녹였다. 상등액을 96-well plate에 옮겨 UV/Vis-spectrophotometer (U-1800, Hitachi)를 사용하여 540 nm로 흡광도를 측정하였다.

인체 혈관 내피세포 이주 억제능 측정

인체 혈관 내피세포 이주 억제 능은 Pang 등의 방법을 변형하여 측정하였다[23]. 인체 혈관 내피세포에 0.25% trypsin EDTA 용액을 처리한 후 single cell로 만들어 2×10⁵ cells/ml 가 되도록 희석해서 24-well plate에 첨가한 다음 CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간이 지난 후 각 plate의 배양액을 제거한 후 pipette tip을 이용하여 가로 세로로 길게 상처를 내고 PBS로 1회 세척 후 20 ng/ml VEGF 및 매실 부탄올 분획물(100-200 μg/ml)을 첨가하고 10시간 더 배양하였다. 이후 인체 혈관 내피세포의 이주는 200배율의 광학현미경 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였으며, 이주된 세포의 수는 카운팅하여 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.

인체 혈관 내피세포 침윤 억제능 측정

인체 혈관 내피세포 침윤 억제 능은 Pang 등의 방법을 변형하여 측정하였다[23]. 매실 부탄올 분획물이 인체 혈관 내피세포의 침윤에 미치는 영향을 평가하기 위해 24-well trans well insert culture unit (8- μm pore size, Transwell, Corning, NY, USA)를 사용하였다. Upper chamber에 매실 부탄올 분획물(100-200 μg/ml)과 인체 혈관 내피세포를 4×10⁴ cells/ml의 농도로 첨가한 후 bottom chamber에는 20 ng/ml VEGF를 첨가한 1 ml의 endothelial Basal Medium-PLUS (Lonza, Basel, Switzerland) 배지를 분주하였다. 이후 CO₂ incubator 에서 12시간 동안 배양한 후 침윤된 세포를 4% paraformalde- hyde고 고정하고 1% crystal violet 용액을 첨가하여 염색하였다. 인체 혈관 내피세포의 침윤은 200배율으로 설정된 광학현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용해서 관찰하였으며 침윤한 세포의 수는 카운팅하여 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.

모세혈관 생성 억제능 측정

모세혈관 생성 억제 능은 Pang 등의 방법을 변형하여 측정하였다[23]. 성장인자가 포함되지 않은 matrigel (Corning, New york, USA)을 5 mg/ml의 농도로 희석하여 96-well plate 에 30 μl씩 분주한 후 CO₂ incubator에서 1시간 동안 굳힌다. 인체 혈관 내피세포는 0.5% FBS 배지에서 6시간 동안 적응시킨 후 20 ng/ml의 VEGF 및 매실 부탄올 분획물을 농도별로 처리한 후 1시간 더 배양시킨다. 배양된 인체 혈관 내피 세포를 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single cell로 만들고 이를 모두 96-well plate의 matrigel 위에 분주한 다음 CO₂ incubator에서 10시간 배양하였다. 이후 염색된 인체 혈관 내피 세포는 200배율의 광학현미경(Leica Microsystems)으로 관찰하였다.

통계처리

모든 실험은 적어도 세 번 반복되었고 데이터는 평균 ± SD 으로 표현하였으며, 각 실험군은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 통계적 유의성은 one-way ANOVA 검정에 이어 Tukey-Kramer 다중 비교 테스트 혹은 Durnnett’s 다중 비교 테스트에 의해 결정되었다. 대조군과의 비교에서 중요한 값은 #p<0.05, ##p<0.01 및 ###p<0.001로 정의하였고 VEGF 처리 군과의 비교에서 중요한 값은 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001 로 정의하였다.

결과 및 고찰

매실 부탄올 분획물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

건강한 상태의 내피세포는 정지되어 있지만 암의 성장으로 인하여 저산소증이 유도가 되거나 영양분이 결핍이 되면 VEGF에 의해 혈관 신생이 일어나게 된다. 체내에서 활성화되어 증가한 ROS는 VEGF의 하위 신호분자로서 혈관 신생 반응을 유도한다[6]. Hu 등[10]은 폴리페놀계 물질인 resveratrol이 풍부한 호장근 뿌리 추출물에 대한 연구에서 호장근 뿌리 추출물이 세포내 ROS의 발현을 감소시켰다고 보고한 바 있으며, Scoditti 등[26]의 연구에 따르면 폴리페놀계 물질인 oleur- opein, hydroxytyrosol, resveratrol 및 quercetin을 때HUVEC에처리하였을 때 세포 내 ROS 감소와 함께 혈관 신생의 억제를 유도하였다. 이렇게 천연 폴리페놀과 플라보노이드는 우수한 항산화 활성으로 활성산소를 감소시킨다[20]. 매실 부탄올 분획물의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 매실 부탄올 분획물의 100, 250 및 500 μg/ml 각각의 농도 별 총 폴리페놀 함량은 1.36, 4.77 및 12.81 mg GAE/g이며 총 플라보노이드 함량은 22.7, 24.9 및 28.4 mg QE/g으로나타났다. 원료인 매실의 경우 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 풍부하며, 이전에 보고된 연구에서 매실 부탄올 분획물은 다른 분획물과 비교하여 DPPH radical scavenging activity와 hydrogen peroxide scavenging activity에서 우수한 항산화 활성이 있는 것으로 나타났으나 메탄올 및 에틸아세테이트 분획물의 α-glucosidase 억제 활성에는 미치지 못하였다고 보고된바 있다[15,28]. 결과적으로 매실 부탄올 분획물은 높은 항산화 능을 함유하고 있는 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 풍부하며, 이에 따라 ROS의 효과적인 감소를 통하여 혈관 신생을 유도하는 신호분자를 억제할 것으로 기대할 수 있다.

Table 1. Total polyphenol and flavonoid contents of Prunus mume butanol fraction (PBF) extract

¹⁾PBF 100: Prunus mume butanol fraction 100 μg/ml

²⁾PBF 250: Prunus mume butanol fraction 250 μg/ml

³⁾PBF 500: Prunus mume butanol fraction 500 μg/ml

⁴⁾GAE: Gallic acid equivalent

⁵⁾QE: Quercetin equivalent

Data values were expressed as mean ± SD of triplicate determinations.

매실 부탄올 분획물의 인체 혈관 내피세포 증식에 미치는 영향

매실 부탄올 분획물이 인체 혈관 내피세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 SRB assay를 통하여 확인하였다. 이 실험 방법은 trichloroacetic acid에 의해 생존 세포만 well plate에 부착되어 세포 단백질 내염기성 아미노산 잔기와 SRB가 결합하여 마지막으로 처리하는 tris buffer에 녹아 나오는 흡광도를 통해 생존율을 측정할 수 있다[30]. 매실 부탄올분획물의 처리가 인체 혈관 내피세포의 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 24시간 동안 처리한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 매실 부탄올 분획물은 25-200 μg/ml의 농도에서 인체 혈관 내피세포의 증식에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 매실 부탄올 분획물이 인체 혈관 내피 세포의 증식에 관여하지 않으며, 정상 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있다.

Fig. 1. Effect of Prunus mume butanol fractions (PBF) on proliferation of HUVECs. Cells were treated with PBF for 24hr. Cell viability was determined by SRB assay. Data values were expressed as mean±SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with the control at *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 by one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison.

매실 부탄올 분획물의 인체 혈관 내피세포 이주 억제능 측정

혈관 신생이 진행될 때 혈관 내피세포의 이동이 급격하게 진행되기 때문에 매실 부탄올 분획물이 인체 혈관 내피 세포의 이동이 미치는 영향에 대하여 알아보기 위해 wound healing assay를 진행하였다(Fig. 2). 대조군과 비교했을 때 VEGF 20 ng/ml을 처리하였을 때 세포의 이동이 급격하게 증가한 것을 알 수 있다. 하지만 매실 부탄올 분획물을 처리하였을 때 100, 150 및 200 μg/ml의 농도에서 VEGF 단독 처리 군과 비교하여 각각 22.89%, 40.79%, 64.14% 저해되는 것으로 나타났다. 이 결과는 매실 부탄올 분획물이 VEGF로 유도된 인체 혈관 내피 세포의 이동성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다.

Fig. 2. Effects of PBF on VEGF-induced chemotactic mobility in HUVECs. HUVECs were scratched by a pipette and treated with or without 20 ng/ml of VEGF and 100, 150, 200 μg/ml of PBF. (A) After incubation for 10 hr, migrated cells were photographed (magnification×200) and quantified by cell counting. (B) Significant of difference were compare with control at ^##p<0.01, ^###p<0.001, and with VEGF treatment at **p<0.01, and ***p<0.001 by one-way ANOVA and Dunnett’s multiple comparison.

매실 부탄올 분획물의 인체 혈관 내피세포 침윤 억제능 측정

인체 혈관 내피세포가 VEGF에 의해 신호를 받으면 세포의 증식, 이동과 더불어 주화성을 보이며 타 조직으로의 침윤을 진행하게 된다[19]. Fig. 3는 매실 부탄올 분획물이 VEGF로 자극된 인체 혈관 내피세포의 침윤을 억제할 수 있는지 trans-well invasion assay로 알아본 결과이다. VEGF 20 ng/ml 처리 군은 control군과 비교하여 인체 혈관 내피세포의 침윤을 강력하게 촉진시켰다. 그러나 100, 150 및 200 μg/ml 농도의 매실 부탄올 분획물의 처리는 VEGF에 의한 세포의 침윤을 농도 의존적으로 억제하였다. 특히 매실 부탄올 분획물 150, 200 μg/ml농도 처리군에서 통계적으로 유의한 차이를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 매실 부탄올 분획물이 암의 전이에 효과적인 억제제로서 이용 가능성이 높을 것으로 사료된다.

Fig. 3. Effects of PBF on VEGF-induced chemotactic invasion in HUVECs. HUVECs were treated with or without 20 ng/ml of VEGF and 100, 150, 200 μg/ml of PBF. (A) After incubation for 12 hr, migrated cells through the trans-well membrane was photographed (magnification ×200) and quantified by cell counting. (B) Significant of difference were compare with control at ^### p<0.001, and with VEGF treatment at *p<0.05 and ***p<0.001 by one-way ANOVA and Dunnett’s multiple comparison.

매실 부탄올 분획물의 처리가 모세혈관 형성 억제에 미치는 영향

VEGF를 통해 이동 및 침윤이 촉진된 혈관 내피 세포에서 모세혈관의 형성은 중요한 혈관 신생 과정이다. VEGF에 의해서 모세혈관 생성이 촉진된 혈관 내피세포에서 매실 부탄올 분획물의 처리가 미치는 영향을 알아보기 위해 capillary-like tube formation assay를 진행하였다(Fig. 4). VEGF를 처리한 군은 control군과 비교하여 견고한 관형 구조를 형성하고 있었다. 하지만 매실 부탄올 분획물을 처리하였을 때 모든 농도에서 관 형성 도가 억제되었고, 특히 농도의존적으로 유의적인관 형성 억제 활성을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 매실부탄올 분획물의 처리가 정상 세포에는 영향을 미치지 않고, 폴리페놀과 플라보노이드 복합체에 의해 VEGF의 신호 활성 하위 인자인 ROS를 소거하여 혈관 내피세포의 이동, 침윤 및 모세혈관 형성을 억제함으로써 암의 전이 및 혈관 신생을 억제하는 것으로 사료된다. 따라서 매실 부탄올 분획물은 혈관신생 억제에 효과적인 천연물 소재로서 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

Fig. 4. Effects of PBF on VEGF-induced capillary structure formation in HUVECs. HUVECs were treated with or with-out 20 ng/ml of VEGF and 100, 150, 200 μg/ml of PBF. After incubation on matrigel for 10 hr, capillary structure formation of endothelial cells was photographed (magnification ×200).

감사의 글

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 농생명기술개발사업의 지원을 받아 연구되었기에 이에 감사드립니다(316009-5).

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.