Immunomodulatory Effects of Euglena gracilis Extracts

Euglena gracilis 추출물의 면역조절 및 생리활성 분석

Abstract

Euglena gracilis is a microalga of great biotechnological interest that can create high levels of bioactive compounds, such as tocopherol, paramylon, and folic acid. The objective of this study was to investigate the biological activities of extracts from E. gracilis, especially those focused on immunological activity. E. gracilis biomass was extracted with hot water (HWE) and the remaining pellet was continuously extracted with methanol (HWME). First, we examined the effect of two extracts from E. gracilis on the production of nitric oxide (NO) and the expression of pro-inflammation cytokines, including IL-1β, IL-6, and TNF-α in murine macrophage RAW 264.7 cells. HWE treatment dose-dependently increased the production of IL-1β and TNF-α. On the other hand, treatment with HWME significantly decreased the generation of NO and pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated macrophage cells. In addition, other biological activities of the extracts were further analyzed: α-glucosidase inhibition, protein tyrosine phosphatase (PTP1B) inhibition, tyrosinase inhibition, xanthine oxidase (XO) inhibition, and angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibition. Analysis of these biological activities showed that HWE has more inhibitory effects than HWME against α-glucosidase, tyrosinase, and XO agents. However, the inhibition of PTP1B and ACE with HWME were higher than with HWE. Taken together, the results suggested that E. gracilis possesses various biological activities―especially immunological capabilities―through regulation of cytokine production. Therefore, E. gracilis extract may be potentially useful for food material with immune-regulating effects.

본 연구에서는 다양한 생리활성을 나타내는 compound를 함유하고 있는 것으로 알려진 Euglena gracilis를 hot water로 추출하고(HWE), 그 잔존물을 methanol로 추출(HWME)한 후, murine macrophage RAW 264.7 cell에 처리하여 면역활성을 측정하였다. Murine macrophage RAW 264.7 cell에서 HWE 처리로 IL-1β와 TNF-α가 농도의존적으로 증가되었고, lipopolysaccharide에 의해 유도되는 IL-6와 TNF-α 생성이 HWME 처리에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다. 또한 α-glucosidase, protein tyrosine phosphatase (PTP1B), tyrosinase, xanthine oxidase (XO), angiotensin converting enzyme (ACE) 등에 대한 저해활성을 조사하였다. 그 결과, E. gracilis HWE 추출물에서는 α-glucosidase, tyrosinase, ACE에서 약한 억제 활성을 보였으나, HWME 추출물에서는 PTP1B와 XO에서 유의적인 억제활성을 나타냈다. 따라서 본 연구를 통하여 E. gracilis 추출물의 면역조절 활성 뿐 만 아니라 당뇨와 심혈관 질환에 대한 유의적인 억제활성을 통해 다양한 건강기능성 식품의 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

서론

최근 수년간 면역과 관련된 전염병이 심각한 문제로 대두되고 있다. 이러한 면역 관련 전염병은 사전 예방적 대응책의 마련이 중요하고, 이러한 대응책으로 외부 환경에 대한 생체 방어 기능인 면역력이 중요히 여겨진다. 외부 자극에 가장 먼저 반응하는 비특이 적 면역과 특정 병원체 침입 시 항원으로 인식하여 선별적으로 제거하는 특이적 면역으로 구분 된다[11, 17, 18].

대식세포(macrophage)는 비특이적 면역 및 특이적 면역과 모두 관련되어 있으며, 병원체에 감염된 비정상 세포를 제거하거나 면역반응을 높이는 nitric oxide (NO)와 cytokine 등을 분비한다. NO는 bacteria, virus, 진균류와 같은 병원체에 반응하는 면역반응에 필수적이고 생리적 기능을 조절할 수 있으며, cytokine은 염증반응과 면역기능 조절에 관련된 세포 매개 성분이다[2,5].염증 반응이 증가함에 따라 대식세포 내 NO와 cytokine의 생성이 증가하여, NO와 cytokine의 생성을 억제하는 것 또한 염증성질환의 발생 억제를 위해 중요하다 [27,29]. 대식세포의 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 효소 작용으로 생성되는 NO는 포식된 pathogen과 구성분자들의 변형과 Fe-S를 함유하는 효소 작용을 억제함으로써 항미생물 효과를 지닌다고 알려져 있다 [31]. 또한 NO는 활성화된 대식세포나 호중구들로부터 분비되어 세포 외 병원체들을 사멸시킬 수 있으므로[3,21], 이에 따라 NO의 증가는 면역력이 증가되었음을 의미한다. 그러나, 염증에서의 과도한 NO는 조직 손상, 유전적 변이 및 신경 손상을 유발한다[25]. 염증 반응에는 다양한 cytokine이 관여하며, 염증 반응에 관련된 cytokine으로는 IL-1β, IL-6, IL-8, tumor necrosis factor-α (TNF-α) 등이 있다.

식물, 과일, 곡물 및 미생물 등 다양한 재료들은 기능성 식품의 원료로 꾸준히 활용되어 왔으며, 이중 미생물, 특히 미세조류 유래 성분들이 최근 건강기능성 식품 시장에서 두드러진 성장세를 보이고 있다. 특히 Spirulina sp. [9], Dunaliella sp. [4], Chlorella sp. [1], Schizochytrium sp. [10], Euglena sp. [7,19]와 같은 미세조류는 화장품, 건강기능식품, 식품 첨가제, 의약품 산업에서 항산화제의 원료가 되는 carotenoid, phycocyanin, 지질(EPA, DHA)과 같은 고부가가치 생산물의 생산에 이용되기도 한다[23, 24, 28]. 그 중 Euglena는 건강 기능성 식품으로 활용될 수 있는 유용물질 성분들을 다수 함유하고 있다. 비타민 E (tocopherol)와 folic acid는 건강기능성 의약 보조제, paramylon은 면역증진용 의약품, 불포화지방산은 기능성 식품 및 사료로의 제품화가 가능하다. 특히 paramylon은 다수의 연구에서 면역기능 강화, 항암 활성, 아토피성 피부염 등 피부질환의 억제, 급성 간 손상에 대한 간 보호, HIV 바이러스 억제, 상처 치유(wound healing) 등 다양한 효능이 입증된바 있다 [15, 22, 26, 30, 32].

재료 및 방법

Euglena gracilis의 배양 및 균체 추출물의 준비

E. gracilis 균체는 부산대학교 사회환경시스템공학과 이태호 교수님 연구실에서 제공받았다. E. gracilis를 glucose 15 g/l, monosodium glutamate 5 g/l을 첨가한 modified Hutner 배지(pH 3.5)로 27℃에서 7일간 배양한 후 E. gracilis 균체를 수확하였다. E. gracilis 배양액을 4, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 멸균수로 3회 세척하였다. 세척한 균체를 –80℃에서 24시간 냉동 후 동결건조기(Ilshin, Dongducheon, Korea)를 이용하여 동결건조시킨 후 그 분말을 distilled water (DW)와 1:4의 비율로 현탁하여 100℃, 10분간 열수 추출을 2회 반복한 후, 그 상등액을 HWE (hot water extract)로 명명하였다. 열수 추출 후 잔존한 침전물에 4 volume 의 methanol (MeOH)을 넣어 추출하였고 그 상등액을 HWME (hot water extraction 후 methanol extract)라고 명명하여 실험에 사용하였다. HWE와 MHWE를 Modul 4080C speed vacuum (Hanil Science Industrial Co., Gimpo, Korea)에서 건조하여 solild 양을 측정하고 최초 시료 농도를 30 mg/ml로 정량한 후 냉장 보관하였다. 시료는 실험시 희석하거나 직접 사용하였고, HWE는 DW, HWME는 MeOH로 녹이거나 희석하였다.

Nitric oxide (NO) production 측정

96-Well plate에 murine macrophage RAW 264.7 cell을 1×10⁵/200 μl/well로 seeding하여 24시간 후 phenol red가 첨가되지 않은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc, . Waltham, MA, USA) 배지로 교환하였다. 상기시료를 30, 100, 300 µg/ml 농도로 처리한 지 24시간 후 의상 등액을 취하여, Griess 시약을 이용해 세포 배양 상등액의 nitrite 함량을 측정하였다. 동량의 Griess 시약(1% sulfanilic acid, 0.1% N-naphthyl ethylenediamine in 2.5% phosphoric acid)을 100 μl 배양 상등액에 첨가하고 실온에서 10분 반응시켜 540 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device, Toronto, Canada)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Positive control은 시료 대신 lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 1 μg/ml로 처리하여 얻은 상등액을 측정하였고, 측정된 OD 값 은 nitrite를 이용한 표준 곡선 계산법으로 정량하였다.

또한, 면역억제능을 측정하기 위하여 RAW 264.7 cell을 seeding한 후 phenol red가 첨가되지 않은 DMEM 배지 교환 시 LPS (1 μg/ml)를 처리하고 동시에 E. gracilis 균체 추출물을 처리하여 nitric oxide 생성의 억제능을 확인하였다. 억제능은 LPS만 처리한 control을 기준으로 100%로 환산하고 이를 100 에서의 차를 구하여 표시하였다.

\(\text { 억제능 }(\%)=100-\left(\frac{\text { 시료처리군 } O D_{540 \mathrm{~nm}}-\text { 시료처리군 } \operatorname{Blank} O D_{540 \mathrm{~nm}}}{\text { 대조군 } O D_{540 \mathrm{~nm}}} \times 100\right)\)

세포생존율(cell viability) 측정

NO 측정 후 부착되어 있는 murine macrophage RAW 264.7 cell에 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Duchefa, Haarlem, Netherlands)를 이용하여 세포생존능을 측정하였다. MTT 시약을 0.5 mg/ml의 농도로 첨가하고 37℃에서 3시간 반응시킨 후, 상등을 제거하고 생성된 formazan complex를 DMSO로 녹여 이를 흡광도 570 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 측정하였다.

Cytokine 생성 측정

E. gracilis 균체 추출물을 murine macrophage RAW 264.7 cell에 처리한 후, 24시간에 배양 상등액내의 cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성 및 억제능은 Ready-SET-Go!™ Kit (Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 상등액을 각 capture antibody가 coating되어 있는 96-well plate에 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. Tween-20이 첨가된 PBS (PBS-T)로 3회 세척한 후 detection antibody와 avidin-HRP를 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS-T로 3회 세척한 후 기질인 3, 3’, 5, 5’-tetramethyl-benzidine (TMB) solution를 첨가하여 15분 동안 암실에서 반응시켰다. 이를 1 M phosphoric acid로 반응을 정지시킨 후, 450 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정된 결과값으로부터 calibration standard를 이용한 표준곡선으로 각 cytokine의 양을 계산하였다.

α-Glucosidase inhibition assay

기질인 2.5 mM pNPG (para-nitrophenyl α-D-glucopyr-anoside) (Sigma-Aldrich) 60 μl, 0.25 unit α-glucosidase (Sigma-Aldrich) 30 μl에 시료 6 μl를 넣고 37℃에서 30분간 반응한 후, 이를 405 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Positive control로는 acarbose (Sigma-Aldrich) 62.5, 250, 500 μg/ml을 이용하였으며, 이 때 억제능은 시료를 녹인 DW, MeOH을 기준으로 100% 환산하여 이를 100에서의 차를 계산하였다.

\(\text { 억제능 }(\%)=100-\left(\frac{\text { 시료처리군 } O D_{504 \mathrm{~nm}}-\text { 시료처리군 } \operatorname{Blank} O D_{504 \mathrm{~nm}}}{\text { 대조군 } 0 D_{504 \mathrm{~mm}}} \times 100\right)\)

Protein tyrosine phosphatase (PTP1B) inhibition assay

기질인 100 mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich) 40 μl에 PTP1B 50μl와 시료 10 μl를 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 이를 405 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Positive control로는 ursolic acid 0.1, 0.8, 1.6 mM을 이용하였으며, 이때 억제능은 시료를 녹인 DW, MeOH을 기준으로 100% 환산하여 이를 100에서의 차를 계산하였다.

\(\text { 억제능 }(\%)=100-\left(\frac{\text { 시료처리군 } O D_{504 \mathrm{~mm}}-\text { 시료처리군 } \operatorname{Blank} O D_{504 \mathrm{~mm}}}{\text { 대조군 } 0 D_{504 \mathrm{~mm}}} \times 100\right)\)

Tyrosinase inhibition assay

기질인 100 mM L-tyrosine (Sigma-Aldrich) 160 μl에 시료 10 μl와 200 unit tyrosinase (Sigma-Aldrich) 30 μl를 넣고 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후 이를 475 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Positive control로는 kojic acid 6.25, 12.5, 25 μg/ml을 이용하였으며, 이 때 억제능은 시료를 녹인 DW, MeOH을 기준으로 100% 환산하여 이를 100에서 뺀 차를 계산하였다.

\(\text { 억제능 }(\%)=100-\left(\frac{\text { 시료처리군 } O D_{475 \mathrm{~nm}}-\text { 시료처리군 } \operatorname{Blank} O D_{475 \mathrm{~nm}}}{\text { 대조군 } 0 D_{475 \mathrm{~nm}}} \times 100\right)\)

Xanthine oxidase (XO) inhibition assay

Black 96-well plate (SPL, Pocheon, Korea)에 기질인 0.4 M pterin 20 μl에 시료 10μl와 xanthine oxidase 10 μl를 넣고 실온에서 30분간 반응시킨 후, 1 N HCl 100 μl로 반응을 정지시키고 excitation 340 nm, emission 410 nm에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 형광값을 측정하였다. Positive control로는 allopurinol 0.25, 1, 4 μg/ml을 사용하였으며, 이때 억제능은 시료는 녹인 DW, MeOH을 기준으로 100% 환산하여 이를 100에서의 차를 계산하였다.

\(\text { 억제능 } (\%)=100-\left(\frac{\text { 시료처리군 Fluorescence }_{(340-410 \mathrm{~m})} \text { - 시료처리군 Blank Fluorescence }_{(340-410 \mathrm{~mm})}}{\text { 대조군 Fluorescence }(340-410 \mathrm{~nm})} \times 100\right)\)

Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibition assay

기질인 5 mg/ml의 hippuryl-his-leu-acetate salt 20 μl, 시료 10 μl와 ACE enzyme 20 μl를 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이때 ACE enzyme은 400 mM의 boric acid (pH 8.5) 20 ml에 2 g의 rabbit lung acetone powder (Sigma-Aldrich)를 넣고 균질화 한 뒤 4℃에서 24시간 교반시키고 상등액만 -20℃에 보관하며 사용하였다. 반응 후 1 N HCl을 50 μl 넣어 반응을 정지시키고, ethylacetate 300 μl를 첨가하여 용매 추출하였다. 추출 상 등액을 새로운 tube에 옮겨 speed vacuum (Hanil Science Industrial Co.)을 이용하여 건조시키고 pellet을 동량의 DW에 용해하고 이를 96-well plate에 옮긴 후, OD 280 nm 에서 SpectrMax M2e (Molecular Device)를 이용하여 측정하였다. Positive control로는 captopril 1, 2, 20 µM을 사용하였으며, 이때 억제능은 시료는 녹인 DW, MeOH을 기준으로 100% 환산하여 이를 100에서의 차를 계산하였다.

\(\text { 억제능 }(\%)=100-\left(\frac{\text { 시료처리군 } \mathrm{OD}_{228 \mathrm{~nm}}-\text { 시료처리군 } \operatorname{Blank} \mathrm{OD}_{228 \mathrm{~nm}}}{\text { 대조군 } \mathrm{OD}_{228 \mathrm{~mm}}} \times 100\right)\)

통계처리

모든 실험의 결과는 3번 반복 수행하여 얻어진 것으로, 통계분석은 one-way ANOVA (analysis of variation)에 의해 분석하여 mean±S.D로 표시하였고, 통계적 유의성은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 판정하였다.

결과 및 고찰

Euglena gracilis 균체 추출물의 nitric oxide (NO) 생성 및 억제능

E. gracilis 균체 열수 추출물(HWE)의 면역활성을 측정하기 위하여 murine macrophase RAW 264.7 cell에 24시간 동안 처리한 결과, positive control인 lipopolysaccharide (LPS)를 1 μg/ml 처리한 군에 비하여 NO의 생산능이 없는 것으로 나타났다(Fig. 1A). Euglena 균체 열수 추출 후 메탄올 추출물 (HWME)을 처리한 경우에는 300 μg/ml에서 5 mM 정도의 낮은 NO 생성능을 나타냈다. 그러나, 이는 세포생존율(Fig. 1B)의 결과와 비교할 때 고농도(300 μg/ml)의 시료처리로 인하여 발생한 세포독성(toxicity)의 결과로 보여진다. 따라서 E. gracilis 균체의 열수 추출물과 메탄올 추출물은 RAW 264.7 cell에서 NO의 유의적인 생성능을 나타내지 않았다.

Fig. 1. Effects of the HWE and HWME from Euglena gracilis on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells. (A) Production of NO treated with extracts for 24 hr. (B) Cell viability treated with extracts for 24 hr. LPS (1 μg/ml) was used as a positive control. All data are presented as means±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 compared with control. Control, non-stimulated cells; HWE, how water extract; HWME, methanol extract after hot water extraction; LPS, lipopolysaccharide.

E. gracilis 균체 추출물의 면역억제 기능을 측정하기 위해 LPS와 함께 두 종류의 추출물을 24시간 동안 murine macro- phage RAW 264.7 cell에 각각 처리한 결과, 고농도의 HWME (300 μg/ml)에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성이 42.08% 억제되는 것을 확인하였고 이때 세포 생존율도 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 2B). 이는 고농도의 HWME 처리로 세포 생존율에 영향을 주어 NO 생성에 대한 억제능이 나타난 것으로 사료되었으나 NO 저해능이 농도 의존적으로 현저히 높게 나타나므로 유의한 결과로 확인되었다. 그러나 HWE 처리군에서는 NO 저해 활성이 뚜렷하게 나타나지는 않았으며(Fig. 2A) 세포 생존율 또한 동일 농도의 HWME에서보다 감소되는 것이 확인되었다 (Fig. 2B).

Fig. 2. Inhibition effects of the HWE and HWME from Euglena gracilis on nitric oxide (NO) in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) Inhibition effects of NO treated with extracts for 24 hr. (B) Cell viability treated with extracts for 24 hr. All data are presented as means±SD of three independent experiments. *p<0.05 and ***p<0.001 compared with control. Control, LPS-stimulated cells; HWE, how water extract; HWME, methanol extract after hot water extraction; LPS, lipopolysaccharide.

Euglena gracilis 균체추출물의 cytokine 생성 및 억제능

IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 염증성 cytokine은 세포 내 신호전달에 관여하여 염증반응을 조절한다[8,26]. IL-6는 선천면역과 적응면역에서 모두 작용 가능한 cytokine으로서 세포 매개 면역반응을 촉진하는 기능이 있다. TNF-α는 LPS 반응의 주요 매개체로 선천면역반응에서 중요한 역할을 하며, 만성 염증과 관련되어 있다. 선천면역을 매개하고 조절하는 cyto- kine인 IL-1β는 TNF-α와 유사한 작용을 수행하며, 감염 및 기타 자극에 대해 염증반응 매개물질로 작용한다[13].

E. gracilis 균체 추출물의 murine macrophage RAW 264.7 cell에서의 cytokine 생성능을 측정하기 위하여 HWE와 HWME 를 처리한 결과, IL-1β와 TNF-α의 생성이 농도의존적으로 증가하였고(Fig. 3), HWME를 처리한 군보다 HWE를 처리한 군에서 생성량이 더 높은 것을 확인하였다. IL-1β의 경우, LPS를 처리한 군에서 151.57 pg/ml의 생성량을 나타냈으며, HWE와 HWME 처리한 군 모두 농도의존적으로 증가하였으며 300 μ g/ml에서 각각 77.92 pg/ml와 74.28 pg/ml의 생성량을 나타냈다. TNF-α는 HWME를 처리한 군(122.88 pg/ml)에 비교하여 HWE를 처리한 군(326.5 pg/ml)에서 현저하게 높은 생성량을 보였으며, 이는 LPS를 처리한 군(856.5 pg/ml)의 38.12% 에 해당한다. 반면 IL-6는 LPS를 처리한 실험군에서 2319.75 pg/ml의 생성량을 나타났으나, 2종류의 E. gracilis 추출물 처리군은 대조군에 비해 유의한 생성량의 증가를 보이지 않았다.

Fig. 3. Effects of the HWE and HWME from Euglena gracilis on the production of pro-inflammatory cytokine (IL-1β, IL-6 and TNF-α) in RAW 264.7 cells. Cells were treated with various concentration of HWE and HWME from Euglena gracilis (A) Production of IL-1β treated with extracts for 24 hr. (B) Production of IL-6 treated with extracts for 24hr. (C) Production of TNF-α treated with extracts for 24hr. LPS (1 μg/ml) was used as a positive control. All data are presented as means±SD of three independent experiments. **p<0.01 and ***p<0.001 compared with control. Control, non-stimulated cells; HWE, how water extract; HWME, methanol extract after hot water extraction; LPS, lipopolysaccharide; TNF-α, tumor necrosis factor α; IL-6, interleukin 6; IL-1β, interleukin 1β.

LPS에 의해 유도되는 cytokine 생성에 대한 E. gracilis 균체 추출물의 억제능을 측정하기 위해 murine macrophage RAW 264.7 cell에 LPS와 E. gracilis 균체 추출물을 동시에 처리한 후, 상등액을 이용하여 IL-1β, IL-6와 TNF-α를 측정하였다 (Fig. 4). LPS 처리군에서는 2319.75와 856.5 pg/ml의 IL-6와 TNF-α 생성능을 나타내었다. LPS에 의해 유도되는 IL-6에 대한 E. gracilis HWME의 억제능을 측정한 결과, 30, 100, 300 μg/ml을 처리하였을 때, 각각 34(1.47%), 168.13(7.25%), 423.75(18.27%) pg/ml의 생성 억제능을 나타냈으며 TNF-α의 경우, 각각 98.88(11.54%), 135(15.76%), 243.5(28.43%) pg/ml 의 생성 억제능을 나타냈다. 그러나 HWE를 처리한 군에서는 IL-6와 TNF-α의 생성 억제능을 나타내지 않았다. 또한, LPS에 의해 유도된 IL-1β의 생성에 대한 E. gracilis 추출물의 억제능을 확인할 수 없었다.

Fig. 4. Inhibition effects of the HWE and HWME from Euglena gracilis of pro-inflammatory cytokine (IL-1β, IL-6 and TNF-α) in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated with various concentration of HWE and HWME from Euglena gracilis (A) Inhibition effects of IL-1β treat edwith extracts for 24 hr. (B) Inhibition effects of IL-6 treated with extracts for 24 hr. (C) Inhibition effects of TNF-α treated with extracts for 24 hr. All data are presented as means±SD of three independent experiments. **p<0.01 and ***p<0.001 compared with control. Control, LPS-stimulated cells; HWE, how water extract; HWME, methanol extract after hot water extraction; LPS, lipopolysaccharide.

결론적으로 E. gracilis 균체 추출물은 열수 추출 시 cytokine 생성 유도를 통한 면역강화 기능을 나타내었으며, 열수 추출 후 메탄올 추출 시 약한 면역억제 기능을 나타내었다. 이들 결과로부터 E. gracilis 추출물은 murine macrophage RAW 264.7 cell에서 면역반응에 작용하는 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β)을 조절하는 면역활성인자로 작용하며 E. gracilis의 추출법에 따라 면역 증진과 면역조절 소재로 활용할 수 있을 것으로 사료된다

Euglena gracilis 균체 추출물의 일반 생리활성

E. gracilis 균체 추출물의 다양한 생리활성을 확인하기 위하여 α-glucosidase, protein tyrosine phosphatase (PTP1B), ty- rosinase, xanthine oxidase (XO), angiotensin converting en- zyme (ACE)에 대한 저해 활성을 측정하였다.

α-Glucosidase 효소의 활성 억제는 당질 가수분해 및 흡수를 지연시켜 식후 혈당 농도 상승을 억제하는 것으로 알려져 있으며[33], 이 효소의 비정상적인 활성은 당뇨병 등의 질병을 야기할 수 있다. α-Glucosidase저해활성을 측정한 결과, HWE 에서 11.74% (50 μg/ml), 8.92% (150 μg/ml), 11.98% (500 μg/ ml)로 낮은 저해능을 보였으며, 농도의존적인 변화는 나타나지 않았다 (Fig. 5A). 이러한 결과는 E. gracilis와 같은 미세조류인 chlorella에서 α-glucosidase저해활성이 보고된 결과와는 대조적이었다[14].

Fig. 5. Various biological activities of HWE and HWME from Euglena gracilis. (A) Inhibitory activity of the HWE and HWME on α-glucosidase assay. Acarbose (62.5, 250 and 500 μg/ml) was used as a positive control. (B) Inhibitory activity of the HWE and HWME on PTP1B assay. Ursolic acid (0.1, 0.8 and 1.6 mM) was used as a positive control. (C) Inhibitory activity of the HWE and HWME on tyrosinase assay. Kojic acid (6.25, 12.5 and 25 μg/ml) was used as a positive control. (D) Inhibitory activity of the HWE and HWME on XO assay. Allopurinol (0.25, 1 and 4 μg/ml) was used as a positive control. (E) Inhibitory activity of the HWE and HWME on ACE assay. Captopril (1, 2 and 20 μM) was used as a positive control. All data are presented as means±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 compared with control. Control, DW or methanol; HWE, how water extract; HWME, methanol extract after hot water extraction; PTP1B, protein tyrosine phosphatase; XO, xanthine oxidase; ACE, angiotensin converting enzyme.

PTP1B는 비만과 당뇨 환자를 포함하여 인슐린 저항성이 높은 경우에 과발현이 관찰된 바 있으며, 억제 시 인슐린 저항성을 낮추고 비만과 제2형 당뇨가 개선되는 결과가 보고되었다 [16]. Insulin receptor signaling을 조절하는 효소로 알려진 PTP1B의 활성 억제능을 확인한 결과, HWME의 100, 300, 1, 000 μg/ml 농도에서 각각 43.21, 64.91, 92.33%로 뛰어난 저해능을 보였으며, 이는 기존 PTP1B의 저해제로 알려진 ursolic acid (positive control) 보다 유의적인 저해활성을 나타냈다 (Fig. 5B). 결과적으로, E. gracilis 추출물은 제2형 당뇨를 예방하기 위한 기능성 식품 소재로의 가능성이 있고, 특히 열수 추출 후메탄올 추출물에서 현저하게 높았다.

Melain 합성의 주요 기질로 사용하는 L-tyrosine과 melanin 생성조절 효소인 tyrosinase 를 이용하여 미백능을 확인하였다 (Fig. 5C) [31].그 결과, HWE를 50, 150, 500 μg/ml 처리했을 때 각각 8.11, 11.82, 13.72%의 낮은 저해능을 보였으나, HWME에서는 저해능이 나타나지 않았다.

XO는 체내 hypoxanthine을 uric acid로 만드는 효소이며, uric acid의 혈액 내 축적으로 관절의 윤활막 및 연골에 침착하여 염증과 통증을 유발하게 되므로 최근 XO를 억제하는 천연물의 탐색연구가 활발하다 [6]. Euglena 추출물로 XO 억제 활성을 확인한 결과, HWME에서 유의적인 저해능을 나타냈다 (Fig. 5D). 100, 300, 1000 μg/ml에서 각각 40.06, 70.94, 86.56% 의 저해능을 보였으며, 이는 positive control로 사용한 allo-purinol 보다 높은 저해능을 나타냈다.

ACE는 세포의 oxidative stress와 관련이 있어 reactive oxygen species와 4-peroxynitrite의 생성을 증가시키고 혈관 내에 혈소판의 응집과 흡착으로 인해 혈전증 발생을 높인다. 따라서 ACE의 대사를 조절할 수 있는 저해제는 고혈압과 다른 심혈관, 신장질환 등을 예방할 수 있을 것으로 보여진다[20]. HWE를 100, 300, 1, 000 μg/ml으로 처리했을 때 각각 0.03, 10.78, 14.43%의 낮은 저해능을 보였으며, HWME에서는 저해능이 나타나지 않았다 (Fig. 5E).

이러한 결과를 종합해보면, E. gracilis 균체 추출물이 추출 방법에 따라 열수 추출물(HWE)에서는 α-glucosidase, tyrosinase, ACE에 대한 낮은 억제 활성을 확인하였고, 열수 추출 후 메탄올 추출물(HWME)에서는 PTP1B, XO에 대해 농도 의존적으로 우수한 억제 활성을 나타내었다. 따라서, E. gracilis 균체 추출물의 다양한 생리활성연구를 통해 건강기능성 식품 및 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

감사의 글

이 논문은 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연구되었음.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.