Undaria pinnatifida Extracts and Alginic Acid Attenuated Muscle Atrophy in TNF-α Induced Myoblast Cells through MAFbx Signaling Cascade

미역 추출물과 알긴산의 근육손실 억제 효능

Abstract

Muscle atrophy refers to a decrease in muscle cells due to damage to muscle fibers. It is reported that muscle atrophy is caused by heart disease, diabetes, and other chronic diseases related to aging. The purpose of this study is to reveal the inhibitory effects of seaweed extracts, which are widely consumed in Korea, and alginic acid on muscle cell damage in muscle atrophy and regeneration models. We found that seaweed extracts (U) and alginic acid (A) attenuated TNF-α-induced muscle atrophy in differentiated C2C12 myoblast cells and inhibited muscle atrophy markers such as MuRF1 and MAFbx. In addition, U and A also regulated ubiquitination marker FoxO1 protein. To confirm the muscle regeneration effect in animal tissue, cardiotoxin (CTX) was used for the regeneration model. Six hours after CTX injection, gastrocnemius muscle volume was increased compared to control. Otherwise, the muscle volume of the U and A treatment groups was not changed. U and A also upregulated regeneration markers MyHC and PGC-1α in a CTX mouse model. These results indicate that seaweed extracts and alginic acid, a seaweed component, are applicable to senile sarcopenia by inhibiting muscle loss and promoting muscle regeneration.

근육 위축증은 근섬유의 손상으로 인한 근육세포의 감소에 의해 일어나며 심장질환, 당뇨, 각종 노인성 만성질환을 일으킨다고 알려져 있다. 본 연구는 미역 추출물 및 이의 성분인 알긴산의 근육세포보호, 근육감소억제 및 근육재생효과를 확인하고자 하였다. 미역 추출물 및 알긴산을 분화된 C2C12 myoblast 세포에 처리한 결과 TNF-α에 의한 근육섬유의 감소가 억제하였고murf1과 MaFbx의 발현량도 감소하였다. 또한, 마우스에 미역 추출물 및 알긴산을 10주간 급여한 결과 cardiotoxin에 의한 다리부종이 감소하였으며 근육단백질인 MyHC와 PGC-1α의 발현량이 증가 하였다. 따라서 미역 추출물 및 알긴산은 근감소 억제 및 근육재생 효과를 나타내어 기능성소재의 활용 가능성을 확인하였다.

서론

근감소증의 정의는 1989년 Irwin Rosenberg가 ‘sarcopenia’라는 말을 도입하면서 시작되었으며[1, 19, 20] 나이가 증가함에 따라 동반되는 근육의 양과 근력의 감소를 의미한다. 근감소증의 병인적 요인으로는 단백질 섭취, 호르몬의 영향, 염증 유발 사이토카인으로 인한 근세포의 감소 및 근육단백질의 분해라고 알려져 있다[5, 13, 23]. 다양한 원인이 있지만 특히 노화가 진행될수록 산화적 스트레스 및 그에 따른 염증 유발사이토카인은 근세포의 사멸을 일으켜 근육세포의 손상을 일으킨다. 이러한 근위축증(muslce atrophy)은 근감소의 하나의 기전으로 노화, 영양상태, 만성질환 등 여러 가지 원인에 의해 유발되며 단백질 합성조절, protease 활성화, 단백질 분해 (ubiquitination), 세포노화에 따른 산화적 스트레스 등과 같이 많은 세포내 변화로 일어난다고 알려져 있다[2, 10, 21]. 근육의 손실은 심각한 활동 장애 및 체내 혈당을 낮추는 가장 큰 기관으로서 문제가 되며, 특히 노화성 근감소는 당뇨, 비만, 심혈관질환 골다공증 및 우울증을 유발한다고 알려져 있어 최근 이러한 근감소를 제어 할 수 있는 여러 가지 연구가 활발하다. 다양한 원인에 의해 감소되는 근육의 감소를 제어할 수 있는 방법으로는 근육의 증가(근비대, muscle hypertrophy), 근육감소의 저해, 근육재생(muscle regenration)이 있다. 근육의 재상 과정은 계속해서 일어나고 있으며, 그 기작을 살펴보면 휴지 상태를 벗어난 위성세포가 세포분열을 통해 myoblast를 만들고 이러한 세포들이 손상된 근섬유나 다른 myoblast와 융합함으로서 이루어지게 된다[24]. 근육분화는 MyoD, MyoG와 같은 단백질에 의해서 조절되며 분화 후기에는 MHC의 발현량이 증가한다. 따라서 MHC는 근육분화의 marker로 사용되며 이의 발현량을 측정해서 근육 분화를 확인한다[14,16].

근육 분화가 완료되면 단백질 합성 메카니즘에 의해 근육 비대 과정을 통하여 근육의 크기가 증가되게 된다. 이와 관련된 기전으로 adenosine monophophate activated protein kianse, Akt, PGC₁가 활성화되면 근비대가 나타난다[7]. 이러한 근비대는 노화성 근육 감소를 예방하고 치료하는데 근육 위축 감소 제어와 같이 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 노화나 염증 작용에 의해 일어나는 근위축을 제어하고, 근육 재생을 촉진 시키는 천연물 소재를 확보하고 그 기전을 연구하였다.

미역은 미네랄이 풍부한 식품자원으로 알려져 있으며 우리나라에서는 출산 후 산후조리에 널리 쓰인다. 이외에도 미역에는 폴리페놀, 카로티노이드와 같은 생리활성 성분도 포함되어 있어 항산화, 항염, 항암에 효능이 있다고 알려져 있다[11, 22, 24]. 또한 미역의 성분중 하나인 알긴산은 미역에 건조중량 기준 약 15~32% 함유되어 있는[4] 주요 polysaccharide 중 하나이며 갈색 해조류의 세포벽이나 내벽기의 구성성분으로 음식, 제약, 생명공학 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. Fucoi- dan과 같은 다른 polysaccharide는 마우스에서 운동능력을 향상시킴으로 항피로 효능이 있다고 알려져 있지만 알긴산의 생리활성에 대한 연구보고는 미비하다[3, 15, 17].

본 연구에서는 미역과 미역의 주요성분중 하나인 알긴산의 TNF-α유도 근감소 모델에서 근육감소 저해 효능을 확인하였으며, cardiotoxin 동물 모델[6, 8, 9]을 이용하여 근육재생 효능을 규명하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 연구에서 사용한 미역(Undaria pinnatifida)은 전남 완도지역에서 채취된 것을 구입하여 사용하였다. 건조된 미역을 분쇄하고 70% 에탄올을 사용하여 초음파 추출기(Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA)로 2시간씩 3번 반복하여 추출 하였다. 얻어진 추출액은 여과 후 감압 농축하고 동결건조하여 건조 분말화시켜 사용하였다. 알긴산은 Sigma aldrich 사 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 이 실험에서 사용한 1차 항체 MyHC , MAFbx, Murf1 FoxO₁, p-FoxO₁, Smad3, p-Samd3, PAX7, MyoD, MyoG 그리고 MyHC는 모두 Abcam사 (Cambridge, MA, USA) 제품을 사용하였으며, 2차 항체는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였다.

세포배양 및 myotube 분화와 atrophy 유도

C2C12 mouse myoblast 세포는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 5% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% antibiotic-antimycotic (Gibco, Grand Island, NY, USA)이 첨가된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. Myoblast로의 분화를 위해서 2% horse serum (Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 2일마다 교체하였다. 6일 후 myotube가 형성된 것을 현미경으로 확인한 후, 염증 반응으로 atrophy를 유도하기 위한 25 μg/ml의 TNF-α (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 배지와 함께 처리하였다. Myotube diameter 측정은 200배의 현미경(Olympus CKX41, Tokyo, Japan)으로 관찰하고 각 그룹당 최소 10개의 세포를 무작위로 정한 후 diameter를 측정하여 ratio로 표시하였다.

분화 마커 및 atrophy 관련 단백질 발현량 측정

C2C12 myoblast를 60 mm dish에 접종한 후, 각 샘플을 함께 처리하고 1, 2, 3, 6일째 되는 날 cell을 회수하였다. Atrophy 마커인 MyHC , MAFbx, Murf1의 발현량을 측정하고자 C2C12 cell을 myotube로 6일 동안 분화시킨 다음 TNF-α (25 μg/ml)를 24시간 처리하여 atrophy를 유도한 후 cell을 회수하여 각 조절 단백질의 발현량을 확인하였다. 또한, 이와 관련된 단백질 분해 관련 인자인 FoxO₁과 Smad3의 발현량을 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다. 근육 atrophy외에 초기 근육 분화에도 미역 추출물(U)과 알긴산(A)이 관여 하는지 확인하고자 관련마커인 PAX7, MyoD, MyoG, MyHC의 발현량을 측정하여 미역 추출물과 알긴산이 근육 분화에도 영향을 미치는지 검정 하였다.

근육 재생 관련 cardiotoxin (CTX) injected regeneration model 구축

생후 6주령 된 C₅₇BL6/J 수컷을 정상식이군 및 U (미역추출물 군), B (알긴산 군)으로 나누어 각각의 실험 식이를 10주 간 급여하였다. 식이 조성은 AIN 93M 과 93G diet 조성에 의하여 주령에 맞게 제조하였으며, 미역 추출물(U)은 0.5% 를, 알긴산(A)은 0.05%을 첨가하여 10주간 급여하였다. Cardio- toxin (Latoxan natural active ingredients, PB, France)를 위한 예비실험으로 0.1%의 methylen blue solution을 사용하여 in-jection 하는 조직의 위치와 깊이를 미리 파악하였다. CTX는 PBS로 녹여 -20℃에 보관한 후, 투여 당일 식염수로 15배 희석하여 10 μM의 농도로 만들어 100 μl 씩 injection 하였다. 모든 쥐의 왼쪽다리에는 대조군으로 식염수를, 오른쪽 다리에는 CTX를 injection하였다. 시간대별로 근육 재생을 확인하기 위하여 CTX 투여 후 6시간, 1일, 3일 및 8일 후에 8마리씩 부검하여 조직을 채취하여 분석에 사용하였다. 모든 동물 실험은 한국식품연구원 동물실험윤리위원회의 윤리 규정에 의거하여 실시하였다(KFRI-M-17030).

Muscle regeneration model의 분화마커 측정

6시간 후 채취된 gastrocnemius 조직을 lysis buffer (pro prep-iNtRON, protease와 phosphatase inhibitor cocktail)에 넣고 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 각 그룹의 모든 샘플들의 동량을 채취하여 pooling을 한 후 단백질을 정량하고 atrophy 마커인 Murf1 과 분화 마커인 MHC, PGC-1α 항체를 이용하여 분화 마커의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다.

통계방법

각 실험의 결과는 3번 이상 반복 실험을 하였으며 평균 ± 평균오차(mean ± S.E.M)로 표시하였으며, GraphPad prism 7.0 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, USA) 프로그램을 사용하여 two-way Anova, Tukey Multiple comparison으로 유의성을 분석하였다.

결과 및 고찰

미역 추출물과 알긴산의 근육 atrophy 억제 효능

노화와 대사증후군과 같은 질환이 진행될수록 인체에 염증반응이 일어나게 되고 그 결과 염증을 일으키는 사이트카인들이 증가하게 된다[12]. 본 연구에서는 이러한 염증 반응에 의한 근육감소에 대한 미역 추출물과 알긴산의 억제효능을 확인하였다. C2C12 세포를 6일 동안 분화배지에서 배양하면 my- otube가 형성 되고, TNF-α를 25 μg/ml 처리에 의해 myotube가 분해된다. 이러한 근육 atrophy 모델을 이용하여 미역추출물 50 μg/ml과 알긴산 10 μM을 각각 TNF-α와 동시에 처리하여 확인한 결과, 평균적으로 17 μm의 myotube의 직경이 TNF-α에 의해 근섬유의 직경이 8 μm로 절반가량 감소하였고. 미역추출물과 알긴산을 처리한 그룹에서 모두 유의적으로 증가하여 TNF-α에 의해 손상되었던 근섬유가 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Effects of Undaria pinnatifida extracts (U) and alginate (A) on myotube differentiation in TNF-α-stimulated C2C12 cells. Cells were induced to differentiate in DM for 5 days. U (50 μg/ml) or A (10 μM) as administered alone for 24 hr and was then replaced with TNF-α (25 μg/ml) in DM. After incubation for 1 hr, myotube formation was quantified. Data are presented as the means ± SEMs of three independent experiments. ^#p<0.05 versus the con-trol; ^*p<0.05 versus TNF-α alone; ^**p<0.01 versus TNF-α alone. Scale bar: 100 μm.

미역 추출물과 알긴산의 근육 atrophy 관련 단백질 발현억제

Myotube 생성 시 유도되는 중요한 marker인 MyHC의 단백질 발현량을 확인한 결과, TNF-α에 의해서 0.5배 정도 유의적으로 감소하였다가 미역 추출물과 알긴산에 의해 1.3배 이상 유의적으로 증가하였다. 이는 대조군보다 높게 나타나는 경향을 보여서 손상된 근섬유의 회복 외에 myoblast의 분화에도 영향을 미칠 것으로 판단하였다. MAFbx (atrogin), Murf1은 muscle atrophy시 활성화되는 대표적인 마커로서 이의 단백질 발현량을 측정해본 결과, TNF-α에 의해 1.2 배 정도 증가되었던 MaFbx1의 단백질 발현량이 미역 추출물 처리군에서는 0.8 배, 알긴산 처리군 에서는 0.7 배 정도 TNF-α 처리 군에 비해 감소함을 확인하여 미역 추출물과 알긴산이 atrogin의 발현을 조절하여 근감소를 억제 한 것으로 판단하였다(Fig. 2A). 하지만, Murf1에서는 TNF-α에 의해 증가되었던 단백질 발현량이 미역추출물과 알긴산에 의해 감소되지 않아 근육 atrophy관련 기전에 대해 단백질 분해 합성에 영향을 줄 것으로 생각되어 추후 동물실험에서 이러한 단백질에 대해 확인하였다. 또한 대조군보다 높게 나타난 MyHC의 발현량을 미루어 보아 근육재생이나 분화에 영향을 줄 것으로 추측되어 C2C12의 초기 분화에서부터의 미역 추출물과 알긴산의 효능을 측정하였다. FoxO₁은 근육세포에서는 starvation이나, disuse 모델에서 up regulation 되어 atrogin을 transcription 시키는 transcription factor이다. 본 연구의 결과에서는 미역 추출물과 알긴산이 염증 반응에 의해 증가하였던 FoxO₁의 발현을 감소시켰으나, smad3의 발현에는 영향이 없었다(Fig. 2B).

Fig. 2. Effects of Undaria pinnatifida extracts (U) and Alginate (A) on muscle atrophy biomarker (A) and ubiquitination marker (B) expression. Differentiated C2C12 were treated by U or A with TNF-α (25 μg/ml) for 1 hr and then were analysed by Western blot. The muscle atrophy marker in this study were MyHC, Murf and MaFbx. The expression were normalized to β-actin (A). The ubiquitination markers p-FoxO₁ and p-smad3 were normalized by total FoxO₁ and total smad3 (B). Data are presented as the means±SEMs of three independent experiments. ^#p<0.05, ^##p<0.01 and ^###p<0.001 versus the control; ^*p<0.05, ^***p<0.001 versus TNF-α alone.

미역추출물과 알긴산의 day별 분화 마커 증가 효능

미역 추출물과 알긴산에 의해 MyHC의 발현이 증가됨이 확인되어 근육분화 및 재생 효능이 있을 것으로 추측됨에 따라 분화 마커의 발현량을 조절하는지 확인하였다. Fig. 3을 보면 satellite cell이 myoblast가 되는 초기분화 마커인 PAX7과 MyoD의 단백질 발현량이 미역 추출물을 투여한 군에서 증가하였다. 또한 myoblast가 myofiber가 되는 중후기 분화마커인 myogenin과 MyHC의 단백질 발현량이 미역 추출물 투여군에서 대조군보다 증가함을 확인하여 미역 추출물이 근육 분화 초기와 중후기 분화에 관련하여 myotube 분화를 더욱 촉진시켰다.

Fig. 3. Undaria pinnatifida extracts (U) and Alginate (A) regu-lated differentiation of C2C12 cells. C2C12 cells were treated with U (50 μg/ml) or A (10 μM) in the presence DM and cell lysates were prepared for western blot analysis. Levels Pax7, MyoD, MyoG MyHC were nor-malized to β-actin respectively. Representative band im- ages from individual experiments are shown in U (A) and A (B). Data are presented as the means±SEMs of three independent experiments.

CTX 모델에서의 근육 재생 효능

미역 추출물과 알긴산의 근육세포에서 근육 분화마커 증가 효능을 확인 한 후, 근육 조직에서는 어떠한 변화를 나타내는지 확인하고자 cardiotoxin 모델을 이용하여 근육 재생 실험을 실시하였다. C₅₇/BL6 mice에게 10주간 미역 추출물, 알긴산을 함유한 식이를 급여 시 초반에는 미역 추출물과 알긴산의 식이를 먹은 쥐들의 체중이 증가하는 듯이 보였으나 점차 식이 후반기로 갈수록 모든 그룹의 체중이 비슷해져서 미역 추출물과 알긴산은 생쥐의 체중 변화에는 영향이 없었다(Data not shown).

Gastrocnemius 조직의 왼쪽과 오른쪽의 무게를 각각 측정한 후 부검하기 직전에 측정한 쥐들의 체중 값으로 나눠 비교를 한 결과, 오른쪽 다리에 CTX 투여 후 6시간이 지난 초기에서 미역 추출물과 알긴산의 식이를 먹은 그룹이 정상군보다 낮았다. 1일이 지났을 때에는 normal 군이 다른 그룹에 비해 값이 크게 낮아졌으며, 3일과 8일이 지났을 때에는 모든 그룹의 값이 비슷해지는 경향을 나타내었다. 식염수를 주입한 왼쪽 다리는 모든 그룹에서 Gastrocnemius 조직의 부피 차이가 없었으며, CTX를 투여한 오른쪽 다리에서는 6시간 후에 정상군보다 미역 추출물 군과 알긴산 군의 gastrocnemius 부피가 확연히 감소하였다(Fig. 4A). 또한 astrocnemius 부피를 비교하여 보면 미역 추출물과 알긴산 그룹이 CTX투여 후 6시간인 초기의 regeneration 효과가 있는 것으로 판단되었다(Fig. 4A). CTX에 의해 근육 atrophy 마커인 Murf가 증가 했을 것으로 예상되어 murf1의 발현을 측정한 결과, 6시간 후 CTX에 의해 감소하였지만 미역 추출물과 알긴산에 의해 회복하지 않아 미역 추출물과 알긴산은 CTX모델에서 근육재생에 관여하는 것으로 판단하였다. 또한 MyHC와 같은 myoblast가 myofiber가 되는 중후기 분화마커가 미역 추출물과 알긴산 투여 군에서 대조군보다 증가함을 확인하여 미역 추출물이 근육 분화 초기와 중후기 분화에 관련하여 myotube분화를 더욱 촉진하였다(Fig. 4B). PGC-1α는 미토콘드리아 에너지 대사에 영향을 미치는데 특히 PPARγ와의 상호작용을 통해서 골격근대사에 관여한다고 알려져 있으며 운동에 의해 단백질량이 증가함에 따라 발현량이 증가된다[18]. 본 연구에서는 미역추출물과 알긴산이 근육재생 외에 근육단백질의 증가에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 PGC-1α 발현량을 측정한 결과, CTX에 의해 감소하였던 PGC-1α의 발현령이 증가하였다. 이와 같은 결과로 미루어 보아 미역 추출물과 알긴산은 분화된 근육세포의 감소를 억제하며 근육세포 분화 초기 단계에서 분화를 촉진하고, 관련된 근육 단백질이 증가함을 확인하였다

Fig. 4. Undaria pinnatifida extracts (U) and Alginate (A) regulated CTX induced muscle regeneration in mouse gastrocnemius tissue. Rright gastrocnemius tissue were isolated after CTX injection (6 hr). Left gastrocnemius were injected saline for control. The muscle volume change were divided by weight and normalized to left gastrocnemius tissue (Fig. 4A). The atrophy marker and regeneration marker were measured by Westerb blot anlaysis. Each side of gastrocnemius protein lysates were blotted to Murf1, MyHC and PGC-1α. the each marker expression were normalized to GAPDH. Data are presented as the means ±SEMs of three independent experiments. ^###p<0.001 versus the control; ^***p<0.001 versus CTX alone.

감사의 글

본 연구결과는 한국식품연구원 주요 연구개발사업(과제번호: E0210300, E0160500)의 지원을 받아 연구되었으며 이에 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.

[script] var kistiSpellChecker_replaceCKEditorOptionId = setInterval(function() { if ( ! window.CKEDITOR ) return; clearInterval(kistiSpellChecker_replaceCKEditorOptionId); var isMarkTagAllowed = function(config) { if (config.allowedContent === true) return true; if (typeof(config.allowedContent) === 'string' && config.allowedContent.includes('mark') ) { return true; } if (typeof(config.allowedContent) === 'object' && config.allowedContent.keys().includes('mark') ) { return true; } if (typeof(config.extraAllowedContent) === 'string' && config.extraAllowedContent.includes('mark') ) { return true; } if (typeof(config.extraAllowedContent) === 'object' && config.extraAllowedContent.keys().includes('mark') ) { return true; } return false; }; for (var key in CKEDITOR.instances) { var editor = CKEDITOR.instances[key]; var element = editor.element; var config = editor.config; if ( isMarkTagAllowed(config) ) { continue; } config.extraAllowedContent = 'mark; ' + (config.extraAllowedContent || ''); var originEditorKey = null; for (var key in window) { if ( window[key] === editor ) { originEditorKey = key; break; } } var extraProperties = { listSeq: editor.listSeq // KISTI 기계학습데이터 구축 작업화면 대응 }; console.log('listSeq before destroy', editor.listSeq); editor.destroy(); window[originEditorKey] = editor = CKEDITOR.replace(element, config); for (var key in extraProperties) { editor[key] = extraProperties[key]; } console.log('extraProperties after recreate', extraProperties); } }, 100);[/script]