꽃송이버섯에서 추출한 β-glucan의 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성 억제 효능

Inhibitory Effect of β-Glucan Extracted from Cauliflower Mushroom Sparassis crispa on Tyrosinase Activity and Melanin Synthesis

Abstract

천연물에서 피부 미백 효능을 가진 화합물을 개발하기 위한 노력이 많이 이루어지고 있다. 꽃송이 버섯(Sparassis crispa)은 β-glucan의 함량이 건조중량의 40% 이상으로서 항암과 면역증강 효과가 있는 것으로 입증되어 약용으로도 인정받고 있다. 이 연구에서는 S. crispa β-glucan의 멜라닌 생합성 및 tyrosinase 활성억제 효능을 확인함으로써 피부 미백제로서의 활용 가능성을 평가하고자 하였다. 외부 자극제인 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)와 S. crispa β-glucan (10, 100, 1,000 ㎍/ml)을 B16F1 melanoma 세포에 투여하여 멜라닌 생성량과 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2, microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현정도에 대해서는 western blot으로 분석하였다. S. crispa β-glucan을 10, 100, 1,000 ㎍/ml의 농도로 투여하였을 때 α-MSH 만 투여군에 비하여 멜라닌 생성이 각각 13.9%, 18.7%, 39.5% 감소하였다. S. crispa β-glucan을 10, 100, 1,000 ㎍/ml의 농도로 투여하였을 때 β-glucan을 투여하지않은 α-MSH 유도군에 비하여 tyrosinase 활성도는 각각 15.6%, 26.9%, 43.2% 억제되었다. 또한 tyrosinase와 TRP-1, TRP-2, MITF 단백 발현도 효과적으로 감소시켰다. 본 연구 결과에 따르면 S. crispa β-glucan은 MITF 발현을 억제함으로써 tyrosinase 발현을 감소시켜 멜라닌 생성을 억제시킨 것으로 판단된다. 따라서 S. crispa β-glucan은 미백제로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 생각한다.

There are a lot of efforts to develop new compounds having skin whitening effect from natural products. Sparassis crispa is a medicinal mushroom containing more than 40% β-glucan, which exhibits anticancer and immunostimulating effects. The aim of this study was to assess the availability of β-glucan extracted from cauliflower mushroom S. crispa as a skin whitener through the evaluation of inhibitory effects of melanin synthesis and tyrosinase activity and their mechanisms. B16F1 cells were treated with S. crispa β-glucan (10, 100, and 1,000 ㎍/ml, respectively) and α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), simultaneously. Content of melanin synthesis and tyrosinase activity were determined. The expressions levels of tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2 and microphthalmia-associated transcription factor (MITF) were also measured by western blotting. Treatment with 10, 100 and 1,000 ㎍/ml S. crispa β-glucan and 200 nM α-MSH significantly decreased melanin synthesis by 13.9%, 18.7% and 39.5%, respectively, and tyrosinase activity by 15.6%, 26.9% and 43.2%, respectively, compared to the α-MSH alone group. In addition, S. crispa β-glucan inhibited expressions of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and MITF induced by α-MSH. These results indicated that S. crispa β-glucan inhibited MITF expression, thereby reducing tyrosinase expression and inhibiting melanin production in B16F1 melanoma cells. Therefore, S. crispa β-glucan might be available as a skin whitener.

서론

표피의 기저층에 존재하는 멜라닌은 인간의 피부색을 결정짓는데 가장 중요한 역할을 하며, 멜라닌 세포(melanocyte) 내의 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관인 멜라닌 소체(mela- nosome)에서 합성된다. 합성된 멜라닌은 수지상돌기(den- drite)를 통하여 각질형성세포(keratinocyte)로 이동하여 피부 각질층에 침착되어 흑화를 야기한다[28].

멜라닌 세포에는 멜라닌을 합성하는데 필요한 특이적 효소인 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1)과 TRP-2 등이 함유되어 있다[3]. 이 중에서 가장 핵심적인 효소는 속도결정단계를 조절하는 중합효소의 일종인 tyrosinase이다. 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase에 의해 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)과 DOPA quinone으로 산화되어 주로 적·노란색을 나타내는 pheomelanin을 합성하며[7], DOPA quinone이 DOPA chrome으로 자동산화 되어 TRP-2에 의해 5, 6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) 로 변환되고, TRP-1에 의해 DHICA가 indole-5, 6-quinone-2- carboxylic acid로 산화되어 흑·갈색을 띠는 eumelanin을 생성한다[34]. 따라서 pheomelanin과 eumelanin의 합성에 절대적으로 필요한 tyrosinase의 작용을 억제한다면 효과적으로 멜라닌 합성을 억제할 수 있다.

멜라닌 생성은 tyrosinase에 의한 산화반응 뿐만 아니라, 여러 종류의 사이토카인, 성장 인자와 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), 부신피질자극호르몬, β-endorphin 등의 호르몬과 여러 종류의 세포신호전달 경로가 관여하는 복잡한 연쇄반응을 거쳐서 생성된다고 알려져 있다[4]. 멜라닌 생성을 유도하는 물질 가운데 가장 강력한 것으로 알려진 α-MSH는피부가 자외선에 노출되었을 때 표피에서 생산이 증가되고, 각질형성세포와 멜라닌 세포에서는 멜라닌 자극 호르몬 수용체가 증가하게 된다. 증가된 α-MSH는 멜라닌 세포 특이 수용체인 melanocortin-1 (MC₁R)과 결합하여 하위 신호를 전달하는데, adenylate cyclase를 활성화시켜, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 수준이 증가하게 되면, cAMP-dependent protein kinase (PKA)가 cAMP response element binding protein (CREB)을 인산화시켜 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현을 증가시킨다. Tyrosinase 와 TRP의 강력한 전사 조절인자인 MITF는 핵으로 이동하여 DNA의 tyrosianse, TRP-1, TRP-2의 promoter에 결합하여 각각의 유전자 발현을 증가시켜 멜라닌 생성을 유발한다[1].

최근 천연물에서 tyrosinase 억제 활성을 가진 화합물을 개발하기 위한 노력이 많이 이루어지고 있다. 잘 알려진 tyrosinase 억제 물질인 누룩곰팡이로부터 분리된 kojic acid, hydro- quinone, oxyresveratrol, 그리고 p-hydroxybenzyl alcohol은 멜라닌 합성을 억제한다고 보고되고 있다[21, 22, 26, 30]. 그러나 이러한 물질들은 불안정하여 분해, 착색, 이취(異臭), 효과의 불분명, 안전성 등의 문제로 인하여 사용이 제한되고 있다. 따라서 세포에 영향을 미치지 않으면서 안정적이고도 효과적으로 멜라닌 합성을 감소시키기 위한 미백 소재를 천연물로부터 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 민주름버섯목(Aphyllophor- ales), 꽃송이버섯과(Sparassidaceae)에 속하는 버섯으로 한국, 일본, 중국, 유럽, 북아메리카, 호주 등에 분포되어 있으며, 8~9 월에 침엽수의 뿌리근처나 그루터기에서 자생한다[10]. 자실체는 높이 10~25 cm로 육질이고 밑 부분은 굵은 줄기로 공통의 자루가 있고 윗부분은 편평하며 가장자리는 물결 모양으로 흰색의 꽃양배추 모양으로 형성하며, 은은한 향과 씹는 질감이 좋아 식용으로서 가치가 있다[24]. 또한, β-1, 3-D-glucan의함량이 다른 버섯에 비해 월등히 높아 다양한 생리 활성 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다[20]. β-glucan이란 면역력을 높여주는 핵심 성분으로써 신체의 면역체계를 바로잡아암 및 고혈압, 당뇨병 등을 다스리는 것으로 높이 평가받아 관심이 집중되고 있다. 즉, 항암과 항혈관 신생효과, 항종양효과, 항균과 항진균 효과, 그리고 항알러지 효과와 당뇨에 대해서도 효과가 있는 것으로 알려져 있다[5, 11, 13, 14, 25, 31]. 또한 마우스의 사이토카인 생성에도 관여하며, 급성 간 손상에도 효과가 있다고 한다[6,32]. 그러나 아직 미백 활성과 관련한 연구 보고는 미흡한 실정이다.

이에 이 연구에서는 S. crispa β-glucan을 B16F1 mouse melanoma 세포에 처리하여 멜라닌 생합성 및 tyrosinase 활성 억제 효능을 확인함으로써 피부 미백제로서의 활용 가능성을 평가하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

실험에 사용된 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylte- trazolium bromide (MTT)과 tyrosine, Triton X-100, mushroom tyrosinase, α-MSH, DOPA는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 또한 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF, actin은 Santa cruz (Santa cruz, CA, USA) 제품을 사용하였고, anti-mouse IgG는 Gene Tex (Irvine, CA, USA) 제품을 사용하였다. 세포 배양을 위한 배양액 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지와 fetal bovine serum (FBS)은 Hyclones사(Logan, Utah, USA) 제품을 사용하였으며, 항생제 penicillin-streptomycin은 GIBCO사(Grand Island, NY, USA) 의 제품을 사용하였으며, 그 외 시약은 일급 또는 특급 시약을 사용하였다.

S. crispa β-glucan의 추출

S. crispa에서 수용성 β-glucan을 추출하기 위하여 Park et al. [27]의 방법을 사용하였다. 인공적으로 배양한 S. crispa (Hanabiotech, Gyeonggi-do, Korea)의 버섯 자실체를 수분함량 4%로 건조시킨 후 분쇄기(FM 680T, Hanil, Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 100 mesh (직경 3.0-5.0 mm) 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 버섯 분말 100 g을 증류수 2 l에 현탁시키고 1 N NaOH로 pH를 10으로 조정한 후 2시간 동안 팽창시켰다. 추출탱크(Il-Shin Co., Seoul, Korea)에서 이 현탁액에 불용성 텅스텐 카바이드 나노입자(직경 10-500 nm, Inframat, Man- chester, CT, USA)를 20% (w/v) 비율로 가한 후에 고속유화기 (Misung Co., Seoul, Korea)로 20, 000 g에서 40분간 유화시켰다. 이때 불용성 텅스텐 카바이드 나노입자는 현탁액의 blend- ing을 향상시켜 주는 nanoknife로서의 역할을 하게 되며, S. crispa로부터 β-glucan을 추출할 때 효율을 높일 수 있고 비교적 균질한 크기의 입자를 얻을 수 있게 해 준다. 유화 작업 후에 증류수 20 ml을 추가하여 95ºC에서 30시간동안 교반시킨 후, 6, 500 g에서 20분간 원심 분리하였다. 원심분리된 상등액에 상등액 3배의 에탄올(95%, v/v)을 첨가한 후 4ºC에서 overnight 시켰다. 냉침 후 6, 500 g에서 20분간 원심분리하고 상등액은 4ºC에서 24시간 보관한 후에 다시 6, 500 g에서 20분간 원심분리하여 수용성의 상등액은 동결 건조하여 실험에 사용하였다. 동결 건조된 크림색의 분말 형태인 β-glucan의 함량은 Megazyme β-glucan assay kit (K-YBGL, Megazyme Int., Wicklow, Ireland)를 사용하여 측정하였으며, 수용성 β-glu- can의 함량은 70.2% 이었다. 그리고 β-glucan의 입도는 입자크기 분석기(Granulometer 1064, CILAS, Orleans, France)를사용하여 측정하였으며 크기는 150±14.1 nm이었다. 실험에서는 동결 건조된 β-glucan을 증류수에 용해시켜 사용하였다.

세포배양

B16F1 melanoma 세포는 미국세포주은행(ATCC: American Type Culture Collection, USA)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS와 1% penicillin- streptomycin이 첨가된 DMEM을 사용하여 37ºC, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.

세포 생존능 측정

B16F1 melanoma 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well 농도로 접종한 후 37ºC, 5% CO₂ incubator에서 하루 동안 안정화를 시킨 후 S. crispa β-glucan을 0, 10, 100, 1, 000 μg/ml 농도로 처리를 한 후 72시간 동안 배양하였다. 그 후 각 well의 배지들을 제거하고 MTT solution (5 mg/ml in PBS)을 100 μl씩 첨가하고, 37ºC에서 4시간 반응시킨 후 MTT solution을 제거하고, 각 well에 100 μl의 dimethyl sulfoxide (DMSO)를첨가하여 MTT formazan을 완전히 용해시키기 위하여 15~20 분간 plate shaker로 흔들어 준 다음 microplate reader (Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다[33].

Mushroom tyrosinase inhibition assay

자외선 또는 주변 환경에 의해 tyrosinase가 활성을 갖게 되면 tyrosine (또는 DOPA)이 중간생성 단계인 DOPA chrome 의 생성경로를 거쳐 자동 산화반응에 의해 멜라닌 고분자로 변화한다. _L-tyrosine을 기질로 하여 중간 단계인 DOPA chrome의 생성여부를 측정하였다. 즉, 다양한 농도별로 희석한 S. crispa β-glucan을 10 μl와 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)에 녹인 1 mM _L-tyrosine 170 μl을 96 well plate 에 넣고 mushroom tyrosinase (1, 000 unit/ml) 20 μl를 혼합한 후 상온에서 30분 배양한 후 490 nm에서 microplate reader (BioTek Instruments)를 이용하여 흡광도를 구하였다[12].

α-MSH에 의한 과생성 멜라닌 생성량 측정

B16F1 melanoma 세포를 60 mm culture dish에 5×10⁵ cells/dish로 접종한 후 37ºC, 5% CO₂ incubator에서 하루 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 200 nM의 α-MSH와 S. crispa β-glucan을 0, 10, 100, 1, 000 μg/ml 농도로 희석한 배지로 교체한 후 72시간을 더 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 2번 세척하고, 12, 000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 얻은 pellet을 멜라닌 정량에 사용하였다. 물에 불용성을 나타내는 멜라닌의 액화를 일으키기 위하여 10% DMSO 가 함유된 1 N NaOH를 적정량 넣고 65ºC 1시간 동안 반응을 시킨 후 microplate reader (BioTek Instruments)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다[9].

α-MSH에 의한 과생성 tyrosinase 활성도 측정

B16F1 melanoma 세포를 60 mm culture dish에 5×10⁵ cells/dish로 접종한 후 37ºC, 5% CO₂ incubator에서 하루 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 200 nM의 α-MSH와 S. crispa β-glucan을 0, 10, 100, 1, 000 μg/ml 농도로 희석한 배지로 교체한 후 72시간을 더 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 2번 세척하고, cell lysis buffer을 가하고 -80ºC 에서 30분 동안 세포를 용해시킨 후 12, 000rpm에서 30분 동안 원심분리 하였다. 그리고 얻어진 상등액 40 μl와 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹인 2 mg/ml의 _L-DOPA 160 μl를 첨가하여 1시간 동안 37ºC incubator에서 배양하였다. 반응이 끝난 후 tyrosinase에 의해 DOPA로부터 형성되는 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정하여 상대적 tyrosinase 활성으로 나타내었다[16].

Western blot 분석

60 mm culture dish에 5×10⁵ cells/dish로 접종한 후 37ºC, 5% CO₂ incubator에서 하루 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 S. crispa β-glucan을 0, 10, 100, 1, 000 μg/ml 농도로 희석한 배지로 교체한 후 각 실험에 조건에 맞추어 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 2번 세척하고, lysis buffer 를 첨가하여 균질화 시킨 후, 13, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액에 포함된 단백질을 얻었다. 단백질의 정량은 bicinchoninic acid (BCA) 방법으로 실시하였으며, 동량의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 nitrocellulose membrane에 전이한 다음 5% skim milk in TBST (20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0, 05% Tween 20)로 1시간 배양한 후 TBST로 15분씩 3회 반복하여 세척하였다. 세척된 membrane에 각 primary antibody 를 24시간 반응시킨 후 TBST에서 15분간 3회 세척 후 secondary antibody를 2시간 반응 후 enhanced chemiluminescence (ECL) system으로 발색반응을 유도하여 발현 정도를 측정하였다[8].

통계분석

실험결과는 평균 ± 표준오차로 표기하였으며, 자료는 SPSS 통계프로그램(version 24.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을이용하여 일원배치분산분석으로 검정하였고 Scheffe 다중비교로 사후검정 하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

결과

S. crispa β-glucan의 투여량에 따른 세포 생존능의 변화

S. crispa β-glucan이 B16F1 mealnoma 세포의 세포 생존 능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 시행하였다 (Fig. 1). β-glucan을 0, 10, 100, 1, 000 μg/ml의 각 농도별로 투여한 후 72시간동안 배양하여 세포의 생존능을 관찰하였다. S. crispa β-glucan 투여 농도에 따른 B16F1 세포의 생존능은유의한 변화를 확인할 수 없었다.

Fig. 1. Cell viability of B16F1 melanoma cells after treatment with S. crispa β-glucan. The cells were cultured in the presence of various concentrations of β-glucan for 72 hr. The viability of the cells was measured by MTT assay. Values are presented as means±standard error of 5 independent experiments.

Mushroom tyrosinase inhibition assay

Tyrosinase에 대한 S. crispa β-glucan의 직접적인 영향을 알아보기 위하여 0, 40, 200, 500, 1, 000 μg/ml의 다양한 농도로 조제한 후 기질인 _L-tyrosine을 이용하여 tyrosinase 활성 억제율을 알아보았다(Fig. 2). 양성 대조군으로 사용한 kojic 산의 경우 농도가 200, 500, 1, 000 μg/ml로 증가할수록 tyrosinase 활성을 각각 55.6%, 79.1%, 78.8% 감소시켰다(p<0.05). S. crispa β-glucan의 경우 40, 200, 500 μg/ml 농도에서는 각각 tyrosin-ase 활성이 107.3%, 101.2%, 101.4%로서 유의한 변화가 없었으며, 1, 000 μg/ml 농도에서는 tyrosinase 활성이 123.2%로 증가하였다.

Fig. 2. Inhibitory effect of S. crispa β-glucan on mushroom tyrosinase activity. Assay solution contains different concentrations of β-glucan, 1, 000 units/ml mushroom tyrosinase and 1 mM tyrosine. The assay mixture was incubated 25ºC for 30 min. Then tyrosinase activity was measured at 490 nm. Values are presented as means ± standard error of 5 independent experiments. *p<0.05 compared to control.

α-MSH에 의한 멜라닌 생성 유도 후 S. crispa β-glucan 의 멜라닌 생성 억제효과

S. crispa β-glucan이 멜라닌을 생성하는 세포 수준에서 효과가 있는 지를 확인하기 위하여 α-MSH로 자극한 B16F1 mel-anoma 세포에서 멜라닌 생성을 관찰하였다(Fig. 3). B16F1 melanoma 세포에서 200 nM의 α-MSH로 유도된 군은 대조군에 비하여 멜라닌 생성량이 207.5% 증가하였다. 여기에 β- glucan을 10, 100, 1, 000 μg/ml의 농도로 투여하였을 때 α- MSH 유도군에 비하여 멜라닌 생성량은 각각 13.9%, 18.7%, 39.5% 감소하여 통계적으로 유의하였다(p<0.05).

Fig. 3. Inhibitory effect of S. crispa β-glucan on melanin synthesis in B16F1 melanoma cells stimulated by 200 nM α-MSH. Cells were seeded at 5×10⁵ cells/well. After 24 hr, cells were treated with various concentration of β -glucan and α-MSH for 72 hr. Then melanin contents were measured at 405 nm. Values are presented as means ± standard error of 5 independent experiments. *p<0.05 compared to α-MSH alone group.

α-MSH 투여 후 과발현된 tyrosinase의 활성도에 미치는 S. crispa β-glucan의 효과

B16F1 melanoma 세포에 α-MSH를 처리한 후 tyrosinase 활성도에 미치는 S. crispa β-glucan의 효과를 확인하였다(Fig. 4). S. crispa β-glucan을 10 μg/ml 투여 시 β-glucan을 투여하지 않은 α-MSH 유도군에 비하여 tyrosinase 활성도가 15.6% 감소하였으며, 100 μg/ml로 처리 시 26.9%, 최종 농도인 1, 000 μg/ml에서는 43.2% 감소하여, tyrosinase의 활성을 통계적으로 유의하게 억제하였다(p<0.05).

Fig. 4. Inhibitory effect of S. crispa β-glucan on tyrosinase acitivity in B16F1 melanoma cells stimulated by 200 nM α-MSH. Cells were seeded at 5×10⁵ cells/well. After 24 hr, cells were treated with various concentration of β- glucan and α-MSH for 72 hr. Then tyrosinase activity was measured at 490 nm. Values are presented as means ±standard error of 5 independent experiments. *p<0.05 compared to α-MSH alone group.

α-MSH 투여 후 S. crispa β-glucan이 tyrosinase 단백 발현에 미치는 효과

S. crispa β-glucan이 세포수준에서 멜라닌 합성과 tyrosin- ase의 활성 감소에 영향을 주었으므로, α-MSH에 의해 과발현된 tyrosinase의 단백 발현에 미치는 영향을 확인하였다(Fig. 5). S. crispa β-glucan을 100 μg/ml와 1, 000 μg/ml로 처리하였을 때 α-MSH를 투여하여 과발현된 tyrosinase는 각각 37.5% 와 46.3% 감소하였다(p<0.05). 즉, S. crispa β-glucan의 농도가 증가할수록 tyrosinase 단백 발현이 감소하였다.

Fig. 5. Effect of S. crispa β-glucan on tyrosinase protein expression in B16F1 melanoma cells stimulated by 200 nM α- MSH. Cells were incubated with β-glucan and α-MSH for 3 days. The expression levels of tyrosinase protein were examined by western blot. Equal protein loadings were confirmed by actin expression. Values are presented as means±standard error of 5 independent experi- ments. *p<0.05 compared to α-MSH alone group.

α-MSH 투여 후 S. crispa β-glucan이 TRP-1과 TRP-2 단백 발현에 미치는 효과

S. crispa β-glucan의 TRP-1 (Fig. 6A)과 TRP-2 (Fig. 6B) 단백 발현에 미치는 영향을 확인하였다. β-glucan을 100 μg/ml와 1, 000 μg/ml로 처리하였을 때 α-MSH를 투여하여 과발현된 TRP-1은 각각 24.4%와 46.1% 감소하였다(p<0.05). TRP-2의 경우에도 β-glucan을 100 μg/ml와 1, 000 μg/ml로 처리하였을 때 α-MSH만 투여했을 때보다 각각 42.3%와 57.1% 감소하였다(p<0.05) 즉, S. crispa β-glucan의 농도가 증가할수록 TRP-1 과 TRP-2 단백 발현이 감소하였다.

Fig. 6. Effect of S. crispa β-glucan on TRP-1 (A) and TRP-2 (B) protein expression in B16F1 melanoma cells stimulated by 200 nM α-MSH. Cells were incubated with β-glucan and α-MSH for 3 days. The expression levels of TRP-1 and TRP-2 proteins were examined by Western blot. Equal protein loadings were confirmed by actin expression. Values are presented as means ± standard error of 5 independent experiments. *p<0.05 compared to α-MSH alone group.

S. crispa β-glucan의 MITF 활성에 대한 효과

S. crispa β-glucan이 tyrosinase, TRP의 강력한 전사 조절인자인 MITF 단백 발현에 미치는 영향을 확인하였다(Fig. 7). 200 nM로 처리된 α-MSH 유도된 군은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 MITF 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, S. crispa β-glucan의 농도가 증가함에 따라 MITF 단백 발현이 현저하게 감소하였다(100 μg/ml: 44.6% 감소, 1, 000 μg/ml: 63.1% 감소, p<0.05).

Fig. 7. Effect of S. crispa β-glucan on MITF protein expression in B16F1 melanoma cells stimulated by 200 nM α-MSH. Cells were incubated with β-glucan and α-MSH for 3 days. The expression levels of MITF protein were examined by Western blot. Equal protein loadings were confirmed by actin expression. Values are presented as means±standard error of 5 independent experiments. *p<0.05 compared to α-MSH alone group.

고찰

천연물 중에서도 각종 영양소를 함유하고 있는 기능성 버섯은 다양한 질병을 위한 약용과 식용의 경계에 있다. S. crispa은식이섬유가 풍부하고, β-glucan이 40% 이상 함유되어 있다고 알려지면서 재배량도 증가하고 있다[15,20]. 또한 S. crispa은필수아미노산과 비타민 E, 비타민 C가 다른 버섯에 비하여 높게 함유하고 있음이 확인되었다[29]. S. crispa은 다양한 생리활성 효과를 가진 것으로 알려지면서 환, 액상 등 건강기능식품과, 꽃송이버섯 추출물을 부 원료로 함유한 홍삼과 발효유 등의 가공식품도 시판되고 있다. 그러나 국내의 S. crispa 이용기술은 제약이나 식품 분야에서만 활용되고 있으며, 화장품 분야에서는 활용이 저조한 실정이므로 이 연구에서는 S. crispa 에서 추출한 β-glucan의 새로운 미백 물질로서의 가능성을 제시하고자 하였다.

S. crispa β-glucan의 직접적인 미백활성 정도를 알아보기 위하여 mushroom tyrosinase assay를 수행하였다. Mushroom tyrosinase의 저해는 tyrosinase 활성부위 구리이온의 상태변화에 관여함으로써 tyrosinase의 산화, 환원 과정을 조절할 수 있으므로, mushroom tyrosinase를 이용한 시험관 내 tyrosinase 활성 억제 실험은 미백제 개발에 있어 유용한 일차적 평가법으로 인정받고 있다. Tyrosinase의 활성을 저해하는 것으로 이미 규명된 양성대조군인 kojic acid의 경우 농도 의존적으로 mushroom tyrosinase의 활성을 억제시켰으나, S. crispa β-glucan의 경우 농도가 증가하여도 mushroom ty- rosinase의 활성에는 변화가 없었다, 즉, 시험관 내 실험에서는 S. crispa β-glucan이 tyrosinase 활성을 억제하지 못하고 있었다. 이는 꽃송이버섯, 상황버섯, 차가버섯 메탄올 추출물이 세포 내에서 생성되는 멜라닌 함량 및 tyrosinase 활성에 효과적으로 나타났으나, 이들 중 상황버섯만이 mushroom tyrosin-ase 활성에 가장 효과적이였으며, 꽃송이 버섯추출물은 mushroom tyrosinase 활성에는 영향이 없었다는 연구 결과와 일치하고 있었다[17]. 따라서 β-glucan이 직접적으로 멜라닌 합성 초기 단계에 관여하는 tyrosinase의 활성을 저해하는 효과는 낮았지만 세포의 대사과정에 영향을 끼쳐 멜라닌 색소를 억제할 가능성을 확인하기 위하여 B16F1 melanoma 세포 수준에서 미치는 영향을 알아보았다.

S. crispa β-glucan이 B16F1 melanoma 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 S. crispa β-glucan의 세포 생존 능을 확인한 결과 대조군에 비하여 유의할 만한 변화를 나타내지 않았다. 따라서 S. crispa β-glucan은 세포사멸과 같은 세포독성이 아닌 세포 내 tyrosinase 활성을 억제할 것으로 판단되어 B16F1 melanoma 세포수준에 미치는 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 대한 효능을 측정하였다.

멜라닌 생성을 유도하는 것으로 알려진 α-MSH는 멜라닌생성 유발 물질 중에서 가장 강력한 것으로 알려져 있다. α-MSH 는 뇌하수체 및 피부를 포함한 여러 가지 말초조직에서 분비되는 pleiotropic molecule로서 표피세포의 성장과 증식, 국소조직의 면역 조절 및 흑색종 세포와 실험동물의 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 자극한다[19]. 또한 세포내에 α-MSH를 처리 시 세포 구조를 이루는 actin filament들이 재구성되면서 세포 형태가 수지상돌기가 많은 수지상 세포(dendritic cell)로 변하여 α-MSH 자극에 의해 생성된 멜라닌 방출을 용이하게 한다 [18]. S. crispa β-glucan이 α-MSH로 유도된 과생성 tyrosinase 의 활성과 melanin 합성에 미치는 영향을 확인한 결과 S. crispa β-glucan의 농도가 증가할수록 α-MSH로 유도된 과생성 tyrosinase의 활성이 억제되었으며, 과생성 melanin 합성도 감소하였다. 이는 S. crispa β-glucan이 멜라닌 생성을 자극하는 α-MSH에 의해 유도되어진 세포내 tyrosinase 활성을 저해함으로써 멜라닌 합성량도 감소됨을 의미하는 것으로 보인다. 생체 내에서의 멜라닌 합성과정은 tyrosine을 기질로 하여 DOPA를 생성시키고 다시 DOPA quinone으로 산화시키는 과정으로서 연속적인 효소적 산화가 진행된 후 각 생성물의 중합반응에 의해서 멜라닌이 생성되며, 이 과정에서 tyrosin- ase가 주요 효소로 작용한다[7,34]. 따라서 멜라닌 생성과정의 주 효소로 여겨지고 있는 tyrosinase의 작용을 억제한다면 효과적으로 멜라닌 합성을 억제할 수 있을 것이다.

멜라닌 합성에서 가장 중요한 효소인 tyrosinase 단백 발현을 조절하는 기전은 크게 전사 이전과 그 이후의 단계로 구분할 수 있는데, 전사 이전 단계 중의 하나인 cAMP 경로는 멜라닌 합성과정 조절과 세포분화에 중요한 역할을 하며, cAMP 경로의 활성이 지속되면 많은 양의 멜라닌이 축적되고 멜라닌세포의 말단에 분화가 일어나게 된다[2,23]. 자외선 등의 자극에 의해 α-MSH와 MC₁R이 결합하여 세포내 cAMP 농도를 증가 시켜, cAMP 의존적인 protein kinase인 PKA를 활성화시킨다. PKA는 전사조절 인자로 알려진 CREB을 인산화 시킬 수 있고, 인산화된 CREB은 멜라닌 생성 주효소의 전사를 증가시키는 tyrosinase promoter 영역에 결합하는 MITF 발현을 증가시킨다. MITF는 tyrosinase와 TRP의 강력한 전사 조절인자로서, MITF는 핵으로 이동하여 DNA의 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 promoter에 결합하여 각각의 유전자 발현을 증가 시켜 멜라닌생성을 유발한다[1].

이 연구에서 멜라닌 합성에 관계된 tyrosinase와 TRP-1, TRP-2 단백 발현에 미치는 β-glucan의 영향을 확인한 결과, S. crispa β-glucan은 α-MSH로 유도되어진 tyrosinase와 TRP- 1, TRP-2 단백 발현을 효과적으로 감소시켰다. 따라서 S. crispa β-glucan이 세포내 α-MSH로 유도된 멜라닌 생성을 유의적으로 감소시키는 것이 세포내 tyrosinase가 작용하는 단계의 전이나, 후 어떠한 과정에 영향을 미쳐 활성을 억제하는 것이라고 추정할 수 있다. 또한 S. crispa β-glucan이 α-MSH로 유도되어진 MITF 단백 발현에 대한 영향을 측정한 결과에서도 효과적으로 MITF 발현을 감소시켰다. 즉, S. crispa β-glucan은 MITF 발현을 억제하여 tyrosinase 등의 단백의 발현도 감소시킴으로써 멜라닌 합성을 억제하는 것으로 판단된다.

이상의 결과를 종합해 보면 S. crispa β-glucan은 외부자극제인 α-MSH를 처리하여 과생성된 멜라닌 합성을 억제하였다. 또한 멜라닌 합성에 관여하는 key enzyme인 tyrosinase의 발현을 효과적으로 억제하였으므로 미백제로서 유용하게 활용할 가치가 있는 것으로 판단한다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.