조희풀(Clematis heracleifolia) 줄기의 성분

Chemical Constituents of Clematis heracleifolia Stem

Abstract

Four compounds were isolated from 90% ethanol extract of the stem of Clematis heracleifolia. On the basis of spectral data, the structure of isolated compounds were identified as sitosterone (1), β-sitosterol (2), scoparone (3) and octadecanoyl caffeate (4), respectively. Sitosterone (1) and octadecanoyl caffeate (4) are isolated from this plant for the first time.

조희풀(Clematis heracleifolia)은 미나리아재비과(Ranunculaceae) 에 속하는 낙엽성 반관목으로 우리나라 전역과 만주 지역에 분포한다.¹⁾ 뿌리와 줄기를 채취하여 약용하며, 풍습을 몰아내고 염증을 제거하는 효능이 있어 수족관절통의 치료, 설사를 멈추는 효능으로 만성설사의 치료에도 사용하고 있다.²⁾ 본 연구자 등은 조희풀을 대상으로 성분에 연구에 착수하고 모든 부위의 성분을 분리하고 구조를 동정하여 그 성분 상을 밝혀 약용자원으로서의 가능성과 식물분류학적 marker 로서의 사용 가능성 등을 알아보려 하였으며 그 결과의 일부로서 지하부로부터 coniferyl alcohol, scoparone, (+)- lariciresinol, daucosterol 등을 분리하고 이들의 acetyl- cholinesterase억제 활성을 측정하여 보고하였고, ³⁾ 잎으로부터는 protocatechuic acid, ferulic acid, caffeic acid, aesculin, (6Z)-9-hydroxylinaloyl glucoside 및 9-hydroxylinaloyl glucoside 등을 분리하여 보고하였다.⁴⁾ 이 연구는 계속되는 조희풀의 성분에 관한 연구의 일부로 조희풀의 줄기를 대상으로 성분 상을 밝히고자 하였으며, 조희풀 줄기의 90% ethanol 추출물 중 n-hexane 분획과 CHCl₃ 분획으로부터 4종의 화합물을 분리하고 그 구조를 밝혔기에 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 – 본 실험에 사용한 조희풀(C. heracleifolia) 의줄기는 2013년 9월 사명산의 북서쪽에 위치하는 양구군 공수리 일대에서 채집하여 강원대학교 약학대학 권용수 교수가 정확하게 감정한 후 음건하여 사용하였다. 확증표본 (KNUPH–2013–09–S-01)은 강원대학교 약학대학 표본실에 보관하였다.

기기 및 시약 – ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR spectra는 Bruker 사의 AVANCE 600을 이용하여 측정하여 얻었다. ESI mass는 AB Sciex 사의 API 3200 LC/MS/MS system을 이용하여 negative 또는 positive mode로 측정하였고 EI mass는 Jeol 사의 JMS-700 Mass spectrophotometer를 사용하여 측정하였다. Flash column chromatograhpy는 Teledyne Isco사의 CombiFlash^®Retrieve^TM를 이용하였고 column은 RediSep^®을이용하였다. 각 분획의 추출용매 및 column chromatography 용용 매는 특급시약을 증류하여 사용하였다. TLC 전개용매 및 기타 시약은 특급 및 분석용 시약을 사용하였다. TLC plate는 Merck사의 precoated Kieselgel 60 F254s(layer thickness 0.25mm, 20×20cm, Merck Art. No. 5715), RP-18 F 254s를 사용하였으며, column chromatography의 충진제는 Merck 사의 Kieselgel 60(63-200µm 또는 40-63µm) 및 YMC gel ODS-A(150μm)를 사용하였다. TLC spot 발색은 254nm UV 및 20% 황산용액을 사용하였다.

추출 및 분리 – 채집 후 음건하여 세절한 조희풀(C. heracleifolia)의 줄기 2.4 kg을 90% 에탄올 15 L에 넣고 실온에서 3일간씩 3회 추출하였다. 추출액은 여지를 이용하여 여과한 후 여액을 40^oC이하에서 감압농축하고 건조엑스 100g을 얻었다. 얻어진 추출물 98 g을 증류수로 현탁 시킨 후 n-hexane, CHCl₃, n-BuOH순으로 분획하고 남은 물층을제거하였다. 각 분획들을 감압농축하여 n-hexane 분획 9.6 g, CHCl₃ 분획 8.1 g, n-BuOH 분획 18.7 g을 각각 얻었다. 얻어진 n-hexane 분획과 CHCl₃ 분획을 TLC 분석을 통하여 비교한 결과 매우 유사하였으므로 이 두 분획을 함께 분리하고자 하였다. n-Hexane 분획과 CHCl₃ 분획을 함께 silica gel column(63-200µm, 500g, 10×50 cm)에 걸어 CHCl₃:MeOH (19:1)을 용매로 용출시켜 6개의 분획을 얻었다(CH-1 – CH- 6). 분획 CH-2(1.9 g)를 다시 silica gel column(63-200µm, 100 g, 3.5×50 cm)에 걸고 benzene:EtOAc(9:1)을 용매로 용출시키고 다섯 개의 소분획을 얻었다(CH-2-1 – CH-2-5). 소분획 CH-2-2(0.9 g)를 대상으로 silica gel column(40-63 µm, 100 g, 3.5×50 cm)에 걸고 n-hexane:EtOAc(9:1)을 용매로 용출시켜 네 개의 소분획으로 다시 나누었다(CH-2-2- 1–CH-2-2-4). 이들 소분획 중 소분획 CH-2-2-2(65 mg)는 silica gel column(40-63µm, 100 g, 3.5×50 cm)에 걸고 CHCl₃를 용매로 정제하여 화합물 1(9 mg)을 얻었다. 소 분획 CH-1-3(0.5 g)은 MeOH로 재결정을 반복하여 흰색 분말 형태의 화합물 2(150 mg)를 얻었다. 소분획 CH-2-2-3(47 mg)을 대상으로 ODS flash column(Redisep^® ODS 43 g) 에걸고 MeOH:H₂O(60:40)을 용매로 정제하고 화합물 3(6 mg)을얻었다. 분획 CH-3(3.5 g)을 ODS column(YMC ODS A, 150µm, 200 g, 5×50cm)에 걸고 MeOH:H₂O(80:20)을 용매로 용출시켜 여섯 개의 분획으로 나누었다(CH-3-1 – CH- 3-6). 분획 CH-3-6 (1.2 g)을 다시 silica gel column(40- 63µm, 100 g, 3.5 × 50 cm)에 걸고 benzene:EtOAc(5:1)을용매로 용출시키고 아홉 개의 소분획으로 나누었다(CH-3- 6-1 – CH-3-6-9). 이들 소분획 중 소분획 CH-3-6-3(62 mg)을 silica gel column(40-63µm, 40 g, 1.5×50 cm)에 걸고 CHCl₃: MeOH(49:1)을 용매로 정제하여 화합물 4(12 mg)를 얻었다.

화합물 1 – White powder; ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 5.72 (1H, s, H-4), 1.18 (3H, s, 19-CH₃), 0.91 (3H, d, J=6.6 Hz, 21-CH₃), 0.84 (3H, t, J=7.4 Hz, 29-CH₃), 0.83 (3H, d, J=6.8 Hz, 27-CH₃), 0.81 (3H, d, J=6.8 Hz, 26-CH₃), 0.71 (3H, s, 18-CH₃); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 199.7 (C- 3), 171.7 (C-5), 123.7 (C-4), 56.0 (C-17), 55.9 (C-14), 53.8 (C-9), 45.8 (C-24), 42.4 (C-13), 39.6 (C-12), 38.6 (C-10), 36.1 (C-20), 35.7 (C-1), 35.6 (C-8), 34.0 (C-2), 33.9 (C-22), 32.9 (C-6), 32.0 (C-7), 29.1 (C-25), 28.2 (C-16), 26.0 (C-23), 24.2 (C-15), 23.0 (C-28), 21.0 (C-26), 19.8 (C-21), 19.0 (C- 11), 18.7 (C-27), 17.4 (C-19), 12.0 (C-29), 11.9 (C-18); EI- MS (%) m/z : 412[M, 93.1]⁺, 397 (11.8), 370 (29.1), 355 (7.5), 327 (8.6), 289 (27.3), 271(26.8), 245 (10.7), 229 (58.6), 147 (27.5), 124 (100), 95 (33.6).

화합물 2 – White needle; ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 5.35 (1H, d, J=5.1 Hz, H-6), 3.52 (1H, m, H-3), 1.01 (3H, s, 19-CH₃), 0.92 (3H, d, J=6.5 Hz, 21-CH₃), 0.85 (3H, t, J=7.6 Hz, 29-CH₃), 0.83 (3H, d, J=6.8 Hz, 27-CH₃), 0.81 (3H, d, J=6.8 Hz, 26-CH₃), 0.68 (3H, s, 18-CH₃); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 140.8 (C-5), 121.71 (C-6), 71.8 (C-3), 56.8 (C-14), 56.0 (C-17), 50.1 (C-9), 45.8 (C-24), 42.3 (C-4, C-13), 39.8 (C-12), 37.2 (C-1), 36.5 (C-10), 36.1 (C-20), 33.9 (C-22), 31.9 (C-7), 31.7 (C-2), 29.1 (C-25), 28.2 (C-16), 26.1 (C-23), 24.3 (C-15), 23.1 (C-28), 21.1 (C-11), 19.8 (C-26), 19.4 (C-19), 19.0 (C-27), 18.8 (C-21), 12.0 (C-18), 11.9 (C-29); ESI-MS (negative mode) m/z : 413 [M-H]^-.

화합물 3 – White powder; ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 7.62 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4), 6.86 (1H, s, H-5), 6.85 (1H, s, H-8), 6.29 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 3.95 (3H, s, OCH₃), 3.94 (3H, s, OCH₃); ESI-MS (negative mode) m/z : 205 [M- H]^-.

화합물 4 – Brown powder; ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ: 7.52 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 7.03 (1H, d, J=2.0Hz, H-2), 6.93 (1H, dd, J=8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 6.28 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8), 4.12 (2H, t, J=6.6 Hz, H-1′), 1.58 (2H, m, H-2′), 1.27 [br s, (CH₂)₁₅], 0.89 (3H, t, J=6.8 Hz, CH₃); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 169.4 (C-9), 148.7 (C-4), 146.8 (C-7), 143.9 (C-3), 127.7 (C-1), 122.9 (C-6), 116.5 (C-5), 115.2 (C-2), 115.1 (C-8), 65.6 (C-1′), 35.1 (C-16′), 33.1 (C-2′), 30.8~30.3 (C-4′~C-15′), 26.1 (C-3′), 23.7 (C-17′), 14.4 (C-18′); EI-MS (%) m/z : 432 [M, 9.0]⁺, 284 (10.5), 256 (27.9), 213 (13.3), 180 (11.6), 111 (41.9), 97 (78.7), 83 (97.6), 69 (91.6), 57 (100).

결과 및 고찰

화합물 1은 백색 분말 형태로 얻었으며, 이 화합물의 ¹H- NMR spectrum을 보면 δ 1.18, 0.71에서 18번과 19번의 metyl기에 의한 singlet, δ 0.91에서 J=6.6 Hz의 doublet으로 나타나는 21번 mehtyl기의 signal, δ 0.83과 0.81에서 J=6.8 Hz의 doublet으로 나타나는 26번과 27번의 methyl기에 의한 signals, 0.84에서 J=7.4 Hz의 triplet으로 나타나는 29번의 methyl기의 존재를 확인할 수 있었으며, ¹³C-NMR spectrum 에서 29개의 탄소에 의한 signal들을 확인할 수 있었으므로 이 화합물은 sitgmastane계열의 sterol 화합물로 추정하였다.⁵⁾ 또한 ¹H-NMR spectrum의 δ 5.72에서 수소 1개에 의한 singlet이 나타나고 3번 위치에 OH기가 치환되어 있는 sterol 화합물에서 일반적으로 보여지는 δ 3.5 근처의 3번 수소에 의한 multiplet의 존재를 확인할 수 없었으며, ¹³C-NMR spectrum에서도 3번 위치에 OH기가 치환되었을 때 나타나는 δ 70~80 부근의 탄소 signal은 확인할 수 없고 δ 199.7 에서 carbonyl signal을 확인할 수 있었으므로 이 화합물의 3번은 OH기가 존재하는 것이 아닌 carbonyl기가 존재함을 알 수 있었다. 또한 δ 171.7에서 5번 탄소의 signal 나타나는데 이는 일반적인 Δ⁵-sterol계 화합물의 5번 탄소가 δ 140~150 부근에서 나타나는 것과 비교하여 볼 때 약 30 ppm 저자장 이동되어 나타남을 알 수 있었다. 이는 이중결합이 4번과 5번위치에 존재하여 3번의 carbonyl기와 conjugate 되어 나타나는 것으로⁶⁾ 전형적인 Δ⁴-3-ketosteroid 형태의 화합물임을 알 수 있었다.⁷⁾ 이는 mass spectrum의 fragmentation을 통해서도 확인할 수 있었는데 분자량이 m/z 412인 모핵의 A환과 B환이 깨지면서 생성된 fragmentation이 m/z 95 (C₆H₇O)에서 비교적 강하게(33.6%) 나타나 위의 사실을 확인할 수 있었다.⁸⁾ 위에서 확인한 사실과 문헌⁹⁾을 비교하여 화합물 1은 sitosterone으로 그 구조를 동정하였다. 화합물 2와 3은 표준품과의 TLC 비교 및 문헌^{3), 10)}과 spectral data를 비교하여 그 구조를 β-sitosterol과 scoparone으로 동정하였다. 화합물 4의 ¹H-NMR spectrum을 보면 δ 7.52와 6.28에서 나타나는 J=15.9 Hz의 doublet, δ 7.03에서 나타나는 J=2.0 Hz의 doublet, δ 6.93에서 나타나는 J=8.2, 2.0 Hz의 double doublet 및 δ 6.77에서 나타나는 J=8.2 Hz의 doublet으로부터 이 화합물에는 한 개의 caffeic acid가 존재한다는 것을 알 수 있었으며, δ 4.12에서 나타나는 한 개의 methylene기에 기인하는 J=6.6 Hz의 triplet, δ 0.89에서 나타나는 methyl 기에 기인하는 J=6.8 Hz의 triplet 그리고 δ 1.27 근처에 나타나는 16개의 metylene기에 기인하는 signal들을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 화합물 4는 caffeic acid에 octadecanoyl기가 ester 결합을 하고 있다는 것을 알 수 있었다. Mass spectrum에서는 분자량이 m/z 432에서 나타나고 여기에서 octadecanoyl기가 이탈되면서 형성된 fragmentation ion이 m/z 180(caffeic acid)에서 나타나는 것을 확인할 수 있었다. ¹³C-NMR spectrum에서도 caffeic acid의 C=O가 δ 169.4에서 나타나고 octadecanoly기의 1번 탄소가 δ 65.6에서 나타나는 것으로부터도 이 화합물은 caffeic aicd에 octadecanoyl기가 ester결합을 하고 있음을 알 수 있었다. 이 결과들을 문헌¹¹⁾과 비교하여 화합물 4는 octadecanoyl caffeate로 동정하였다. 본 연구를 통하여 얻은 화합물들의 활성에 관한 연구를 찾아보면 sitosterone(1)은 DPPH radical 소거작용이 보고되어 있을 뿐 기타 활성을 찾아보지 못하였다.¹²⁾ β-sitosterol(2)은 매우 다양한 활성의 연구가 진행되어 지나친 음주에 따른 간 손상을 감소시키는 효과,¹³⁾ 항염증 작용,¹⁴⁾ 항암활성,¹⁵⁾ 지질대사 조절작용¹⁶⁾ 등이 보고되었다. Scoparone(3)은 항염증,¹⁷⁾ 항암,¹⁸⁾ 심근보호효과¹⁹⁾ 등이 보고되었다. 한편, octadecanoyl caffeate(4)의 활성에 관한 연구는 찾아볼 수 없었다.

Fig. 1. Structures of 1–4.

결론

조희풀(Clematis heracleifolia) 줄기의 성분상을 밝히고 활성 물질의 자원이나 식물분류학적 기준물질로서의 사용 가능성을 알아 보기 위하여 연구에 착수하고 4종의 화합물을 분리하고 그 구조를 동정한 결과 화합물의 구조는 각각 sitosterone(1), β-sitosterol(2), scoparone(3) 및 octadecanoyl caffeate(4)이었다. 이들 화합물 중 sitosterone(1)과 octadecanoyl caffeate(4)는 이 식물에서는 처음으로 분리되었으며, 활성에 관한 연구도 계속되어야 할 것으로 생각된다.