섬유 폐수 활성 슬러지에서 분리한 Comamonas testosteroni의 생물학적 페놀 분해

Biodegradation of Phenol by Comamonas testosteroni DWB-1-8 Isolated from the Activated Sludge of Textile Wastewater

Abstract

산업화 이후 다양한 화학물질의 생산과 이용은 우리 삶의 질을 높이는데 기여하였지만 그로 인한 대량의 폐기물 방출은 필연적이며 환경오염은 날이 갈수록 심각해지고 있다. 환경오염에 의한 화학물질의 노출은 인간의 건강과 생태계에 악영향을 주고 있다. 우리의 삶에 영향을 줄 수 있는 오염된 환경을 정화하는 것은 매우 중요한 문제이다. 광범위한 석유화학제품의 사용으로 인해 독성 난분해성 방향족화합물이 토양, 지하수, 폐수 등에서 빈번하게 검출되고 있다. 특히 합성수지, 합성섬유, 염료, 살충제, 방부제 등의 원료로 사용되는 페놀은 주요 오염물질이며, 호흡곤란, 두통, 구토, 돌연변이, 발암 등을 일으킬 수 있다. 본 연구에서는 페놀분해균주인 DWB-1-8을 섬유폐수에서 분리, 동정하였으며 16S rRNA유전자 염기서열분석결과 Comamonas testosteroni로 동정 되었다. 본 실험 균주의 최적 생장 및 최적페놀분해 배양 조건은 0.7% K₂HPO₄, 0.6% NaH₂PO₄, 0.1% NH₄NO₃, 0.015% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 초기 pH 7 및 30℃ 였으며, 다른 독성 화합물인 벤젠, 톨루엔 혹은 크실렌(BTX)을 유일탄소원으로 이용하여 생장할 수 있었다.

Since industrialization, the production and utilization of various chemicals has contributed to improving the quality of our lives, but the subsequent discharge of massive waste is inevitable, and environmental pollution is becoming more serious every day. Exposure to chemicals as a result of environmental pollution is having a negative effect on human health and the ecosystem, and cleaning up the polluted environment that can affect our lives is a very important issue. Toxic aromatic compounds have been detected frequently in soil, groundwater, and wastewater because of the extensive use of oil products, and phenol, which is used to produce synthetic resins, textiles, and dyes, is one of the major pollutants, along with insecticides and preservatives. Phenol can cause dyspnea, headache, vomiting, mutation, and carcinogenesis. Phenol-degrading bacterium DWB-1-8 was isolated from the activated sludge of textile wastewater; this strain was identified as Comamonas testosteroni by 16S rRNA gene sequencing. The optimal culture conditions for the cell growth and degradation of phenol were 0.7% K₂HPO₄, 0.6% NaH₂PO₄, 0.1% NH₄NO₃, 0.015% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, an initial pH of 7, and a temperature of 30℃. The strain was also able to grow by using other toxic compounds, such as benzene, toluene, or xylene (BTX), as the sole source of carbon.

서론

산업화 이후 다양한 화학물질이 생산되고 이용됨으로써 인류의 삶의 질이 많이 향상되었지만, 그로 인한 대량의 폐기물방출은 필연적이며 환경오염은 날이 갈수록 심각해지고 있으며, 화학물질의 노출로 인한 환경오염으로 인간의 건강과 생태계에는 불리한 영향이 미치고 있다[5,14]. 그러므로 우리의 삶에 영향을 줄 수 있는 오염된 환경을 정화하는 일은 매우 중요한 과제이며, 따라서 환경정화를 위해 또다른 화학약품을쓰게 되는 문제점을 개선하기 위하여 미생물을 이용한 생물학적 처리에 대한 관심이 증가되고 있다.

페놀은 합성섬유, 염료, 살충제, 방부제, 소독제 등 화학제품의 원료로 사용되고, 포름알데히드류와 축합반응하면 절연성이 뛰어난 페놀 수지로 전환되므로 전자 재료로 사용되며, 이러한 공장의 방류수로부터 다량 유출된다[9]. 유출된 페놀이 하천으로 유입되면 0.005 ppm의 낮은 농도에도 악취가 발생된다. 또한 상수도 시설에서 살균을 위해 염소를 처리하게 되는데, 이 과정에 페놀이 유입되면 잔존 염소와 반응하여 더욱 독성이 강한 클로로페놀이 형성되어 인체에 악영향을 주게된다[1].

페놀은 호흡곤란, 두통, 구토, 돌연변이, 발암 등의 문제를 야기하는 독성 난분해성 물질이며[11], 미국환경보호청(Environmental Protection Agency, EPA)과 유럽연합(EU)에서 페놀이 유해물질로 지정되어 있고 우리나라 환경부에서도 유해 화학물질로 지정되어 있다[4].

대부분의 독성 유기화합물은 일정 수준 이상의 농도가 되면 미생물의 분해 활성을 현저히 저하시키며 미생물 생육이 불가능해진다[13]. 페놀은 200 ppm의 낮은 농도에서도 미생물의 생육을 저해하기 때문에 폐수의 생물학적 처리에 이용되는 미생물은 고농도의 페놀에 저항성을 갖고 생육할 수 있어야 하며, 폐수에 공존하는 다양한 화합물을 분해할 수 있는 미생물이 좋은 미생물이라고 할 수 있다[3, 9, 10].

본 연구에서는 염색 폐수 처리과정의 활성 슬러지에서 페놀을 분해할 수 있는 그람음성 세균인 Comamonas testosteroni를 순수 분리 배양한 후, 최적 생육 조건을 탐색하였고, 페놀 이외의 난분해성 기질을 유일탄소원으로 이용하여 생장할 수 있는지 조사하기 위하여 기질 특이성을 연구하였다.

재료 및 방법

실험 균주의 분리 및 동정

본 연구에 사용된 실험 균주는 대구염색산업단지 관리공단 폐수처리장의 생물학적 처리과정 폭기조의 활성 슬러지에서 분리 하였다. R2A broth 10 ml에 활성 슬러지 100 μl를 접종하여 30℃ 180 rpm으로 3일간 배양 한 뒤, 배양액을 1/106 희석한 희석 배양액 50 μl을 R2A agar배지에 도말 하여 30℃배양후 single colony를 분리 하였다. 분리된 실험 균주는 16SrRNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다. 16S rRNA유전자증폭은 785F (5’-GGATTAGATACCCTGGTA-3’) forwardprimer와 907R (5’-CGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’) reverseprimer를 사용하였다. 분석된 염기서열을 EzBioCloud와 NCBIBLAST의 데이터베이스를 이용하여 유사도를 비교하였다[15].

배양 조건

R2A agar 고체 배지에 계대 배양한 실험 균주를 R2A broth액체 배지 10 ml에 white loop (1 μl)를 이용하여 1 loop 접종하여 30℃ 180 rpm으로 24시간 전배양 하였다. 본배양은 탄소원이 없는 최소 배지1(K₂HPO₄ 0.4%, NaH₂PO₄ 0.1%, (NH₄)₂SO₄0.05%, MgSO₄ 7H₂O 0.015%)[16] 혹은 최소 배지1을 변형시킨 최소 배지₂(K₂HPO₄ 0.4%, NaH₂PO₄ 0.1%, NH₄NO₃ 0.1%,MgSO₄ 7H₂O 0.015%)에 유일 탄소원으로 페놀을 500 ppm첨가하여 만든 배지에 전배양액을 2%(v/v) 접종하여 30℃ 180 rpm으로 배양 하였다.

최적 생장 및 최적 페놀 분해 조건 탐색

페놀을 유일탄소원으로 실험 균주가 가장 잘 생육 되는 조건을 탐색하기 위하여 최소 배지의 성분(K₂HPO₄, NaH₂PO₄)을 농도별 (0~1.0%)로 첨가한 배지, 다양한 질소원을 첨가시킨배지((NH₄)₂SO₄, KNO₃, NH₄NO₃), 무기염을 첨가한 배지(CaCl₂ 2H₂O, NaCl, KCl, FeSO₄ 7H₂O, ZnSO₄ 7H₂O)에 실험균주를 배양하여 균체생육도를 측정하였고, 초기 pH (4-10) 및 배양 온도(25℃-37℃)에 따른 균체생육도를 측정 하였다.

기질 특이성 조사

실험 균주의 기질특이성은 위에 기술한 최소 배지2에 탄소원으로 페놀 대신 다른 난분해성 화합물(Benzene, Chloroform, 1,4-dioxane, n-Hexane, Toluene, Xylene)을 각각 0.1%혹은 0.5%씩 첨가하여 배양한 후, 균체생육도를 측정하여 기질특이성을 검토하였다.

페놀분해유무 및 균체 생육도 측정

페놀분해유무는 비색분석법을 통하여 조사하였다[3, 6-8].배양액을 원심분리(10,000 rpm, 10 min)하여 상등액 1.0 ml를 취하여 균체를 제거하고, 발색 시약(2 N NH4OH 50 μl, 2%4-aminoantipyrine 25 μl, 8% K3Fe(CN)6 25 μl)을 첨가하여 잘혼합하고 약 3분간 정치한 뒤, spectrophotometer를 이용하여500 nm 흡광도를 측정하였다. 균체생육도는 배양액의 660 nm흡광도 측정을 통해 조사하였다.

비색분석법의 표준 곡선

4-aminoantipyrine을 이용한 비색분석법의 경우, 발색 반응시약들을 첨가하였을 때 용액 내에 페놀이 없는 경우 밝은노란빛을 띄며 페놀이 있는 경우 짙은 보랏빛을 띈다. 증류수에 농도 별로 페놀을 첨가하여 표준 곡선(Fig. 1)을 작성해본결과, 30 ppm 이하의 좁은 농도구간에서만 500 nm 흡광도를통하여 유의미한 값의 측정이 가능하였고 페놀 농도가 감소할수록 흡광도가 0에 근접하였다. 그러므로 본 실험에서는 흡광도값 0이 나타나는 때를 첨가한 페놀의 분해완료시점으로 판단하였다.

Fig. 1. 4-aminoantipyrine methods standard curve by phenolconcentration.

결과 및 고찰

실험 균주의 분리 동정

활성 슬러지 에서 총 177균주를 순수 분리 하였다. 순수 분리한 균주들 중 실험을 통해 500 ppm의 페놀을 유일탄소원으로 첨가한 배지에서 생육이 가능한 실험 균주 DWB-1-8을 선별 하였다. 실험 균주의 colony는 원형의 불투명한 흰색 빛깔을 띄며 주변부에 투명대를 갖는 형태이다. 실험 균주의 16SrRNA 염기서열을 EzBioCloud의 데이터베이스와 비교한 결과, Comamonas testosteroni ATCC11996과 100.0%유사도를 보였으며, NCBI BLAST의 데이터베이스와 비교한 결과, Comamonas testosteroni P19와 100.0%유사도를 보였다.

페놀 농도별 균체 생육도

최소 배지1에 페놀을 500 ppm단위로 2,000 ppm까지 넣은배지를 이용하여 6일간 실험 균주를 배양하였을 때 결과는 Table 1과 같았다. 페놀 농도가 500 ppm 이하일때는 페놀을 유일탄소원으로 균체 생육이 가능하고 페놀 분해가 가능했지만, 1,000 ppm 이상의 농도에서는 균체 생육이 불가능하였다.

Table 1. effect of phenol concentration in minimal medium 1 for 6 days

최적 페놀 분해 조건

질소원에 따른 페놀 분해효율을 조사하기 위하여 최소 배지1의 질소원인 (NH₄)₂SO₄ 0.05%대신 질소원을 첨가하지 않은배지와 (NH₄)₂SO₄, KNO₃, NH₄NO₃를 각각 0.1%씩 넣은 배지를 이용하여 배양한 결과는 Fig. 3와 같았다. 질소원을 첨가하지않은 경우, 균체는 자라지 않았으므로 균체 생육에 질소원은 필수요소임을 알 수 있었다(Fig. 2). NH4NO3를 첨가한 배지에서 가장 단기간에 페놀 분해가 완료되는 것을 확인하였다.이후 실험은 최소 배지1에서 질소원을 (NH₄)₂SO₄ 0.05%대신NH₄NO₃ 0.1%로 바꾼 최소 배지2를 이용하였다.

Fig. 2. Cell growth and phenol degradation without N source.The test strain did not grow without N source.ABCFig. 3. Effect of N source.

Fig. 3. Effect of N source. Completion time of 500 ppm phenol degradation and cell growth by (NH4)2SO4 (A), KNO3 (B), NH4NO3 (C). Phenol degradation was fastest when NH4NO3 was added as the N source.

최소 배지2에 들어있는 K₂HPO₄와 NaH₂PO₄의 균체 생육과페놀 분해를 위한 최적 농도는 각각 0.7%, 0.6%인 것으로 확인되었다(Fig. 4, Fig. 5).

Fig. 4. Effect of K2HPO4 on cell growth and phenol degradation. Cultivate for 3 days (A) and 6 days (B).

Fig. 5. Effect of NaH2PO4 on cell growth and phenol degradation. Cultivate for 3 days (A) and 6 days (B).

초기 pH를 4-10으로 조절한 배지를 이용하여 30℃ 180 rpm으로 96시간 동안 배양한 결과 pH 6-9의 중성영역에서 생장이가능하였으며, pH 7에서 가장 빠른 생장과 페놀분해양상을보였다. pH 5이하의 산성이나 pH 10이상의 염기성에서는 생장이 불가능 하였다(Fig. 6).

Fig. 6. Effect of pH on cell growth and phenol degradation. Cultivate for 96 hr.

최소 배지에 기타무기염을 첨가하여 균체생육도와 페놀분해유무를 배양 3일째에 측정한 결과는 Table 2에서 보는 것과같았다. 기타무기염을 비 첨가한 대조군과 비교하였을 때, 기타무기염을 미량 첨가하였을 때 균체의 빠른 생육이 가능 하였다. 특히 FeSO₄ 7H₂O 0.001%를 첨가하였을 때 분명하게 증가하였으며, 4-aminoantipyrine method를 통하여 500 ppm 페놀의 분해가 완료됨을 확인할 수 있었다.

Table 2. Effect of additional inorganic salt on cell growth and phenol degradation for 3 days

배양 온도에 따른 균체 생육을 조사하기위해 25-37℃에서배양한 결과는 Fig. 7에서 보는 바와 같았다. 25-30℃에서 배양하였을 때 균체 생육이 가능하였고, 30℃에서 가장 잘 배양되었으며 500 ppm의 페놀 분해 완료 시점 역시 30℃에서 가장빨랐다. 반면 37℃에서는 균체 생육이 일어나지 않음을 알 수있었다.

Fig. 7. Effect of temperature on cell growth. After 10 days, 500 ppm phenol was completely degraded at 30℃. But that was incompletely degraded at 25℃.

페놀 외 기질 특이성

Benzene, toluene 및 xylene 등 페놀 이외의 유해성 탄화수소화합물을 유일탄소원으로 생장가능한지를 조사하기 위하여 실험한 결과는 Table 3와 같았다. 본 실험 균주는 석유화학공업 및 합성섬유의 주요 원료로 쓰이는 방향족 화합물 3종으로 잘 알려져 있는 benzene, toluene, xylene (BTX) [12]을 유일탄소원으로 하였을 때 흡광도 값의 상승을 보였고, 특히 benzene에서 생육이 양호하였다. Chloroform, 1,4-dioxane, hexane 에서는 생육하지 못하였다. 따라서 본 실험 균주는 페놀이외의 다른 탄화수소화합물을 함유한 폐수의 정화 등에도 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Table 3. Substrate specificity of Comamonas testosteroni DWB-1-8 in minimal medium 2

Comamonas testosteroni는 그람 음성의 호기성 토양 세균으로 알려져 있다[2]. 실험 균주 DWB-1-8의 현장 적용에 관련한연구가 수행된다면 폐수처리장의 생물학적 처리과정의 효율성을 증가시킬 수 있고 페놀에 의한 토양 오염시 생물학적방제에 이용할 수 있을 것으로 판단된다.

감사의 글

본 연구는 정부(환경부)의 재원으로 국립생물자원관의 지원을 받아 수행하였습니다(NIBR201919102).