Steap4에 의한 지방세포분화 촉진 기전

Steap4 Stimulates Adipocyte Differentiation through Activation of Mitotic Clonal Expansion and Regulation of Early Adipogenic Factors

Abstract

Six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4 (Steap4)는 철과 구리를 환원하여 철과 구리의 세포내 유입에 관여하는 금속 환원효소로, 구리 철의 항상성 뿐만 아니라 염증, 포도당 대사, 지질 대사에도 중요한 역할을 한다. 최근에 Steap4가 지방세포의 분화를 촉진한다는 보고가 발표되었으나, 이에 관련된 분자적 기전에 대해서는 알려지지 않았다. 그래서, 본 연구에서는 Steap4에 의한 지방세포분화 촉진에 관련된 기전을 연구하였다. 이를 위해 3T3-L1 백색지방세포, 불멸화된 갈색지방세포(iBA) 및 생쥐의 배아 섬유아 세포인 C3H10T1/3 세포에서 Steap4을 감소시킨 후 지방세포분화 초기단계에 관련된 신호들을 분석하였다. Steap4을 shRNA로 감소시켰을 때 지방세포분화 초기 단계에서 3종류 지방세포의 세포 증식이 억제되었으며, 세포주기 관련 단백질인 cyclin A, cyclin D 그리고 cdk2의 발현은 감소하는 반면 세포주기 저해 단백질인 p21과 p27의 발현은 증가하였다. 또한 세포주기 관련 신호인 p38, ERK 그리고 Akt의 활성화는 억제되었다. 한편 지방세포분화 초기 단계에 관여하는 지방세포분화 전사인자들을 분석하였을 때, Steap4의 감소는 지방세포분화 활성 전사 인자인 C/EBPβ, KLF4의 발현을 저해하는 반면, 지방세포분화 억제 전사 인자인 KLF2, KLF3 그리고 GATA2의 발현은 증가시켰다. 또한 Steap4의 과발현은 C/EBPβ promoter에 존재하는 전사억제 히스톤 표지자인 H3K9me2과 H3K27me3을 감소시켰다. 따라서, 이상의 결과를 종합하면 Steap4는 지방세포분화 초기단계인 mitotic clonal expansion을 촉진하고 지방세포분화 전사인자들의 발현을 조절함으로써, 지방세포분화를 촉진시킴을 알 수 있었다.

The six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4 (Steap4) is a metalloreductase that plays a role in intracellular iron and cupper homeostasis, inflammatory response, and glucose and lipid metabolism. Previously, Steap4 has been reported to stimulate adipocyte differentiation; however, the underlying mechanisms of this action remain unexplored. In the present study, we investigated the molecular mechanisms involved in Steap4-induced adipocyte differentiation using 3T3-L1 cells, immortalized brown adipocyte (iBA) cells, and mouse embryonic fibroblast C3H10T1/2 cells. The knockdown of Steap4 using adenovirus-containing shRNA attenuated mitotic clonal expansion (MCE), as evidenced by the impaired proliferation of 3T3-L1 cells, iBA cells, and C3H10T1/2 cells within 48 hr after adding the differentiation medium. Steap4 knockdown downregulated G1/S phase transition-related cell cycle regulators (including cyclin A and cyclin D) and upregulated cell cycle inhibitors (including p21 and p27). Furthermore, Steap4 knockdown inhibited the phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase, extracellular signal-regulated kinase, and Akt. Moreover, Steap4 knockdown repressed the expression of early adipogenic activators, such as CCAAT-enhancer-binding protein β (C/EBPβ) and Kruppel-like factor family factor 4 (KLF4). On the other hand, Steap4 knockdown stimulated the expression of adipogenic inhibitors, including KLF2, KLF3, and GATA2. The overexpression of Steap4 using an adenovirus removed the repressive histone marks H3K9me2 and H3K9me3 on the promoter of C/EBPβ. These results indicate that Stepa4 stimulates adipocyte differentiation through the induction of MCE and the modulation of early adipogenic transcription factors, including C/EBPβ, during the early phase of adipocyte differentiation.

서론

지방세포분화(adipocyte differentiation, 또는 adipogenesis)는 전사인자(transcription factor), 신호 단백질 인산화 효소(signaling kinase), 수용체(receptor) 및 지방대사효소(lipid metabolic enzyme) 등과 같은 여러 가지 조절인자들에 의해 조절된다[8]. 지방세포분화의 분자기 전과 진행 과정은 잘 규명되었는데, 지방세포분화 과정은 두 단계로 나누어진다 [10]. 첫 번째 단계는 분화 시작 후 2일까지의 과정으로 초기단계(early adipogenesis phase)라고 하며, 두 번째 단계는 분화 후 3일부터 7일까지의 과정으로 후기 단계(late adipogenesis phase)라 고 한다. 초기단계에서는 분화 배지를 첨가하면 세포 증식이 정지된 지방전구세포들(preadipocytes)이 동시에 다시 세포주기(cell cycle) 단계로 들어가 2회 세포주기 과정(two rounds of cell cycle)을 거쳐 세포가 증식하는데, 이 과정을 mitotic clonal expansion(MCE)이라고 한다 [10].

MCE 단계는 성숙한 지방세포로 분화되는 후기 분화 단계를 위해서 매우 중요한 과정인데, MCE 과정은 p38 mitogen- activated protein kinase (MAPK)과 extracellular signal-regu- lated kinase (ERK)와 같은 MAPK가 중요한 역할을 담당한다[1]. 또한 세포주기 단백질인 사이클린(cyclin)과 사이클린 의존적인 단백질 인산화 효소(cyclin dependent protein kinase, CDK)가 세포분열 주기를 조절함으로써 MCE 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다 [10]. 이와 같은 신호물질들에 의해 활성화되는 MCE는 지방세포의 분화를 후기 단계로 진입하게 하여, 지방세포의 형성에 필수적인 유전자들 즉, fatty acid bind- ing protein 2 (aP2), fatty acid synthase (FAS), fatty acid translocase/cluster of differentiation 36 (FAT/CD36), stearo- yl-CoA desaturase 1 (SCD1) 등의 지방대사 관련 유전자들의 발현을 촉진함으로써 지방세포의 분화가 이루어지게 한다[3].

또한 지방세포의 분화는 지방조직 특이적 전사인자(adi- pose tissue specific transcription factor)들에 의해 조절되는데[3], 이들 전사 인자들 중 peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), CCAAT-enhancer-binding protein α (C/ EBPα), C/EBPβ, C/EBPδ 그리고 sterol regulatory element- binding proteins 1 (SERBP1c) 등이 핵심적인 전사인자들로 작용한다[3]. 특히 C/EBP β 와 C/EBPδ는 분화의 초기 단계 즉 MCE 과정에서 유도되어 세포 주기에 관련된 유전자와 PPAR γ나 C/EBP α 와 같이 분화 후 기 단계에서 지방세포분화에 필수적인 유전자들의 발현을 유도하는 전사인자들의 발현을 증가시킴으로써 지방세포분화를 촉진하는 전사인자로 알려져 있다 [3]. 특히 C/EBPβ와 C/EBPδ는 분화의 초기단계 즉 MCE 과정에서 유도되어 세포 주기에 관련된 유전자와 PPARγ나 C/EBPα와 같이 분화 후 기 단계에서 지방세포 분화에 필수적인 유전자들의 발현을 유도하는 전사인자들의 발현을 증가시킴으로써 지방세포 분화를 촉진하는 전사인자로 알려져 있다[3].

Six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4 (Steap4, 또는 stamp2라고도 함)는 TNFα-에 의해 유도되는 지방조직 유래의 단백질로서, 세포 외부의 Fe⁺³과 Cu⁺²을 각각 Fe⁺²와 Cu⁺¹로 환원 시켜 Fe⁺²와 Cu⁺¹을 세포 내로 이동시키는 역할을 하는 금속 환원 효소(metalloreductase)로 알려졌다[9]. Steap4는 염증 신호에 의해 유도되어 염증과 관련한 세포 손상 (inflammation-mediated cellular damage)을 보호하는 역할을 하는데, Steap4가 부족하게 되면 대식세포(macrophage)나 지방세포에서 염증 반응이 과도하게 증가됨이 보고되었다 [5,11]. 따라서, 이전에는 Steap4가 세포내 철, 구리의 항상성과 염증 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌으나, 최근의 연구에 의하면 Steap4는 지방산이나 포도당과 같은 영양소 등에 반응하여, 포도당 대사와 지방 대사에도 중요한 역할 하는 것으로 알려져 있다[5]. 즉 Steap4는 인슐린 민감성(insulin sensi- tivity)을 증대시키고 포도당 유입(glucose uptake)과 미토콘드리아 기능을 촉진하는 역할을 한다 [2,4]. 따라서, Steap4의 결핍(knockdown)은 인슐린저항성(insulin resistance), 포도당 불내성(glucose intolerance), 고혈당(hyperglycemia), 이상지질혈증(dyslipidemia), 동맥경화(atherosclerosis) 그리고 지방간(fatty liver) 같은 대사성질환(metabolic disorder)을 유발한다 [2, 4, 5]. 또한 이전의 보고에 따르면 Steap4는 3T3-L1 지방세포의 분화를 촉진함이 보고되었으나[6], 정확한 분자적 기전은 규명되지 않았다.

따라서, 본 연구에서는 Steap4에 의한 지방세포분화 촉진에 관련된 분자기전을 백색지방세포인 3T3-L1 세, 불멸화된 갈색지방세포(immortalized brown adipocyte, iBA) 그리고 생쥐 배아 섬유아 세포인(mouse embryonic fibroblast) C3H10T1/ 2 세포를 이용하여 규명하였다. 이를 위해 Steap4를 knock- down 시킨 3종류의 지방세포에서 지방세포분화 초기 단계인 MCE 과정과 분화 초기단계에서 유도되는 여러 종류의 전사인자들에 대한 영향을 살펴보았다.

그 결과 Steap4는 지방세포의 초기 단계인 MCE 과정을 촉진하고 또한 C/EBPβ, Kruppel-like factor family factor (KFF) 2, 3, 4와 GATA2와 같은 지방세포분화 초기단계에 관여하는 전사인자들의 발현을 조절함으로써 지방세포의 분화를 촉진하였다.

재료 및 방법

시약

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bo- vine serum (FBS), fetal calf serum (FCS)은 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. pp38, p-ERK, p-AKT의 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, PPARγ, C/EBPα, cyclin A, cyclin D, cdk2, p21, p27 그리고 actin의 항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하였고 H3K9me2, H3K27me3의 항체는 Millipore (Medford,  MA, USA) 에서 구입하였다. 중성지방(triglycer- ide, TG)의 측정을 위한 시약은 Asan Pharmaceutical Co., Ltd. (Seoul, South Korea)에서 구입하였다. 또한 Steap4의 knock- down을 위한 렌티바이러스 유래의 Steap4 shRNA (lentivirus Steap4 shRNA)는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)으로부터 구입하였으며, Steap4 과발현을 위한 재조합 아데노연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV8- Steap4)은 Vector-biolab (Malvern, PA, USA)에서 구입하였다.

지방세포배양 및 분화

3T3-L1 세포와 C3H10T1/2 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였으며, 불멸화된 갈색지방세포(immortalized brown adipocytes, iBA)는 Dr. Ge (National Institute of Health; Bethesda, MD, USA)로부터 제공받았다. 3T3-L1 세포, 불멸화된 iBA 세포는 10% FCS가 포함된 DMEM 배지에서, C3H10T1/2 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 지에서 배양하였다. 3T3-L1 세포의 분화를 위해서는 10% FBS, 10 µM dexamethasone, 0.5 mM 3-iso- butyl-1-methylxanthine (IBMX), 그리고 2 μg/ml insulin이 포함된 DMEM 분화 배지를 첨가하여 2일 동안 배양한 후 10% FBS와 5 mg/ml of insulin이 포함된 DMEM 배지에서 7일 동안 배양하였다. 또한 불멸화된 갈색지방세포와 C3H10T1/2 세포의 분화를 위해서는 10% FBS, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX, 0.125 mM indomethacin, 2 μg/ml insulin 그리고 1 nM T3이 포함된 DMEM 배지에서 2일 동안 배양한 후 in- sulin 과 T3가 포함된 DMEM 배지에서 7일 동안 배양하였다.

Oil red O (ORO) 염색

분화가 끝난 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)로 3회 세척한 후 10% formalin으로 30분 동안 고정하였다. 고정액을 버린 후 PBS로 3회 세척을 하고 oil red O (ORO) 염색 시약으로 분주하여 실온에서 10분 동안 반응하였다. ORO 염색 시약을 제거한 다음 PBS로 3번 세척한 후, 염색된 세포를 관찰하였다.

세포 증식(cell proliferation) 분석

세포 증식의 변화를 관찰하기 위하여 cell counting 기법을 이용하였다. 12 well cell culture cell plate에 1×10⁵ cells/well로 세포를 분주하고 48시간 부착시킨 다음, 분화 배지를 첨가한 후 0시간, 12시간, 24시간, 48시간에서 지방세포를 수거하여 세포의 수를 측정하였다.

RNA 분리 및 real-time PCR 분석

Total RNA는 TRIzol® (Ambion Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분리하였으며, 분리한 2 μg total RNA로부터 TOPscript^TM RT DryMIX (Enzynomics, Daejeon, South Korea)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. Real time PCR 분석은 SYBR Green master mixture을 사용하여 분석하였고, 사용한 primer들의 염기 순서는 Table1에 나타내었다.

Table 1. Sequence of the primers used for Real-time PCR

Western blot 분석

세포 내 단백질 발현 변화를 관찰하기 위하여 SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다. 반응을 끝낸 세포를 PBS로 세척한 후 세포 용해액(Pro-prep^TM protein extraction solution, Intron Biotechnology, Seongnam, Suth Korea)을 넣고 30분 동안 얼음 위에서 반응 용해시킨 후 13, 000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 회수하고, Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 단백질의 농도를 정량하였다. 20 μg의 단백질을 SDS-PAGE gel에 전개(running)하였고, gel에서 단백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 막을 blocking 용액(TBS, 0.1% Tween 20, 5% skim milk)으로 실온에서 30분 동안 교반한 후 Steap4, PPARγ, C/EBPα, cyclin A, cyclin D, cdk2, p21, p27, p-p38, p-ERK, p-Akt 그리고 β- actin 항체를 1:1, 000으로 희석 하여 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 다음 TBS/T 완충액으로 3번 세척하고, 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시킨 후 TBS/T로 세척하였다. 단백질은 화학 형광 현상 시약(ECL Advance, GE Healthcare, Hatfield, UK)로 시각화하였다.

Chromatin Immunoprecipitation PCR (ChIP-PCR) 분석

ChIP 분석을 위해 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit (Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 DNA을 추출하였다. 아데노연관 바이러스 Steap4을 감염 시켜 steap4의 과발현을 유도한 iBA 세포와 C3H10 세포에 1% formaldehyde가 되도록 처리하여 37℃에 10분 동안 반응하여 DNA-단백질을 cross-linking 시킨 다음 1 mM PMSF, protease inhibitors가 포함된 차가운 PBS로 2번 세척 후, SDS Lysis buf- fer (1mM PMSF, protease inhibitors 포함)로 용해한 다음 초음파폐쇄기(sonicator)를 이용하여 DNA가닥을 200-1, 000 bp 단위로 절단(shearing)하였다. 비특이적 IgG, Steap4, H3K9me2, H3K27me3 항체를 이용하여 면역 침강한 다음 DNA만 추출하였다. 추출한 DNA는 C/EBPβ promoter 염기서열을 포함하는 primer (forward: CATGGCCTATTGAGCA AAGAACC, reverse: ACCTCATCACAGAGCTTGGC)를 이용하여 real time PCR으로 분석하였다.

통계분석

모든 실험 결과들은 평균과 표준편차로 나타내고, 유의성 검증을 위하여 student’s t-test로 검정하였으며, 통계적 유의적 차이는 p<0.05으로 결정하였다.

결과 및 고찰

Steap4에 의한 지방세포 분화 영향

teap4가 지방세포분화와 관련이 있는지를 알기 위해 3T3- L1 지방전구세포(preadipocytes)가 지방세포로 분화하는 동안 Steap4의 발현을 측정하였다. 이를 위해 3T3-L1 지방전구세포에 분화 배지를 첨가한 후 2일, 4일에서 Steap4의 발현을 western blot으로 측정하였다. Steap4 발현은 지방 전구세포에서는 발현이 되지 않다가 분화 배지를 첨가한 후 2일부터 발현이 증가하였다 (Fig. 1A).

다음은 Steap4가 지방세포의 분화에 직접적으로 영향을 미치는지를 살펴보기 위해, Steap4을 knockdown 시킨 3T3-L1 전구세포에서 지방세포의 분화 정도를 측정하였다. Steap4을 knockdown 시키기 위해서는 lentivirus shRNA를 시용하였으며, Steap4 shRNA를 3T3-L1 백색지방전구세포에에 infection하고 분화시킨 후 분화 정도를 ORO 염색으로 분석하였다. 먼저 shRNA에 의해 Steap4가 감소되었는지를 확인하기 위해, western blot과 qPCR으로 분석하였는데, Steap4는 shRNA에 의해 효과적으로 감소되었다 (Fig. 1B). ORO 염색의 결과에 의하면, Steap4가 knockdown 되면 3T3-L1 백색지방전구세포의 분화가 저해됨을 확인할 수 있었으며 (Fig. 1C), 이와 같은 결과는 지방세포분화 표지자들인 PPARγ, C/EBPα의 발현도 Steap4의 감소에 의해 저해되었다 (Fig. 1D). 반대로 Steap4을 과발현시켰을 때 3T3-L1 전구세포의 분화를 측정하였다. 먼저 Steap4을 과발현시키기 위해 아데노연관 바이러스(AAV8)을 이용하였는데, Fig. 1E에서 보는 바와 같이 Steap4가 과발현됨을 확인하였으며, Steap4의 과발현에 의해 3T3-L1 전구세포의 분화가 증가함을 ORO 염색과 PPARγ, C/EBPα의 발현을 측정함으로써 확인하였다 (Fig. 1E). 이상의 결과들에 따르면, Steap4는 지방세포의 분화를 촉진함을 알 수 있었다.

Fig. 1. Knockdown of Steap4 inhibited adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes. (A) The 3T3-L1 preadipocytes were differentiated in the differentiation medium. The expression of Steap4 was determined by Western blot analysis at indicated day. (B-D) The 3T3-L1 preadipocytes were infected with lentivirus shRNA against Steap4 or shGFP as a control, and differentiated in differentiation medium for 7 days. The expression of Steap4 was determined by Wesern blotting and qPCR (B). ORO staining (C). The expression of PPARγ and C/EBPα was determined by western blotting and qPCR (D). Con means control shGFP. (E) The 3T3-L1 preadipocytes were infected with AAV8-Steap4 or AAV8-GFP as a control and differentiated in differ- entiation medium for 7 days. The expression of Steap4 was determined by Western blotting and qPCR. The differentiation was examined with ORO staining. The expression of PPARγ and C/EBPα was determined by qPCR. Con means control AAV8-GFP.

지방세포 분화 초기 단계에서 Steap4 knockdown에 따른 세포 증식과 세포주기 유전자 변화 분석

앞서 설명하였듯이, 지방세포의 분화는 두 단계로 구분할 수 있는데, 즉 분화 배지를 첨가한 후 2일째까지를 분화 초기단계(early phase)라고 하며, 그 이후 2일째부터 7일째까지를 분화 후기단계(late phase)라고 한다. 분화 초기단계에서는 세포 증식이 정지된 지방 전구세포(preadipocytes)에 분화 배지를 첨가하면 다시 세포의 증식이 유도되는 단계로 이를 MCE 과정이라고 한다 [10]. 따라서 Steap4가 MCE 과정에 영향을 미쳐 지방세포의 분화를 촉진하는지를 규명하기 위해, Steap4을 knockdown 시킨 3T3-L1 세포, 불멸화된 갈색지방세포 (iBA), 그리고 C3H10T1/2 세포에서 분화 배지를 첨가한 후 2일 동안 지방세포의 증식을 측정하였다. 그 결과, Fig. 2A에서 보이듯이 3종류의 지방세포 모두에서 분화 배지를 첨가하면 세포의 증식이 증가하지만, Steap4를 감소시킨 지방세포에서는 세포 증식이 감소하였다 (Fig. 2A). 이와 같은 결과는 Steap4가 MCE 과정에서 지방세포의 세포 증식을 촉진하여 지방세포의 분화를 증가시킴을 알 수 있었다.

다음은 MCE 과정 동안 Steap4가 세포주기 과정에 영향을 끼쳐 세포의 증식을 촉진하는지를 알기 위해, 세포 주기 조절 인자(cell cycle regulatory)인 사이클린(cyclin)과 사이클린 의존적 단백질 인산화 효소(cyclin-dependent protein kinase, CDK)를 Steap4를 knockdown 시킨 3종류의 지방세포에서 분석하였다. Fig. 2B에서 보이듯이 Steap4을 knockdown 시킨 3종류의 지방세포에서 세포주기 촉진 인자인 cyclin A, cyclin D2, 그리고 cdk2의 발현이 감소하고, 세포기 억제 인자인 p21과 p27의 발현은 증가하였다 (Fig. 2B). 이상의 결과에 따르면, Steap4는 MCE 과정에서 cyclin A, cyclin D, cdk2의 발현을 증가시키고, p21과 p27의 발현을 억제하여 지방 전구세포의 세포 증식을 촉진함으로써 지방세포의 분화를 증가시킴을 알 수 있었다.

Fig. 2. Knockdown of Steap4 decreased the proliferation of 3T3-L1, iBA and C3H10T1/2 cells during mitotic clonal expansion during early adipogenesis. 3T3-L1 preadipocytes, iBA preadipocyte and C3H10T1/2 cells were infected with lentivirus Steap4 shRNA or shGFP and differentiated in the differentiation medium for indicated times. (A) Cell numbers were measured at indicated times. Data are presented as the mean±SD from three independent experiments. *p<0.05vs. control shGFP (B) The protein levels of cyclin A, cyclin D2, cdk2, p21, and p27 were assessed by Western blotting. Con means control shGFP.

특히 cyclin A와 cyclin D는 각각 cdk2와 cdk4와 결합하여 세포주기 G1 단계에서 S 단계로 진행시키는 세포 주기 조절 인자이고, p21과 p27은 cdk4와 cdk2을 저해하는 세포 주기 억제 인자이므로[10], Steap4가 cyclin A, cyclin D, 그리고 cdk2의 발현은 증가시키는 반면 p21과 p27의 발현은 감소시킨다는 결과는 Steap4가 MCE 과정에서 G1 단계에서 S 단계로의 세포주기를 촉진함으로써 지방세포의 증식을 증가시키고, 이로 인해 지방세포의 분화가 촉진될 것으로 판단하였다.

지방세포 분화 초기 단계에서 Steap4 knockdown에 따른 세포 증식 관련 신호 분석

MAPKs과 PI3K/Akt 신호 기전은 세포증식(cell prolifera- tion), 세포 생존(cell survival) 그리고 세포의 분화(cell differ- entiation) 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [2]. 따라서, MCE 과정에서 Steap4에 의해 지방세포의 세포 증식이 촉진되는 것에 관련된 기전을 더 규명하기 위해, Steap4가 knockdown 된 3종류의 지방 전구세포에서 분화 배지 첨가 후 48시간에서 MAPK과 Akt의 신호즉인산화 형태(phosphory- lated form)를 분석하였다. Fig. 3에서 이듯이, Steap4가 감소된 3종류의 지방세포 모두에서 p38, ERK, 그리고 Akt의 인산화가 감소함을 확인하였다 (Fig. 3). 이와 같은 결과는 Steap4가 MCE 과정 중에 세포 증식과 관련 MAPK인 p-38과 ERK 그리고 PI3K/Akt의 신호를 증가시킴으로써 지방세포의 분화를 촉진할 것으로 판단되었다.

Fig. 3. Knockdown of Steap4 inhibited phosphoryla-tion of p38, ERK, and Akt during early adipogenesis. The 3T3-L1 preadipocytes, iBA preadipocyte and C3H10T1/2 cells were in- fected with lentivirus Steap4 shRNA or shGFP, and differentiated in the differentiation me- dium for indicated times. The levels of phos- phorylated p38, ERK, and Akt were analyzed by western blotting. Con means control shGFP.

지방세포 분화 초기 단계에서 Steap4 knockdown에 따른 지방세포 분화 관련 전사인자들의 변화 분석

지방세포의 분화는 분화 초기단계 및 후기단계에서 연속적으로 유도되는 전사인자들에 의하여 조절된다[1]. Steap4에 의한 지방세포분화 촉진에 관련된 분자기전을 더 규명하기 위하여, Steap4가 knockdown 된 3종류의 지방세포에서 분화 배지 첨가 후 48시간에서 분화 초기 단계에서 유도되는 전사인자들의 발현을 측정하였다. Steap4가 knockdown 된 3종류의 지방세포 모두에서 지방세포분화를 촉진하는 전사인자인 C/EBP β, KLF4의 발현은 감소하는 반면, 분화를 억제하는 전사인자인 KLF2, KLF3, 그리고 GATA2의 발현은 증가하였다 (Fig. 4). 이와 같은 결과는 Steap4가 지방세포분화 초기단계에서 유도되어 분화를 촉진하는 전사인자로 알려진 C/EBPβ, KLF4의 발현은 증가시키는 반면 KLF2, KLF3, 그리고 GATA2와 같이 분화를 저해하는 전사인자들의 발현은 감소시킴으로써 지방세포의 분화를 촉진할 것으로 판단되었다.

특히, Steap4는 Fig. 4에서 확인하였듯이 지방세포 분화 초기 단계에서 C/EBPβ의 발현을 증가시키는데, C/EBPβ는 지방세포 분화 초기 단계에서 유도되어 MCE 과정 동안 세포주 기 관련 유전자들의 발현을 촉진하고 또한 분화 후 기 단계에서 중요한 역할을 하는 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 증가시킴으로써, 지방세포 분화를 촉진하는 역할을 하는 중요한 전사인자이다 [3]. 따라서 Steap4가 어떻게 C/EBPβ의 발현을 증가시키는지에 대하여 규명하였다. Steap4는 Fe⁺³을 Fe⁺²로 환원하여 Fe⁺²를 세포 내로 이동시키는 역할을 하는 효소로서[11], Fe⁺² 를 보조인자(cofactor)로 필요로 하는 주몬지(jumonji) 도메인(domain)을 가지는 히스톤 탈메틸화 효소(Jumonji-containing histone demethylase)를 활성화할 것으로 판단되었다 [7]. 그런데, 주몬지도 메인 히스톤 탈메틸화 효소들 중에서 JMJD2B와 UTX의 히스톤 탈메틸화 효소는 각각 전사를 억제하는 히스톤 표지자인 히스톤(histone) H3의 9번째 lysine (H3K9)에 2개의 메틸 그룹(H3K9me2)과 히스톤 H3의 27번째 lysine (H3K27)에 3개의 메틸 그룹(H3K27me3)을 제거하는 히스톤 탈메틸화 효소로서, 지방세포 분화에 필수적인 PPARγ와 C/EBPα의 프로모터 (promoter)에 존재하는 H3K9me2와 H3K27me3을 제거하여 이들 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 지방세포 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다 [7]. 그러므로 Steap4가 Fe⁺² 를 세포 내로 유입하여 지방세포 분화를 촉진하는 주몬지도 메인 히스톤 탈메틸화 효소를 활성화하여 C/EBPβ promoter에 존재하는 전사억제히 스톤 표지인 H3K9me2와 H3K27me3를 제거함으로써 C/EBPβ의 발현을 증가시킬 것으로 판단하였다.

Fig. 4. Steap4 regulated expression of early adipogenic transcription factors during early adipogenesis. The 3T3-L1 preadipocytes, iBA preadipocyte and C3H10T1/2 cells were infected with lentivirus Steap4 shRNA or shGFP , and differentiated in the differentiation medium for 2 days. mRNA levels of early adipogenic transcription factors including C/EBPβ, KLF2, KLF3, KLF4, and GATA2 in 3T3-L1 cells were determined by qPCR. (A) 3T3-L1 cells (B) iBA cells (C) C3H10T1/2 cells. Data are presented as the mean±SD from three independent experiments. *p<0.05 vs. control shGFP (Con).

이를 증명하기 위해 Steap4을 과 발현(overexpression) 시킨 지방세포에서 C/EBPβ유전자 promoter에 존재하는 H3K9me2와 H3K27me3을 ChIP-PCR로 분석하였다. 먼저 Steap4 과 발현시키기 위해 아데노연관 바이러스(AAV8)을 이용하였으며, 지방세포는 불멸화 갈색지방세포(iBA)와 C3H10T1/2세포를 사용하였다. Fig. 5에서와 같이 ChIP-PCR 분석 결과에 따르면, Steap4를 과발현시키면 C/EBPβ의 promoter로 Steap4의 동원(recruitment)은 증가하는 반면, H3K9me2와 H3K27me3의 양은 현저히 감소하였다 (Fig. 5A, Fig. 5B). 이와 같은 결과는 Steap4가 전사를 억제하는 히스톤 표지인 H3K9me2와 H3K27me3을 탈메틸화하는 주몬지도 메인 히스톤 탈메틸화 효소를 활성화하여 C/EBPβ의 promoter 지역에 존재하는 H3K9me2와 H3K27me3을 제거함으로써 C/EBPβ의 발현을 증가시킬 것으로 판단되었다.

Fig. 5. Steap4 reduced the enrichment of H3K9me2 and H3K27me3 in the promoter of C/EBPβ. The iBA and C3H10T1/2 cells were infected with AAV8-Steap4 or AAV8-GFP as a control. The recruitment of Steap4 to the C/EBPβ promoter was analyzed by ChIP-qPCR (left). The enrichment of H3K9me2 (middle) and H3K27me3 (left) in the C/EBPβ promoter was analyzed by ChIP-qPCR. (A) iBA cells (B) C3H10T1/2 cells. Data are presented as the mean ± SD from three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 vs. control AAV8-GFP (Con).

이상의 결과를 종합하면, Steap4는 지방세포분화 초기단계에서 MCE 과정을 촉진하고 또한 분화 초기단계에서 유도되는 지방세포분화 관련 전사인자들의 발현을 조절함으로써, 지방세포의 분화를 촉진함을 알 수 있었다.

감사의 글

이 과제는 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연구되었음.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.