Characterization of Agarase from a Marine Bacterium Agarivorans sp. BK-1

해양세균 Agarivorans sp. BK-1의 분리 및 β-아가라제의 특성 규명

Abstract

The purpose of this study was to isolate an agar-degrading marine bacterium and characterize its agarase. Bacterium BK-1, from Gwanganri Beach at Busan, Korea, was isolated on Marine 2216 agar medium and identified as Agarivorans sp. BK-1 by 16S rRNA gene sequencing. The extracellular agarase, characterized after dialysis of culture broth, showed maximum activity at pH 6.0 and $50^{\circ}C$ in 20 mM Tris-HCl buffer. Relative activities at 20, 30, 40, 50, 60, and $70^{\circ}C$ were 67, 93, 97, 100, 58, and 52%, respectively. Relative activities at pH 5, 6, 7, and 8 were 59, 100, 95, and 91%, respectively. More than 90% of the activity remained after a 2 hr exposure to 20, 30, or $40^{\circ}C$; about 60% of the activity remained after a 2 hr exposure to $50^{\circ}C$. Almost all activity was lost after exposure to 60 or $70^{\circ}C$ for 30 min. Zymography revealed three agarases with molecular weights of 110, 90, and 55 kDa. Agarose was degraded to neoagarobiose (46.8%), neoagarotetraose (39.7%), and neoagarohexaose (13.5%), confirming the agarase of Agarivorans sp. BK-1 as a ${\beta}$-agarase. The neoagarooligosaccharides generated by this agarase could be used for moisturizing, bacterial growth inhibition, skin whitening, food treatments, cosmetics, and delaying starch degradation.

본 연구에서는 agarose를 분해하는 세균을 분리하고 한천분해효소의 특성을 조사하였다. 한천분해세균인 BK-1은 부산광역시 수영구 광안리해수욕장에서 채취한 바닷물-시료에서 Marine agar 2216 평판배지를 이용하여 분리하였다. 분리된 균은 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통해 Agarivorans sp. BK-1으로 명명하였다. 세포 외 agarase는 Agarivorans sp. BK-1 균주 배양액에서 획득하였으며, 이를 이용하여 효소의 특성을 조사하였다. Agarivorans sp. BK-1 균주의 한천분해효소는 20, 30, 40, 50, 60 및 $70^{\circ}C$에서 각각 67, 93, 97, 100, 58, 52%의 상대활성을 나타냈으며, pH 5, 6, 7, 8에서는 59, 100, 95, 91%의 활성을 나타내었다. 세포 외 agarase는 $50^{\circ}C$에서 pH 6.0인 20 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였을 때 최대의 활성을 보였다. 이 agarase는 20, 30, $40^{\circ}C$에서 2시간 동안 열처리하여도 90% 이상의 잔존활성을 보였다. 또한, $50^{\circ}C$에서 2시간 동안 노출된 후에도 56%의 잔존활성을 보였다. 60과 $70^{\circ}C$에서 30분 동안 노출된 후에는 효소활성 대부분이 사라졌다. Zymogram 분석을 통하여 Agarivorans sp. BK-1 균주가 약 110, 90, 55 kDa 크기의 한천분해효소들을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. TLC 분석 결과, Agarivorans sp. BK-1 균주의 한천분해효소는 네오한천올리고당인 neoagarobiose (46.8%), neoagarotetraose (39.7%) 및 neoagarohexaose (13.5%)를 생성하는 것으로 보아 ${\beta}$-agarase로 확인되었다. 따라서 Agarivorans sp. BK-1가 생산하는 ${\beta}$-agarase는 보습효과, 세균성장 억제, 미백효과, 식품, 화장품 및 전분노화 방지 등의 기능을 가지는 네오한천올리고당의 생산에 유용할 것으로 판단된다.

서   론

한천(agar)은 지누아리나 우뭇가사리 등 홍조류 유래의 다당류로서 agarose와 agaropectin으로 구성되어 있다[2, 13, 15]. 3면이 바다로 둘러싸여 있는 우리나라는 제주도와 남해안에서 한천이 대량으로 생산되고 있지만 전체생산량의 약 6.5% 정도만이 가공형태로 사용되며 나머지는 대부분 방치되고 있으므로 한천의 이용가치를 증대시키면 수산 경제 발전에 기여할 수 있을 것이다[5, 14, 15]. Agarose는 한천의 약 70%를 차지하는 물질로 황산기 함량이 적고 강한 겔 형성능을 부여하는 성분이며, 구성물질인 β-D-galactose와 3,6-anhydro-α-L-galactose가 교대로 반복되는 중성 고분자로 3,6-anhydro-α-L- galactose와 β-D-galactose는 α(1→3) 결합을 하고 β-D-galactose는 다음의 3,6-anhydro-α-L-galactose와 β(1→4) 결합을 하고 있다[1]. 한천분해효소인 agarase는 agarose를 가수분해하는 효소로 α-agarase와 β-agarase로 구분된다. α-agarase는 한천의 α(1→3) 결합을 가수분해하여 agarotriose, agaropentose 등의 한천올리고당(agarooligosaccharides)을 생산하며[8], β- agarase는 한천의 β(1→4) 결합을 가수분해하여 neoagarohexaose, neoagarotetraose, neoagarobiose 등의 네오한천올리고당(neoagarooligosaccharides)을 생산한다[3, 6]. 한천올리고당과 네오한천올리고당은 고부가가치 소재로서 활용 가능성이 높으며 보고된 기능에는 항암작용, 항산화작용, 항혈액응고, 미백작용, 대식세포 활성화, 보습효과 및 노화 방지 등이 있다[7, 11, 15]. 따라서 많은 연구가 한천분해세균과 세균이 생산하는 한천분해효소에 대해 이루어져 Maribacter 속[8], Marinomonas 속[5], Pseudoalteromonas 속[17], Simiduia 속[6] 등이 보고되었다. 한편 기질은 gel 상태보다 sol 상태에서 효소의 반응이 원활한데, agar는 40℃ 이하의 온도에서는 gel 상태로 존재하므로 40℃ 이상의 온도에서 안정성과 반응성이 있는 한천분해효소를 연구개발 할 필요가 있다[15].
본 연구에서는 40℃ 이상의 온도에서 한천분해능이 있는 agarase를 탐색할 목적으로, 신규의 해양유래 미생물인 Agarivorans sp. BK-1을 국내 연안의 해수에서 분리하여 동정하였고, 분리한 미생물이 생산하는 한천분해효소의 특성을 규명하여 산업적 이용 가능성을 조사하고 생화학적 특성을 보고하고자 하였다.

재료 및 방법

한천분해 균주의 분리 및 동정
부산광역시 수영구 광안리 해수욕장에서 바닷물 시료를 채취하였으며, Marine broth 2216 (Difco, Detroit, USA) 배지에 1.5% (w/v) 한천을 첨가한 Marine agar 2216 평판배지에 시료액을 도말한 후 30℃에서 배양하면서 한천분해활성으로 Marine agar 2216 평판배지를 함몰시키는 BK-1 균주를 3차례 이상 반복 분리하여 순수분리하였다. 순수배양된 균체에 Wizard Genomic DNA isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 genomic DNA를 획득하고, 16S rDNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. PCR primer로는 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')와 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (Nucleo Gen, Siheung, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열 분석은 Bionics (Busan, Korea)에서 수행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 보고된 균주들과 유사도를 검토하였으며, Clustal 프로그램(ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.

한천분해 균주의 배양
Marine broth 2216 배지 4 ml에 순수분리한 BK-1 균주를 접종한 후 30℃, 250 rpm에서 하루 동안 진탕배양한 후, 0.2% (w/v) agar가 첨가된 Marine broth 2216배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크에 배양액을 접종하고 30℃, 250 rpm에서 3일 동안 진탕배양하였다.

배양시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 한천분해활성 측정
순수분리한 BK-1 균주를 진탕배양하면서 24시간마다 일부 배양액을 채취하여 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 한천분해 활성을 측정하였다.

조효소액의 제조 
배양액을 원심분리하여(3,000×g, 4℃, 15 min) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액 15 ml를 반투과성막(SnakeSkin Dialysis Tube, Thermo Scientific, USA)에 넣었다. 상층액이 담긴 반투과성막을 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) 완충용액 900 ml가 들어있는 비커(1,000 ml)에 넣고, 4℃의 냉장실에 2시간 정치하는 것을 2번 반복한 후 세 번째에는 12시간 이상 투석을 시행하였다. 투석이 완료된 조효소액은 membrane filter (0.45 μm, Milipore, USA)를 통과시킨 후에 4℃에서 냉장 보관하였다.

효소활성 측정
Agarase 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였다. DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의 변형법으로 환원당을 측정하는 방법이다[14]. DNS solution은 NaOH 13.2 g, 3,6-dinitrosalicylic acid 7.07 g, sodium sulfate 5.53 g, potassium tartrate (Rochelle salt) 204 g, phenol 5.07 g을 증류수에 녹여 최종 1,000 ml로 하였다. 0.2% (w/v) agarose가 포함된 완충용액을 중탕 가열한 후 반응온도 50℃까지 냉각하고 반응수조를 이용하여 온도를 유지하면서 기질용액 1.0 ml에 조효소액 0.5 ml을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다. 효소 반응액 1.0 ml에 DNS solution 3.0 ml을 첨가하여 100℃에서 10분간 가열한 후 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준적정곡선으로 D-galactose를 사용하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 1 μM galactose를 생산하는 한천분해 효소의 양을 1 unit (U)으로 나타내었다[11, 12].

반응온도에 따른 한천분해 효소의 활성측정
조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 0.2% (w/v) agarose가 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액을 이용하였다. 기질용액을 중탕 가열한 후 20-70℃의 각 온도별로 냉각한 후 효소활성을 측정하였다.

pH에 따른 한천분해 효소의 활성측정
pH에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 20 mM sodium acetate 완충용액(pH 4.0-5.0), 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 5.0-8.0), 20 mM GTA (3,3-dimethyl-glutamic acid, Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol) 완충용액(pH 8.0-9.0)을 이용하였다. 각 완충용액에 최종농도 0.2% (w/v) agarose를 첨가하고 50℃에서 효소활성을 측정하였다.

한천분해 효소의 열안정성 측정
조효소액을 이용하여 온도별 노출시간에 따른 한천분해효소의 잔존활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 0.2% (w/ v) agarose가 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액을 이용하였다. 조효소액 0.5 ml를 첨가하여 각 온도별로 0.5, 1.0, 1.5, 2.0시간 열처리한 후, 50℃에서 효소활성을 측정하였다. 측정된 효소활성은 열처리하지 않은 시료의 효소활성과 비교하였다.

한천분해효소의 zymogram
한천분해효소의 분자량을 확인하기 위하여 10% (w/v) polyacrylamide 겔에 SDS를 첨가하지 않고 0.1% (w/v) agarose (LMP, Promega, USA)를 첨가하여 전기영동을 시행하였다[6]. Zymogram에 사용된 세포추출물은 균주 배양액을 원심분리(14,000×g, 4℃, 5 min)하여 상층액을 제거하고 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 완충용액을 1 ml 첨가하여 현탁한 후, Sonicator (Sonic, USA)를 이용하여 세포벽을 파쇄하고 원심분리(14,000×g, 4℃, 5 min)하여 상층액을 따로 모아 제조하였다. 세포추출물 10 μl에 SDS가 첨가되지 않은 시료 완충용액 5 μl를 첨가한 뒤 0.1% (w/v) SDS를 함유한 running 완충용액에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 0.1% (v/ v) Triton X-100 (USB, USA) 로 1시간 세척 후 증류수로 15분씩 3회 헹군 뒤 4℃에서 12시간 이상 반응시켰고 루골용액(Lugol's solution)을 이용하여 한천이 분해된 단백질의 위치를 확인하였다.

한천가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석
조효소액을 이용한 agarose의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 조효소액과 0.2% (w/v)의 agarose가 포함된 20 mM Tris- HCl (pH 6.0) 완충용액을 50℃에서 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 12, 24시간 반응시킨 후, Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석을 수행하였다[3]. n-Butanol/acetic acid/H2O (2/1/1 (v/v/v))를 이용하여 전개시켰고, 10% (v/ v) H2SO4로 가시화시켰다. 표준물질로는 neoagarooligosaccharides를 사용하였다[10]. TLC에서 나타난 가수분해산물의 농도비율을 계산하기 위하여 Image J 1.44o (Wayne Rasband, Bethesda, USA) 프로그램을 이용하여 측정하였다.

결과 및 고찰

한천분해균주의 분리 및 동정
부산광역시 수영구 광안리해수욕장의 해수 시료를 Marine agar 2216 평판배지에 도말하여 한천분해능이 우수한 균주를 선별하였다. 분리된 한천분해능 BK-1 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과로 1,437 bp의 염기서열을 얻었고, BLAST 탐색으로 Agarivorans sp. HJ-6와 97%의 가장 높은 유사성을 나타냈으므로, 분리균주를 Agarivorans sp. BK-1으로 명명하였다. 본 연구와 Genbank에서 획득한 16S rDNA 염기서열을 bootstrap method (n=1,000)와 Neighbor-joining method로 분석하여 알아낸 본 연구 균주의 계통분류학적 위치를 Fig. 1에 나타냈다.

시간에 따른 한천분해 균주의 효소활성과 생장 측정 
Marine broth 2216 배지 50 ml에 최종농도 0.2% (w/v)가 되게 agar를 첨가한 후 Agarivorans sp. BK-1 균주를 접종하여 30℃, 250 rpm에서 진탕배양하였을 때 나타나는 효소활성과 생장곡선을 Fig. 2에 나타냈다. 시간에 따른 한천분해 균주의 효소활성과 생장곡선의 측정결과를 살펴보면, 1일차에서 성장기가 끝나고, 이후 지체기가 시작되었음을 알 수 있었다.  효소활성은 3일에서 가장 높았지만, 효소활성의 증가폭은 1일차와 2일차 사이가 가장 크고, 0일차와 1일차 그리고 2일차와 3일차의 차이는 크지 않았다. 따라서 이후부터의 실험에서는 Agarivorans sp. BK-1 균주의 진탕배양 2일차 배양액으로 조효소액을 제조하였다.

 

Fig. 1. Neighbor-Joining phylogenetic tree based on almost complete 16S rDNA sequence comparing isolated Agarivorans sp. BK-1 strain with other bacteria. The numbers at the branch node are percentages of bootstrap values (n= 1,000) and numbers in parenthesis are numbers in Gen Bank. 

 

Fig. 2. Cell growth and agarase activity of Agarivorans sp. BK-1 with culture time. (□ agarase activity [units/L], ■ cell growth [OD600]).
 

한천분해효소의 온도별 활성
각 온도별 Agarivorans sp. BK-1 유래 한천분해효소의 활성은 Fig. 3에 나타냈다. 실험에 사용된 효소는 50℃에서 최대활성을 보였다. 50℃에서의 활성을 100%로 하였을 때, 상대활성이 40℃에선 약 97%, 30℃에서 약 93%를 나타내었다. 60과 70℃에서는 감소하였지만 50% 이상의 상대활성을 보였다. 다른 균주들의 한천분해효소의 최적온도를 보면 Thalassomonas sp. SL-5 [11], Pseudoalteromonas sp. JYBLC [17]와 Simiduia sp. SH-1 [14]는 각각 40, 35 및 30℃의 최적온도를 나타내어 본 연구에 사용된 Agarivorans sp. BK-1 보다 낮은 최적온도를 보였으며, Maribacter sp. SH-1 [8]와 Agarivorans sp. KC-1 [15]은 50℃로 본 연구와 동일한 최적온도를 보였다. 기질로 사용되는 한천은 40℃ 이상의 온도에서 겔(gel)상태가 아닌 졸(sol)상태로 존재하고, 졸 상태에서 일반적으로 효소가 더 높은 활성을 나타낸다는 보고가 있다[9]. 따라서 본 연구의 균주가 생산하는 한천분해효소는 50℃의 최적온도를 보여 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

한천분해효소의 pH별 활성
pH별 Agarivorans sp. BK-1 유래 한천분해효소의 활성은 Fig. 4에 나타냈다. pH 6~8 사이에서 높은 활성을 보였으며, 최적인 pH 6.0에서의 활성을 100%로 하였을 때, pH 7과 8에서도 90% 이상의 활성을 보였다. pH 5.0에선 20 mM sodium acetate와 20 mM Tris-HCl의 두 완충용액에서 비슷한 활성을 보였고, pH 8.0에서도 20 mM Tris-HCl 그리고 20 mM GTA의 두 완충용액에서 비슷한 활성을 보였다. 다른 한천분해효소의 최적 pH는 Agarivorans sp. JA-1 [4]은 pH 8.0으로 염기성을 보였고, Simiduia sp. SH-1 [14]에서는 pH 7.0이며, Maribacter sp. SH-1 [8]에서는 pH 6.0으로 균주별로 다양한 최적 pH가 보고되어 있다.

 

 

Fig. 3. Effect of reaction temperature on agarase activity. The reactions were carried out at 20, 30, 40, 50, 60 and 70℃ in 1,000 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% (w/v) agarose and 500 μl of raw enzyme solution for 30 min.

한천분해효소의 열안정성

Agarivorans sp. BK-1 유래 한천분해효소의 열안정성을 Fig. 5에 나타냈다. 최적온도와 최적 pH에서 열처리를 하지 않은 효소의 활성을 100%로 간주하였을 때, 20, 30, 40℃에서는 해당온도에서 2시간 동안 노출되어도 90% 이상의 잔존활성을 보였다. 50℃에서는 노출시간에 따라 활성이 감소되는 것을 볼 수 있었고, 2시간 동안 노출되었을 때에는 56%의 잔존활성을 보였다. 60℃와 70℃에서의 열처리는 0.5시간부터 효소의 활성을 완전하게 소실시켰다.

Fig. 4. Effect of pH on agarase activity. The reactions were carried out at 50℃ in 1,000 μl of corresponding buffer containing 0.2% (w/v) agarose and 500 μl of raw enzyme solution for 30 min. (△ 20 mM sodium acetate buffers, pH 4.0-5.0; □ 20 mM Tris-HCl buffers, pH 5.0-8.0; ○ 20 mM GTA buffers, pH 8.0-9.0).

Fig. 5. Remaining activities of agarase after heat treatment. The raw enzyme solutions were pre-incubated at 20, 30, 40, 50, 60 and 70℃ for 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 hr. The reactions were then carried out at 50℃ in 1,000 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% (w/v) agarose and 500 μl of heat-treated raw enzyme solution for 30 min.

Zymogram을통한 한천분해효소의 단백질 크기 분석
Zymogram을 이용하여 한천분해활성을 보이는 단백질의 분자량을 분석한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 조효소를 이용한 zymogram에서는 한천이 분해된 단백질의 밴드들이 관찰되지 않았는데, 이는 조효소액이 한천분해활성을 보였지만(Fig. 3) zymogram으로 가시화하기에는 단백질의 농도가 낮은 것으로 판단되었다[14]. 따라서 균주 배양과 원심분리로 수확한 세포를 초음파 파쇄기로 파쇄하여 제조한 세포추출물로 zymogram을 실시하였다. 그 결과, 이 균주는 분자량이 약 110, 90, 및 55 kDa인 3개의 한천분해효소를 보유하고 있는 것으로 나타났고, 가장 높은 활성을 가진 한천분해효소의 크기는 110 kDa으로 확인되었다.

Fig. 6. Zymogram and SDS-PAGE analysis of agarase. The molecular weights of the enzymes are estimated 110, 90 and 55 kDa. (size marker; lane M, zymogram analysis of agarase; lane 1).

Fig. 7. TLC analysis of the hydrolyzed products of agarose by agarase. The reactions were carried out at 50℃ in 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% (w/v) agarose and 500 μl of raw enzyme solution for 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 12 and 24 hr. (NA, neoagarooligosaccharides; NA6, neoagarohexaose; NA4, neoagarotetraose; NA2, neoagarobiose).

 

한천가수분해산물의 TLC분석
Agarivorans sp. BK-1 균주를 2 일간 배양하여 제조된 조효소액에 agarose를 기질로 첨가하여 시간별로 반응시킨 후 TLC로 분석한 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 한천분해효소는 α- agarase와 β-agarase 두 종류가 존재한다고 알려져 있으며[4], agarose를 기질로 사용할 경우에, β-agarase는 neoagarobiose (NA2), neoagarotetraose (NA4) 및 neoagarohexaose (NA6) 등을 생성하고, α-agarase는 agarotriose 및 agaropentose 등을 생성하는데[4, 6, 16], 본 연구에 사용된 조효소액이 NA2, NA4 그리고 NA6 를 생성하는 것으로 보아 Agarivorans sp. BK-1 균주가 생산하는 효소들은 β-agarase로 확인되었다. 반응시간에 따라 NA2와 NA4가 먼저 증가하고 이후 NA6가 증가하였다. NA2의 생산은 반응 15분째부터 관찰되었으며, 반응시간에 따라 NA2와 NA4의 농도가 증가하는 것을 알 수 있었다. 최종적으로 NA2, NA4, NA6의 상대비율은 46.8%, 39.7% 및 13.5%로 나타났다. 본 연구에 이용된 Agarivorans sp. BK-1 균주가 생산하는 50℃에서 최적활성을 보이는 β-agarase를 이용하여 대식세포 활성화, 미백, 세균성장 억제, 보습 기능 및 전분노화방지 기능을 가진 네오한천올리고당의 생산이 가능할 것으로 기대된다[15].

감사의 글

이 논문은 2019년도 BB21+사업에 의하여 지원되었음.

 

초록：해양세균 Agarivorans sp. BK-1의 분리 및 β-아가라제의 특성 규명

본 연구에서는 agarose를 분해하는 세균을 분리하고 한천분해효소의 특성을 조사하였다. 한천분해세균인 BK-1은 부산광역시 수영구 광안리해수욕장에서 채취한 바닷물 시료에서 Marine agar 2216 평판배지를 이용하여 분리하였다. 분리된 균은 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통해 Agarivorans sp. BK-1으로 명명하였다. 세포 외 agarase는 Agarivorans sp. BK-1 균주 배양액에서 획득하였으며, 이를 이용하여 효소의 특성을 조사하였다. Agarivorans sp. BK-1 균주의 한천분해효소는 20, 30, 40, 50, 60 및 70℃에서 각각 67, 93, 97, 100, 58, 52%의 상대활성을 나타냈으며, pH 5, 6, 7, 8에서는 59, 100, 95, 91%의 활성을 나타내었다. 세포 외 agarase는 50℃에서 pH 6.0인 20 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였을 때 최대의 활성을 보였다. 이 agarase는 20, 30, 40℃에서 2시간 동안 열처리하여도 90% 이상의 잔존활성을 보였다. 또한, 50℃에서 2시간 동안 노출된 후에도 56%의 잔존활성을 보였다. 60과 70℃에서 30분 동안 노출된 후에는 효소활성 대부분이 사라졌다. Zymogram 분석을 통하여 Agarivorans sp. BK-1 균주가 약 110, 90, 55 kDa 크기의 한천분해효소들을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. TLC 분석 결과, Agarivorans sp. BK-1 균주의 한천분해효소는 네오한천올리고당인 neoagarobiose (46.8%), neoagarotetraose (39.7%) 및 neoagarohexaose (13.5%)를 생성하는 것으로 보아 β-agarase로 확인되었다. 따라서 Agarivorans sp. BK-1가 생산하는 β-agarase는 보습효과, 세균성장 억제, 미백효과, 식품, 화장품 및 전분노화 방지 등의 기능을 가지는 네오한천올리고당의 생산에 유용할 것으로 판단된다.