Anti-proliferative and Pro-apoptotic Activities of Nelumbo nucifera and Neferine in Human Colorectal HCT116 Cells

연 및 neferine의 암세포 항 성장 및 세포사멸 활성

Abstract

Nelumbo nucifera, also known as sacred lotus, has mainly been used as a food throughout the Asian countries. In the present study, we prepared the ethanol extracts from leaf (NL), seed (NS), and seedpod (NSP) of Nelumbo nucifera and investigated their anti-proliferative and pro-apoptotic activities in human colorectal cancer HCT116 cells. NL, NS, and NSP decreased cell viabilities in a dose-dependent manner. All extracts increased the expression of non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID)-activated gene (NAG-1) as well as NAG-1 protein. And also, NL induced the expression of pro-apoptotic NAG-1 protein and PARP cleavage in a time-dependent manner. The PARP cleavage induced by NL treatment, was recovered in part by the transfection of NAG-1 siRNA. We also evaluated the effects of neferine, one of bioactive components of Nelumbo nucifera, on the proliferation and apoptosis in HCT116 cells. It also decreased cell viability in a dose-dependent manner, and induced the expression of pro-apoptotic NAG-1 protein and PARP cleavage in a dose- and time-dependent manner. In addition, PARP cleavage was recovered in part by the transfection of NAG-1 siRNA, indicating that NAG-1 may be one of the genes responsible for apoptosis induced by neferine. Overall, our findings may contribute to understand the molecular mechanisms of anti-proliferative and pro-apoptotic effects mediated by Nelumbo nucifera and neferine.

본 연구에서는 연(Nelumbo nucifera)의 잎(leaf, NL), 자육(seed, NS), 자방(seedpod, NSP)의 에탄올 추출물을 제조하고 이들의 암세포 항 성장 활성과 세포사멸 활성을 연구하였다. 추출물 NL, NS, NSP는 농도의존적으로 세포 생존율을 감소시켰을 뿐 만 아니라 항암 유전자인 NAG-1 유전자와 단백질의 발현을 증가시켰다. 또한, NL은 NAG-1 단백질의 발현과 PARP cleavage를 시간 의존적으로 증가시켰다. PARP cleavage는 NAG-1 siRNA의 transfection에 의해 부분적으로 감소하였으며, 이러한 결과는 NAG-1이 NL에 의해 유도되는 apoptosis에 기여하는 유전자 중의 하나라는 것을 나타낸다. 그리고, 연근 유래의 순수물질인 neferine도 농도의존적으로 HCT116 세포 생존율을 감소시켰으며, NAG-1 단백질의 발현과 PARP cleavage를 농도의존적, 시간의존적으로 증가시켰다. Neferine에 의해 유도된 PARP cleavage는 NAG-1 siRNA의 transfection에 의해 부분적으로 회복되는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 NAG-1 단백질이 neferine에 의해 유도되는 apoptosis에도 기여하는 유전자 중의 하나라는 것을 시사한다. 종합적으로 본 연구 결과는 연근 부위별 추출물과 연근유래 순수물질인 neferine에 의한 암세포 항 성장 활성과 세포사멸 활성의 분자 생물학적 기전을 이해하는데 도움을 줄 것으로 생각된다.

서 론

연(Nelumbo nucifera)은 예로부터 식용 및 약용으로 사용하고 있으며 열매에서부터 잎, 꽃, 연자방, 연자육, 뿌리까지 연의 대부분을 이용하고 있다. 연의 부위별 파이토케미컬의 성분 및 생리활성에 대한 총설 논문이 발표된 바 있다[16, 17]. 연은 항산화[11], 항비만[18], 항염증[12, 15], 항암[3, 21] 활성 등 다양한 생리활성 및 효능을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 또한 연에는 neferine, nuciferine, kaemperol 등 다양한 생리활성물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이 중 neferine의 항암 활성은 다양한 암 모델에서 다양한 기전에 의해 이루어짐이 보고된 바 있다[5, 7, 19]. 또한, neferine에 의한 항산화[2], 항염증[6] 활성 등 다양한 생리활성에 대해 보고되었다.

NAG-1 (NSAID-activated gene)단백질은 TGF-β superfamily 단백질 중 하나로써 apoptosis를 촉진하며 종양형성 억제의 활성을 가진 단백질이다[1]. NAG-1 단백질은 항암 활성이 있는 다양한 파이토케미컬에 의해 발현이 유도되며, 이러한 발현이 apoptosis와 직접적인 관련성이 있다는 연구결과들이 다수 보고되었다[10, 14, 20]. 그러나, 본 연구에서는 아직까지 보고된 바 없는 연 부위별 추출물과 연 유래 순수물질인 neferine이 항암 단백질인 NAG-1의 발현에 미치는 영향과 암 세포 항성장 활성과 세포사멸 활성과의 관련성을 연구하고자 한다.

따라서 본 연구에서는 대장암 세포주 모델에서 연 부위별 추출물과 연 유래 순수물질인 neferine의 암세포 항 성장 활성과 세포사멸 활성 및 이들의 작용기전에 대해 연구하였다. 이러한 연구는 연의 항암활성과 작용기전 이해에 도움을 줄 것으로 기대된다.

재료 및 방법

연 에탄올 추출물 제조 및 neferine

연의 부위 중 연잎, 연자육, 및 연자방으로부터 에탄올 추출물을 제조하였으며 각각 NL (leaf, 연잎), NS (seed, 연자육), 및 NSP (seedpod, 연자방)로 명명하였다. 연 부위별 에탄올 추출물을 제조하기 위하여 연 부위별 시료에 각각 10배의 95% ethanol을 첨가한 후 실온에서 24시간씩 3회 반복 추출하였다. 추출액은 whatman filter paper (No. 2)로 거른 후 감압농축(Eyela rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Japan)하여 분말을 조제하였다. 각 추출물들은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 100 mg/ml 농도로 희석하여 사용하였다. 순수물질인 neferine은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

인간 대장암 세포주 HCT116 배양

인간 대장암 세포주 HCT116는 American Type Culture Collection (ATCC, Fredrick, MD, USA)에서 구입하였으며, 배양은 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하였다. 배양은 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 실시하였다.

세포 생존율 연구

연 부위별 에탄올 추출물 및 순수물질 neferine이 세포 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 시료를 다양한 조건에서 대장암 세포주 HCT116에 처리한 후 cell viability assay를 수행하였다. 즉, 96 well plate에 1×10⁵ cells/well의 세포를 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 각 시료를 조건에 따라 24시간 동안 처리하고 MTT 용액을 각 well당 20 μl씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator에 2시간 반응시킨 후 배지를 제거하고 각 well 당 유기용매인 DMSO를 100 μl 분주하였다. 그 후 NanoQuant Plate^TM (Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 다섯 개의 well을 독립적으로 수행한 값의 평균을 Sigma plot program 10.0을 이용하여 분석하여 그래프로 나타내었다.

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

세포배양용 60 mm dish에 대장암 세포주인 HCT116세포를 24시간 동안 배양한 후 각 시료를 조건에 따라 처리하였다. 시료 처리 후 24시간 동안 반응시킨 뒤 RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA 3 μg을 주형으로 PrimeScript^TM RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 NAG-1과 GAPDH 특이적인 oligonucleotide primer (Table 1)를 이용하여 PCR 과정을 수행하였다. 최종적인 PCR product는 전기영동 후 Gel Image Analysis System (CoreBio, Seoul, Korea)을 이용하여 band를 관찰하였다.

Table. 1. Sequences of oligonucleotide primers used for RT-PCR

Western blot analysis

대장암 세포주인 HCT116 cell을 6 well plate에 well 당 3.0×10⁵ cell을 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 시료를 조건에 따라 처리하였다. 시료 처리 24시간 후 수확한 세포는 4x RIPA (Cell signaling, Beverly, MA, USA) 용액을 처리하여 sonication 실시 후 총 단백질을 분리하였다. 추출한 단백질은 Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 정량 하였다. 총 20 μg의 단백질을 4-12% acrylamide gel에서 전기영동 한 후, 전기적으로 membrane에 transfer 시켰다. 1차 항체는 NAG-1, PARP와 Actin 항체를 사용하였고, 2차 항체는 HRP-conjugated rabbit antibody와 HRP-conjugated mouse antibody를 사용하였다. 모든 항체는 Santa Cruz사 (Santa Cruz, CA, USA) 혹은 Cell signaling사 (USA)에서 구입하였다. 1차 항체는 4℃에서 overnight 처리하였고, 2차 항체를 3시간 동안 반응시켰다. 그 후 enhanced chemilumines-cence kit (ECL^TM, Amersham, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 반응시킨 후 C-DIGIT (LI-COR, Lincoln, NE, USA)를 이용하여 확인하였다.

siRNA transfection

대장암 세포주 HCT116를 약 24시간 동안 배양한 후 serum free DMEM에 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 10 μl와 10 pmol NAG-1 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea) 6 μl를 혼합하여 transfection 하였다. 대조구는 β-gal siRNA (Bioneer)를 사용하였다. 4시간 후 FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교환한 뒤 24시간 동안 추가배양을 한 후 시료를 조건에 따라 처리하였다. 24시간 transfection 한 후, 수확한 단백질은 Western blot analysis 실시하여 각 단백질의 발현양을 확인하였다.

통계처리

모든 실험은 최소한 3회 이상 반복실험을 실시하였으며 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 student’s t-test에 의해 판정하였으며 p<0.05일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

결과 및 고찰

연 부위별 에탄올 추출물이 세포성장에 미치는 영향

연잎, 연자육, 연자방 에탄올 추출물(NL, NS, NSP)이 대장암 세포주인 HCT116의 세포생존율에 미치는 영향을 연구하기 위하여 각 시료를 농도별로 처리한 후 cell viability assay를 수행하였다. NL, NS, 그리고 NSP를 25, 50, 100 μg/ml 농도로 24시간 동안 처리한 후 세포생존율이 처리한 각 시료의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 1). 특히, 모든 시료에서 100 μg/ml 농도 처리군에서 세포 생존율이 가장 낮았다. 이러한 결과를 바탕으로 추후 실험을 위한 추출물의 농도는 100 μg/ml로 하여 진행하였다. 최근 세 종류의 추출물에 의한 항염증 활성과 작용기전에 대한 보고는 있었으나[9], 이들 추출물에 의한 대장암 세포주 HCT116에서의 항성장 활성과 암세포 사멸활성에 대한 보고는 전무한 실정이다.

Fig. 1. Effects of leaf (NL), seed (NS), and seedpod (NSP) extracts of Nelumbo nucifera on cell via-bility in HCT116 cells. HCT116 cells were plat-ed at 5×10⁵ cells/well in a 96-well plate and incubated with various concentrations of NL, NS, and NSP for 24 hr. Cell viability was measured using MTT assay. *p<0.05, **p<0.01, ***p< 0.001.

NL, NS, NSP에 의한 NAG-1 유전자 및 NAG-1 단백질의 발현 증가

NL, NS, 그리고 NSP를 대장암 세포주인 HCT116 세포에 24시간 동안 처리 한 후, 항암 유전자 NAG-1 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과, Fig. 2A, Fig. 2B에서 보는 바와 같이 추출물 NL, NS에 의해 NAG-1 유전자와 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다. NAG-1을 과대발현하는 transgenic 마우스 모델에서 대장암을 억제함으로써, NAG-1의 암억제 유전자로서의 기능이 제시되었다[1]. 또한, 동일한 마우스 모델을 이용한 연구에서, NAG-1이 비만을 예방하고 치료할 수 있는 표적 유전자로 제시된 바 있다[4]. 추후 실험은 항암 유전자인 NAG-1을 가장 높은 수준으로 발현시키는 연잎 에탄올 추출물(NL)을 이용하여 진행하였다.

Fig. 2. Up-regulation of NAG-1 expression by NL, NS, and NSP in HCT116 cells. HCT116 cells were treated with NL, NS, and NSP for 24 hr. (A) Total RNA was extracted and RT-PCR was done by using gene-specific primers. (B) After same treatment, total proteins were collected from treated cells. Western blot was performed by using NAG-1 and Actin antibodies.

연잎 에탄올 추출물에 의한 apoptosis 유도 및 NAG-1 siRNA에 의한 세포사멸의 회복

연잎 에탄올 추출물(NL)에 의한 세포생존율 감소 원인이 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여, apoptosis 지표 중 하나인 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 cleavage를 NL 처리시간 별로 확인하였다. 그 결과 Fig. 3A에서 보는 바와 같이, 200 μg/ml NL 처리 후 3시간 이후부터 PARP cleavage가 나타났으며, 48시간까지 지속됨을 확인하였다. 또한, 항암 단백질인 NAG-1의 경우 NL 처리 후 3시간 처리군부터 약한 NAG-1 단백질의 발현이 관찰되었으며, 이후 48시간 처리군까지 시간이 경과됨에 따라 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 NL에 의한 apoptosis의 유도와 NAG-1의 발현 증가와의 관련성을 확인하기 위하여 NAG-1 siRNA를 이용하여 증명하였다. 그 결과 Fig. 3B에서 보는 바와 같이, NAG-1 siRNA를 transfection 한 경우 대조구에 비해 NAG-1의 발현 감소는 물론, PARP cleavage가 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 NL에 의해 유도되는 apoptosis 현상이 NL에 의해 발현이 증가되는 NAG-1의 발현과 직접적인 관련이 있음을 시사한다.

Fig. 3. Induction of apoptosis by NL treatment and recovery of apoptosis by NAG-1 siRNA transfection. (A) HCT116 cells were incubated with 200 μg/ml NL and collected at the different time points. Western blot was performed by using PARP, NAG-1, and Actin antibodies. (B) Either β-gal or NAG-1 siRNA was transfected into HCT116 cells. After 24 hr transfection, cells were treated with DMSO (VEH) or 200 μg/ml NL. After 24 hr treatment, cells were collected for Western blot analysis using PARP, NAG-1, and Actin antibodies.

Neferine에 의한 세포생존율의 감소

연 유래 순수물질인 neferine이 대장암 세포주 HCT116 성장에 미치는 영향을 연구하기 위하여 cell viability assay를 수행하였다. 즉, HCT116 세포주에 neferine을 12.5, 25, 50 μM의 농도로 처리하고, 양성 대조구로 resveratrol 50 μM을 처리한 후 cell viability assay를 수행하였다. 그 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이 neferine의 처리 농도가 증가됨에 따라 세포 생존율이 감소됨을 확인하였다. 다양한 항암 모델에서 neferine에 의한 항암 활성이 보고되었다[5, 7, 19]. 최근에 대장암 세포주 모델에서 neferine이 항암제인 cisplatin과의 조합처리가 cisplatin의 항암 활성을 증가시킨다는 보고[13]가 있었으나, neferine의 대장암 세포주 모델에서의 항암 활성과 작용기전에 대한 연구는 매우 미미한 실정이다.

Fig. 4. Effects of neferine on cell viability of HCT116 cells. HCT 116 cells were plated at 5×10⁵ cells/well in a 96-well plate and incubated with various concentrations of neferine for 24 hr. Cell viability was measured using MTT assay. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

Neferine에 의한 apoptosis 유도 및 NAG-1 siRNA에 의한 세포사멸의 회복

Neferine에 의한 세포생존율 감소의 원인이 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여, PARP cleavage를 neferine의 처리농도 별, 시간대 별로 확인하였다. 즉, neferine을 12.5, 25, 그리고 50 μM의 농도로 HCT116 세포에 24시간 처리한 후, PARP cleavage와 NAG-1 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과 Fig. 5A에서 보는 바와 같이, 농도의존적으로 NAG-1 단백질의 발현이 증가하였으며, PARP cleavage도 처리한 neferine의 농도에 의존적으로 증가됨을 확인하였다. 또한, 50 μM neferine을 3, 6, 12, 24시간 동안 처리한 후, PARP cleavage와 NAG-1의 발현을 확인하였다. 그 결과, Fig. 5B에서 보는 바와 같이 3시간 처리 군부터 명확하게 PARP cleavage가 관찰되었으며 24시간 처리군까지 시간의존적으로 증가됨을 확인하였다. NAG-1 단백질의 발현도 6시간 처리군부터 명확히 관찰되었으며, 24시간 처리 조건까지 꾸준히 발현양이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 neferine에 의한 세포사멸 현상은 neferine의 처리농도 및 처리시간 의존적으로 일어남을 시사하는 것이며, 또한 항암 단백질인 NAG-1의 발현도 비슷한 경향으로 일어남을 증명하는 것이다. 이러한 neferine에 의한 apoptosis의 유도와 NAG-1의 발현 증가와의 관련성을 확인하기 위하여 NAG-1 siRNA를 이용하여 증명하였다. 그 결과 Fig. 5C에서 보는 바와 같이, NAG-1 siRNA를 transfection 한 경우 대조구에 비해 NAG-1의 발현 감소는 물론, PARP cleavage가 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 neferine에 의해 유도되는 apoptosis 현상이 neferine에 의해 발현이 증가되는 NAG-1의 발현과 직접적인 관련이 있음을 시사한다. 이러한 결과는 오미자 박 추출물과 오미자 유래의 순수물질인 schizandrin에 의한 항암 활성과 NAG-1 발현과의 관련성을 직접적으로 규명한 연구결과[8]와 유사한 것으로 생각된다.

Fig. 5. Induction of apoptosis by neferine treatment and recovery of apoptosis by NAG-1 siRNA transfection. (A) HCT 116 cells were incubated with various concentration of neferine for 24 hr. Western blot was performed by using PARP, NAG-1, and Actin antibodies. (B) HCT116 cells were incubated with 50 μM neferine and collected at the different time points. Western blot was performed by using PARP, NAG-1, and Actin antibodies. (C) Either β-gal or NAG-1 siRNA was transfected into HCT116 cells. After 24 hr transfection, cells were treated with DMSO (VEH) or 50 μM neferine. After 24 hr treatment, cells were collected for Western blot analysis using PARP, NAG-1, and Actin antibodies.

종합적으로, 본 연구의 결과는 대장암 세포주 HCT116에서 연 추출물과 연 유래의 순수물질인 neferine에 의한 암세포 항성장 활성과 세포사멸 현상에 대한 작용기전을 제시한다.

감사의 글

본 연구는 2018년도 산업통상자원부 바이오테라피산업기반구축사업(과제번호 N0001805)에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.