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The Antioxidant and Anti-aging Effects of Treatment with Schisandra chinensis Seeds Fractions in UVB-irradiated Human HaCaT Cells

자외선 B에 유도된 사람유래 HaCaT cells에서의 오미자 종자 분획물의 항산화 및 항노화 효과

  • Choi, Eun-Young (Department of Cosmeceutical Science, Daegu Haany University) ;
  • Sohn, Ho-Yong (Department of Food and Nutrition, Andong National University) ;
  • Lee, Jin-Tae (Department of Cosmeceutical Science, Daegu Haany University)
  • 최은영 (대구한의대학교 화장품약리학과) ;
  • 손호용 (안동대학교 식품영양학과) ;
  • 이진태 (대구한의대학교 화장품약리학과)
  • Received : 2019.08.13
  • Accepted : 2019.09.27
  • Published : 2019.10.30
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Abstract

In this study, we investigated the antioxidant and anti-aging activities of Schisandra chinensis seed fractions by adding them to UVB-irradiated HaCaT cells and analyzing the suppression of matrix metalloproteinases (MMPs). An electron-donating assay, ABTS radical scavenging assay, and hydrogen peroxide scavenging assay showed that the ethyl acetate fraction of S. chinensis seed (SCEAf) has scavenging activities. A collagenase inhibition activity assay showed that SCEAf had inhibitory effects of over 92.3% at $500{\mu}g/ml$ concentration. An MTT assay was performed to determine the cytotoxicity of SCEAf in HaCaT cells and the results showed that SCEAf increased cellular viability in a concentration-dependent manner. In addition, SCEAf was found to increase the viability of cells irradiatged by UVB $50mJ/cm^2$. To examine the anti-aging effects of SCEAf on HaCaT cells irradiated with UVB $50mJ/cm^2$, the expression of MMP-1 and -3 was analyzed by Western blotting and reverse-transcription polymerase chain reaction. The results showed that MMP-1 and -3 proteins and mRNA levels were downregulated in a concentration-dependent manner in response to SCEAf. These results suggest that SCEAf can prevent aging and alleviate aging symptoms by inhibiting collagenase activity in skin keratinocytes damaged by UVB. Therefore, S. chinensis seeds may have the potential for use as functional ingredients with anti-aging effects in the cosmetic and food industries.

본 연구에서 우리는 오미자 종자 분획물의 항산화 활성과 자외선에 유도된 human HaCaT cell에서의 MMPs의 발현억제에 의한 항노화 효과를 조사하고자 하였다. 전자공여능, ABTS 라디칼 소거분석, 그리고 hydrogen peroxide 소거분석 실험을 통해, 오미자 종자의 분획물 중 에틸아세테이트 분획물(SCEAf)이 가장 우수한 라디칼 소거활성을 가졌고, collagenase 저해 활성 실험에서 SCEAf는 $500{\mu}g/ml$의 농도에서 92.3% 이상의 저해효과를 보였음을 확인하였다. SCEAf의 HaCaT cell에 대한 세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 실시한 결과, SCEAf는 세포에 독성이 없음을 나타낼 뿐 아니라 UVB에 손상된 세포의 생존율을 증가시킴으로써 세포 활성에 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다. SCEAf의 HaCaT cell에서의 항노화 효과를 조사하기 위해 UVB $50mJ/cm^2$에 유도된 HaCaT cell에 SCEAf를 처리한 후 MMP-1과 -3의 발현을 Western blotting과 reverse-transcription polymerase chain reaction으로 분석하였다. 그 결과 SCEAf가 MMP-1과 -3의 단백질과 mRNAs의 발현을 농도의존적으로 억제시켰다. 이러한 결과는 오미자 종자 에틸아세테이트 분획물이 자외선의 손상을 받은 피부 각질형성세포에서의 collageanse 활성을 억제하여 노화를 예방하고 증상을 완화시킬 것으로 기대할 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 오미자 종자가 화장품과 식품 산업에서 항노화 효과가 있는 기능성 원료로서 사용하기 위한 잠재성을 가질 것으로 기대한다.

Keywords

서 론

노화 현상은 신체의 성장과 발달이 중지되면서 나타나는 피할 수 없는 과정으로[33] 피부는 이러한 신체의 노화를 잘 보여주는 기관 중의 하나이다[21]. 피부에서의 노화현상은 나이가 들어가면서 일어나는 내재적인 노화와 외부 요인의 자극에 의해 촉진되는 환경적인 노화로 구분된다. 환경적인 외적 요인 중 가장 큰 요인은 자외선(Ultra violet, UV)이다[21]. 적당량의 자외선 노출은 피부에서 비타민D를 합성하는데 꼭 필요하지만 장기간의 과도한 자외선 노출은 피부, 눈, 면역계 등에 해로운 영향을 미친다[48]. 자외선은 UVA (320~400 nm)와 UVB (280~320 nm), UVC (100~280 nm)로 나뉘는데 지구표면에 도달하는 햇빛 자외선의 대부분은 UVA이며 대기권에서 대부분 흡수되고 10% 정도만 도달하는 것은 UVB이다. UVA와 UVB 모두 피부에 손상을 초래하지만 UVA는 피부세포의 DNA에 직접적으로 손상을 주지는 못하는 반면 UVB는 직접적으로 작용함으로써 화상, 광노화, 피부암 등을 유발할 수 있어 UVB가 더 해롭다고 볼 수 있다[31]. UVB에 의한 피부 손상은 직접 피부세포 내의 DNA의 손상을 초래하는 경로와 간접적으로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 세포의 지질막 손상, 세포의 염증반응, 피부구성 단백질 손상을 초래하는 피부 광노화 경로가 있다[46]. UVB는 사람 섬유아세포[13]와 피부의 상피세포[30]에 산화적 스트레스를 증가시켜 Matrix metalloproteinases (MMPs), 특히 MMP-1, -2. -3 및 9의 발현을 활성화시켜 아교섬유를 분해하여 피부 광노화로 이어지는 것으로 알려져 있고 노화된 피부는 주름형성과 처짐, 탄력감소, 거칠어짐, 건조함 등의 특징을 나타낸다[8, 11, 17, 37]. 또한 UVB는 매우 낮은 강도에 노출된 피부에서도 MMPs를 증가시키는 노화인자이다[22]. 그러나 이러한 자외선에 의한 피부 광노화는 어느 정도 예방이 가능하기 때문에 피부 광노화의 예방 및 개선을 위한 기능성 화장품과 식품의 소재 개발에 대한 연구는 꾸준히 이루어져야 한다.

오미자(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.)는 오미자과에 속하는 낙엽성 덩굴식물인 목련과(Magnoliaceae)에 속하고, 생약명은 Shizmandrae Furctus인 오미자나무의 붉은 색 과실을 말하며, 사람이 느낄 수 있는 단맛, 쓴맛, 신맛, 매운맛 및 짠맛의 총 다섯 가지 맛을 가지고 있다고 하여 붙여진 이름이다[23, 45]. 주로 우리나라 중부지방에 분포하고 있으며 개화시기는 6~8월이고 과실이 열리는 시기는 9~10월이며 채취하는 시기는 서리가 내린 후이다[18, 34]. 오미자는 예부터 식용으로 널리 사용되어 농가에서는 단기 소득을 올릴 수 있는 임산물로 재배가 장려되어 왔다[24]. 오미자의 주요 약리 성분으로 shizandrin, shizandrol, shizandran, gomisin류 등의 lignans이 함유되어 있으며, 이와 관련된 생리적 기능으로는 혈압강하 작용[41], 콜레스테롤 저하, 항균활성, 항염증 효과[15, 43] 및 항암효과[39] 등이 있다고 보고되었다[6, 27]. 특히 오미자에 대한 항산화 효과[7]에 대한 연구가 활발히 진행되면서 약용식물의 열매인 오미자를 천연 소재로 활용하기 위한 관심이 증가하고 있다[44]. 오미자를 물과 에탄올을 이용하여 추출한 경우 물보다는 에탄올 추출물이 항산화 효과가 더 높게 나타났으며, 상온일 때보다 가온을 한 경우 더 높은 항산화 효과를 나타내고[29], 오미자의 기능성 성분은 과육보다는 종자에 많이 함유된 것으로 보고되었다[28, 42]. 오미자에 대한 다양한 연구에도 불구하고 아직까지 오미자 종자 분획물에 대한 항산화 및 주름억제 활성에 대한 연구에 대한 보고는 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 연구에서는 오미자 종자의 분획물의 항산화 활성 및 항주름 활성을 확인하고 UVB에 유도된 사람 유래의 피부각질형성세포인 HaCaT cells에서 MMPs의 발현을 억제하는지를 확인하고자 하였으며 그 결과를 바탕으로 오미자 종자를 화장품과 식품 분야에서의 주름억제 기능성 소재로서의 활용가능성을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

시료의 추출

본 실험에 사용한 오미자 종자는 경북 문경시의 오미자 가공회사(이젠하우스 자연미소 농장, 문경, 한국)로부터 성숙 오미자 열매를 착즙하고 난 후 회수된 종자를 흐르는 물에 과육 잔류물을 수작업으로 제거한 상태로 구입하여 사용하였다. 구입한 오미자 종자는 수분을 제거하고 분쇄기로 12 mesh 이하로 파쇄하였고 시료 중량의 10배의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출물은 여과 및 감압농축 후 동결 건조하여 분말을 얻었으며 에탄올 추출물의 극성차를 이용하여 서로 다른 용매를 첨가하여 분획을 실시하였다. 오미자 종자 에탄올추출물 중량의 10배의 증류수에 녹인 후, 동량의 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 순차적으로 첨가하여 각 3회 반복 후 상층액을 얻었으며, 최종 남은 용액은 물층으로 하였다. 이들 분획물들을 감압 농축 후 동결건조 하였으며 냉장보관하며 실험에 사용하였다. 오미자 종자는 안동대학교 식품영양학과에 보관하고 있다(Voucher No. 2017-SC-5).

전자공여능 측정

전자공여능은 Blois [2]의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 다양한 농도(10, 50, 100 및 500 μg/ml)의 각 시료용액 100 μl에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich Co., MO, USA) 50 μl 넣어 잘 혼합한 후 암소에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH를 이용한 항산화 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거활성의 측정은 Park 등[40]의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 7.4 mM ABTS [2,2'-azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid), Sigma-Aldrich Co.] 0.5 ml와 2.6 mM potassium persulfate (K2S2O8, Sigma-Aldrich Co.) 88 μl를 섞은 용액 1 ml와 ethanol 88 ml를 혼합한 ABTS용액 1 ml를 1:1로 섞은 후 12시간 동안 라디컬을 형성시킨 용액을 99% ethanol에 약 1:13의 비율로 섞어서 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.706±0.001이 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 다양한 농도(10, 50, 100 및 500 μg/ml)의 시료용액 100 μl와 ABTS solution 100 μl를 혼합하여 30초간 진탕한 후 1분간 상온에서 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거효과는 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Hydrogen peroxide 소거능 측정

Hydrogen peroxide 소거능 측정은 Jayaprakasha 등[16]의 방법으로 측정하였다. 0.04 M 과산화수소 용액은 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 희석시켜 사용하였다. 예비실험의 결과 시료 10 μg/ml 농도에서의 hydrogen peroxide 소거활성의 값이 매우 미비하였기에(no data) 본 실험에서는 50 μg/ml 이상의 농도부터 진행하기로 하였다. 0.5 ml의 다양한 농도(50, 100, 500 및 1,000 μg/ml)의 시료를 0.5 ml의 과산화수소 용액과 37℃에서 10분간 반응시킨 후 230 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Collagenase 저해 활성

Collagenase 저해활성 측정은 Cannell 등[5]의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여, 4-phenylazobenzy-loxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3 mg/ml, SigmaAldrich Co.)를 녹인 기질액 0.25 ml 및 다양한 농도(10, 50, 100 및 500 μg/ml)의 시료용액 0.1 ml의 혼합액에 collagenase (0.2 mg/ml, Sigma-Aldrich Co.) 0.15 ml를 첨가하여 실온에서 20분간 정치한 후 6% citric acid 0.5 ml을 넣어 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate 1.5 ml을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포의 배양

Human 유래 keratinocyte cell line인 HaCaT cells는 German Cancer Research Center (DKFZ, Germany)로부터 분양받아 10% Fetal bovine serum (FBS)과 Penicillin/Streptomycin (Gibco BRL Co., NY., USA) 100 unit/ml이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL Co.) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-18AIC, SANYO Co., Sakata, Japan)에서 배양하였으며, 2~3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다.

MTT assay

세포 생존율 측정은 Mosmann [20]의 방법을 변형하여 측정하였다. HaCaT cell을 96well plate에 1×103 cells/well이 되게 0.2 ml 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배지를 제거 한 후 PBS로 2회 세척 한 다음 PBS 존재 하에 UVB (LP471 UVB probe, Delta OHM, Padova, Italy)를 이용하여 50 mJ/cm2 (25 cm/ 300 μW/ cm2)를 조사해준 뒤 시료를 농도별(25, 50 및 100 μg/ml)로 조제하여 0.02 ml 첨가한 후 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 여기에 2.5 mg/ml 농도로 제조한 3-(4,5-dimetylthiazole-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Co.) 용액 0.02 ml를 첨가하여 4시간 동안 배양한 후 상층액을 제거하고, 형성된 formazan에 각 well당 0.1 ml의 DMSO 용액을 가하여 실온에서 차광하여 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader (PowerWave XS Microplate Spectrophotometer, Biotek, VT, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot을 통한 단백질의 발현 측정

오미자 종자의 에틸아세테이트 분획물의 항주름 활성을 알아보기 위해 MMP-1과 -3의 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. HaCaT cell을 96well culture plate에 1×106 cells/ ml로 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 시료를 농도별(25, 50 및 100 μg/ml)로 처리하고 1시간 반응시킨 후 UVB (50 mJ/cm2)로 Normal군을 제외하고 세포를 자극한 뒤 24시간 동안 배양 후에 상층액을 제거하고 PBS로 3번 세척하였다. 세포를 수확하여 Radio-immuno-precipitation assay (RIPA) lysis buffer 100 μl에 세포를 용출시켜 단백질을 수확한 후 원심분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하고 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분리하였다. Gel을 4시간 동안 polyvinylidenedifluoride (PVDF) membrane (Sigma-Aldrich Co.)에 옮긴 다음 4℃에서 6시간 동안 5% skim milk로 blocking 하였다. Primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., TX, USA)를 1:1,000으로 희석하여 4℃에서 overnight 하고 나서 TBST로 30분간 교반하여 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 각각의 HRP-conjugated secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리하고 다시 TBST로 10분간 교반하여 세척하는 과정을 3회 반복한 뒤 ECL 용액을 가한 후 Western imaging system (EZ-Capture MG, ATTO, NY, USA) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.

RNA 추출 및 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 과정

MMP-1과 -3의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 HaCaT cell을 100ϕ dish에 1×106 cells/well 이 되도록 분주하고 24시간 동안 안정화하였다. 배지를 제거한 후 시료를 농도별(25, 50 및 100 μg/ml)로 처치하고 1시간 후 자극원인 UVB (50 mJ/cm2)로 Normal군을 제외한 세포에 자극한 후 24시간 후 PBS로 세척하여 세포를 수확하였다. RNA는 High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Switzerland)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하여 RNA를 분리하였다. A260/A280 비율을 사용하여 1.7~2.0의 순도인 total RNA를 추출하였으며 2 μg/μl의 농도로 정량하고 추출된 total RNA는 Transcriptor first Stand cDNA synthesis kit (Roche)를 이용하여 역전사를 진행시켜 cDNA를 합성시켰다. 유전자 발현은 Fast start Essential DNA Green Master kit (Roche)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 분석에서 internal control은 β-actin (Bioneer, Seoul, Korea)을 사용하였고 Primer (Bioneer)의 sequences는 다음과 같다. Human MMP-1 (forward, 5'-GTTTTCCTCAGA AAGAGCAGCAT-3'; reverse, 5'-AGC GTGTGACAGTAAGCTAA-3'), MMP-3 (forward, 5'-TTGTT CTTTGATGCAGTCAGC-3'; reverse, 5'-GATTTGCGCCAA AAGTGC-3'), β-actin (forward, 5'-TGGAATCCTGTGGCAT CCATGAAA-3'; reverse, 5'-ACCGACTGCTGTCACCTTCA- 3'). PCR의 증폭 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10분간 초기 denaturation 시킨 후 45 cycle을 증폭시켰다. 95℃에서 10초간 denaturation, 60℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 10초간 extension시켰다. RT-PCR 증폭으로 생산된 DNA는 0.5 μg/ ml의 ethidium bromide가 포함된 1% metaphor agarose gel에 전기영동하여 cooled CCD camera system EZ-Capture II와 CA analyzer ver. 3.00 software (EZ-Capture MG)를 이용하여 mRNA의 발현 정도를 확인하였다.

통계처리

실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 25.0 (IBM SPSS Inc., NY, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 이용하여 유의성을 확인한 후, Duncan’s multiple range tests (p<0.05)로 다중비교를 실시하여 분석하였다.

결 과

전자공여능 측정

DPPH는 비교적 안정한 자유라디칼로서 시료의 전자공여능 실험결과가 높으면 DPPH의 자유라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 높아 체내에 활성산소와 같은 자유라디칼의 소거작용으로 노화를 억제하는 효과를 예시해주는 항산화 물질이다[32]. 오미자 종자의 분획물에 대한 전자공여능의 측정결과는 Fig. 1에서 나타난 바와 같이 에틸아세테이트 분획물(SCEAf)이 500 μg/ml에서 약 98.5%의 소거능력을 보여 다른 분획물들과 비교해서도 가장 우수한 결과였으며 대조군인 ascorbic acid (AA)가 같은 농도에서 약 98.2%의 효능을 보인 것과 비교하여 유의할 만한 결과이다. 이와 같은 연구 결과는 Park 등[38]의 보고에서 생오미자 착즙박의 70% 에탄올 추출물이 0.2 mg/ml에서 84.84%의 전자공여능을 보인 것과, Kim 등[26]의 보고에서 100 mg/ml 농도로 오미자박 압착액 분말을 처리하면 94%의 DPPH 소거활성을 보인다는 것과 비교하였을 때 SCEAf의 DPPH 라디칼 소거활성이 매우 우수한 결과임을 알 수 있었다.

Fig. 1. Electron donating assay. SCWf: water fraction of Schisandra chinensis seeds, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds, SCBf: butanol fraction of Schisandra chinensis seeds, AA: Ascorbic acid (Positive control), Results are means ± S.D. of triplicate data. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

ABTS radical 소거능 측정

ABTS 라디칼을 이용한 산화방지력의 측정은 potassium persulfate과의 반응에 의해 생성된 ABTS 자유 라디칼이 추출물 내의 산화성 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색이 되는데 그 흡광도 값으로 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정할 수 있다[19]. 오미자 종자 분획물에 대한 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과는 Fig. 2와 같다. 분획물 중 SCEAf가 500 μg/ml의 농도에서 99.0%의 우수한 소거활성능을 보였으며 대조군인 BHT (약 98.5%)의 결과보다 뛰어났다. 이와 같은 연구 결과는 Kim 등[26]의 보고에서 오미자박 압착액 분말 100 mg/ml로 처리하면 30.82%의 ABTS의 소거능을 보였으며, Kim 등[25]의 보고에서 오미자 원물의 IC50 값이 0.69±0.01 mg/ml라고 한 결과와 비교하였을 때 SCEAf는 뛰어난 ABTS 라디칼 소거활성을 보인 것이다.

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity. SCWf: water fraction of Schisandra chinensis seeds, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds, SCBf: butanol fraction of Schisandra chinensis seeds, BHT: butylene hydroxy toluene (Positive control), Results are means ± S.D. of triplicate data. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

Hydrogen peroxide 소거능 측정

과산화수소는 세포독성 물질로 체내 각 기관들의 DNA에 심각한 손상을 초래하여 각종 질병과 노화를 유발한다고 알려져 있다[1]. 또한 과산화수소 자체의 독성은 낮지만 세포막을 통과할 수 있고, 금속이온과 반응하여 독성이 강한 hydroxyl radical을 생성하기 때문에 생체에 문제가 되고 있다[1]. 오미자 종자 분획물의 hydrogen peroxide 소거능 결과는 다음과 같다(Fig. 3). SCEAf가 100 μg/ml의 농도에서 약 99.4%의 매우 높은 소거활성을 나타내어 분획물 중 가장 우수한 결과를 보였다. 오미자에 대한 hydrogen peroxide 소거능에 대한 연구는 아직 보고된 바가 없어 다른 추출물에서의 결과를 비교 고찰한 결과, Lim 등[36]이 보고한 국내산 블랙초크베리 산첨가 물추출물의 IC50값이 약 469.1 μg/ml이었다고 한 것과 Hyon 등[14]의 보고에서 당유자 과피와 당유자 과피 발효물 80% 에탄올추출물이 각각 4,355 μg/ml과 1,195 μg/ml의 농도에서 IC50값의 소거능을 보였다는 결과와 비교하여 SCEAf는 매우 우수한 효능임을 알 수 있었다.

Fig. 3. Hydrogen peroxide scavenging activity. SCWf: water fraction of Schisandra chinensis seeds, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds, SCBf: butanol fraction of Schisandra chinensis seeds, AA: Ascorbic acid (Positive control), Results are means ± S.D. of triplicate data. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

Collagenase 저해활성 결과

콜라겐은 피부에서 탄력과 결합에 중요한 역할을 하고 있는데 트립신과 같은 단백질 분해효소의 작용을 받지 않고 collagenase에 의해 분해된다[9]. 따라서 collagenase는 세포외기질 단백질을 분해하는 효소로 피부의 주름생성을 촉진시키는 요인이 된다. 오미자 종자 분획물의 collagenase 저해활성 분석 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 분획물 중 SCEAf가 100 μg/ml와 500 μg/ml의 농도에서 각각 약 69.2%와 92.3%의 저해효능을 보였으며 다른 분획물과 비교하여 가장 우수한 결과였으며 대조군인 EGCG가 같은 농도에서 각각 약 74.1%와 93.5%의 결과를 보인 것과 비교하였을 때 유의할 만한 결과였으며, 또한 Lee 등[35]의 연구에서 청다래 에탄올추출물이 500 μg/ml에서 약 90%의 저해활성을 보인 것과 비교해서 우수한 결과임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 SCEAf가 UVB에 조사된 사람유래 각질형성세포에서 활성화되는 MMP group을 얼마나 억제하는지를 확인하기로 하였다.

Fig. 4. Collagenase inhibition activity. SCWf: water fraction of Schisandra chinensis seeds, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds, SCBf: butanol fraction of Schisandra chinensis seeds, EGCG: Epigallocatechin gallate (Positive control), Results are means ± S.D. of triplicate data. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

세포 생존율 측정 결과

Yellow tetrazolium salt MTT는 담황색 기질로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 reductase에 의해 환원되어 formazan을 생성하는데 죽어있는 세포에서는 형성되지 않고 살아있는 세포의 수가 많을수록 formazan의 생성도 많아지고 세포의 성장을 측정할 수 있다[12]. 본 연구에서는 사람유래 각질형성세포인 HaCaT cell에 SCEAf를 농도별로 처치한 후의 세포 생존율을 확인(Fig. 5A)하였으며 그 결과 SCEAf 25 μg/ml의 농도에서 약 93.5%의 생존율을 나타내었고 농도의존적으로 생존율은 증가하였다. 또한 자극원으로 UVB를 조사해 준 뒤 SCEAf를 농도별로 처치한 후의 세포 생존율을 확인(Fig. 5B)하였다. 자극원 조사 강도 예비실험을 한 결과 UVB 50 mJ/cm2의 강도에서는 약 74.5%의 세포생존율을 보였고, 100 mJ/cm2의 강도에서는 약 62.7%의 낮은 생존율을 보였기에 실험에서는 UVB 50 mJ/cm2를 자극 강도로 정하였다(no data). 자극원 조사 후의 결과에서는 자극원만 조사한 세포의 생존율이 약 75.7%였으나 자극받은 세포에 SCEAf를 주입한 결과 25 μg/ml의 농도에서 약 86.8%의 생존효과를 보였으며 이는 생존율이 약 11.1%가 증가한 결과이다. 또한 농도의존적으로 생존율이 증가하여 100 μg/ml의 농도에서 약 91.4%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과에서 SCEAf가 세포에 독성이 없음을 나타낼 뿐 아니라 자극원인 UVB에 손상된 세포의 생존율을 증가시킴으로써 세포 활성에 도움을 준다고 볼 수 있다.

Fig. 5. Cell viability assay on Human HaCaT cells of Schisandra chinensis seeds. (A) The cells were treated for 24 hr with the indicated concentrations of SCEAf. (B) and treatment with UVB (50 mJ/cm2). Nor: not treated any extract and UVB, Con: only treated UVB, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds, Results are means ± S.D. of triplicate data. Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

HaCaT cell에서의 MMPs 단백질 발현 억제 확인

세포외기질을 분해하는 단백질 분해효소인 MMP group에는 약 20여 종이 있으며, collagen group (MMP-1, -8, -13), gelatinase group (MMP-2, -9), stromelysin group (MMP-3, -10, -11)이 있다[4]. 그 중 MMP-1은 주로 collagen type I과 III형을 분해하는 collagenase이고 특히 UVB에 의해 과발현될 수 있기 때문에 피부 광노화가 유발될 수 있다[3]. MMP-3은 collagen type IV를 특이적으로 분해하고 pro-MMP-1을 활성화시킨다[10]. 본 연구에서는 MMP-1, -3의 발현억제를 확인하였고 결과는 Fig. 6에 나타내었다. UVB 50 mJ/cm2의 자극을 준 세포에 SCEAf를 농도별로 첨가하였을 때 MMP-1과 -3은 농도의존적으로 발현이 매우 효과적으로 억제되었다. 이는 UVB에 자극받은 세포에 SCEAf가 MMP-1과 -3의 단백질 발현을 억제시키므로 collagen type I, III과 IV의 분해를 촉진하는 collagenase의 작용을 저해하여 UVB에 의한 광노화에 효과가 있을 것으로 기대할 수 있다.

Fig. 6. Expression levels of MMP-1 and -3 on UVB-irradiated HaCaT cells from Schisandra chinensis seeds. The cells were treated for 24 hr with the indicated concentrations of extracts before treatment with UVB (50 mJ/cm2) for 24 hr. The results were analyzed by western blot. Nor: not treated any extract and UVB, Con: only treated UVB, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds. Bands are representative of three or four experiments. The percentage indicated the MMP-1 and -3 ratios relative to the β-actin. Means with different letters (a-e) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

HaCaT cell에서의 MMPs의 mRNA 발현억제 확인

자외선은 외인성 피부노화의 주요 인자이다[21]. 즉 자외선에 조사된 사람피부유래 각질형성세포는 MMPs의 양이 증가되어 콜라겐의 합성 감소로 인해 피부노화가 유도된다고 알려져 있다[47]. 이러한 이유로 자외선에 의한 피부노화 예방과 치료를 위해 MMPs의 발현을 억제시키는 천연물에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 우리는 오미자 종자가 MMP-1과 -3의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 HaCaT 세포에 UVB 50 mJ/cm2의 자극을 주고 SCEAf를 다양한 농도로 처치한 후 총 RNA를 추출하였고 RT-PCR을 이용하여 이를 분석하였다. 그 결과 SCEAf가 MMP-1과 -3의 mRNA의 발현을 농도의존적으로 억제하고 있음을 확인하였고(Fig. 7) 이는 앞서 western blot을 통해 확인한 MMP-1과 -3의 단백질 발현의 억제 결과와도 유의할 만한 결과였다. 이러한 결과를 바탕으로 MMPs의 upstream pathway인 mitogen activated protein kinase (MAPK) 경로의 활성화를 억제하는지의 실험을 진행하여 주름억제 분자생물학적 검증을 확인할 예정이다.

Fig. 7. MMPs mRNA expression on UVB-irradiated HaCaT cells from Schisandra chinensis seeds. The cells were treated for 24 hr with the indicated concentrations of extracts before treatment with UVB (50 mJ/cm2) for 24 hr and subjected to RT-PCR using the MMP-1 and -3. Nor: not treated any extract and UVB, Con: only treated UVB, SCEAf: ethyl acetate fraction of Schisandra chinensis seeds. Bands are representative of three experiments. The percentage indicated the MMP-1 and -3 ratios relative to the β-actin. Means with different letters (a-e) above the bars are significantly different by Duncan's multiple range test at p<0.05.

결과 및 고찰

자외선에 의한 피부의 광노화는 피부의 주름 형성에 직접적인 주요 요인으로 언급되고 있으며[21], MMPs는 피부의 표피세포, 섬유아세포, 염증세포 등에서 분비되어 결합조직에 손상을 가져와 피부노화를 일으킨다고 알려져 있다[10]. 본 연구에서는 오미자 종자 분획물들의 항산화 및 주름억제 활성을 살펴보았고 그 결과 분획물 중 SCEAf가 전자공여능, ABTS 라디칼 소거활성능 그리고 hydrogen peroxide 소거활성능에서 가장 우수한 억제 효과를 보였으며, collagenase 저해 활성 실험 결과 또한 SCEAf가 가장 우수한 저해능을 보였다. SCEAf의 세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 실시한 결과, SCEAf가 세포에 독성이 없음을 나타낼 뿐 아니라 자극원인 UVB에 손상된 세포의 생존율을 증가시킴으로써 세포 활성에 도움을 주는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 SCEAf가 UVB에 유도된 HaCaT cell에서 주름형성을 유발하는 세포외기질 분해효소의 발현을 얼마나 저해하는지를 western blot을 통해 확인하였으며 그 결과 MMP-1과 -3의 단백질 발현은 농도의존적으로 억제되었다. 또한 SCEAf에 대한 MMP-1과 -3의 mRNA 발현을 확인하기 위한 RT-PCR를 실시하였으며 MMP-1과 3의 mRNA의 발현 역시 농도의존적으로 억제되었다. 따라서 오미자 종자의 에틸아세테이트 분획물이 항산화 활성뿐 아니라 주름억제 활성에도 우수한 효능이 있음을 확인함에 따라 기능성 식품 및 화장품 분야에서 피부의 노화 예방과 증상 완화에 효과적인 소재로서의 활용가능성을 확인하였다.

감사의 글

본 연구는 산업통상자원부 바이오테라피 산업기반구축사업[N0001805]의 지원에 의해 연구가 수행되었습니다.

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